盐酸环苯扎林和乙酰氯芬酸的液相色谱测定

摘要

建立了一种同时测定原料药和制剂中盐酸环苯扎林和乙酰氯芬酸含量的高效液相色谱方法，并进行了验证。以Luna C18色谱柱(直径250 × 4.6 mm，粒径5 μm)为固定相，甲醇和0.02 M KH2PO4 (75: 25 v/v, pH 3)为流动相。盐酸环苯扎林和乙酰氯芬酸的Rt分别为4.2和9 min。在280 nm的吸收模式下进行分析。线性回归分析结果表明，盐酸环苯扎林与乙酰氯芬酸在0.01 ~ 20 μg/ml和0.1 ~ 40 μg/ml范围内呈良好的线性关系，相关系数分别为0.9990和0.9990。盐酸环苯扎林和乙酰氯芬酸的LOQ分别为0.01和0.1 μg/ml。根据ICH指南对该方法进行了验证，结果表明该方法准确、精密度高、鲁棒性好。成功分析了上市配方。

关键字

盐酸环苯扎林(CBP)，乙酰氯芬酸(ACF)，液相色谱法，验证

简介

盐酸环苯扎林化学名称为3-(5h -二苯并[a,d]环庚-5-亚烯)- N,N-二甲基-1-丙胺[2，3.］．CBP被用作休息和物理治疗的辅助治疗，以缓解与急性疼痛的肌肉骨骼疾病有关的肌肉痉挛[4］．Aceclofenac;2-[2-[2-[(2,6-二氯苯基)氨基]苯基]乙酰]氧乙酸[1］．用于缓解类风湿性关节炎、骨关节炎的疼痛和炎症。5，6］．文献调查显示，目前还没有相关的反相高效液相色谱法。本文介绍了一种简便、准确、精确的同时测定复方片剂中CBP和ACF的方法。所提出的方法根据国际协调会议(ICH)准则进行了优化和验证[7］．在本工作中，已成功地尝试用反相高效液相色谱法同时估计这两种药物。

材料与方法

仪器

仪器采用美国Perkin Elmer系列200,Phenomenex Luna C18色谱柱(250 x 4.6 mm id, 5μm粒度)进行分析方法开发。采用Totalchrom navigator HPLC version 6.3.1软件对色谱数据进行处理。

材料

FLEXABENZE PLUS(15毫克CBP和200毫克ACF)由孟买Macleods制药有限公司生产。所有使用的化学品和试剂均为AR级。

试剂

所有使用的化学品均为AR级。

分析波长的选择

采用紫外检测的高效液相色谱法的灵敏度取决于检测波长的选择。理想的波长是对待检测药物有良好反应的波长。两种药物的叠加紫外光谱显示，CBP和ACF在280 nm处吸收明显，因此在该波长进行检测(图1)．

流动相的制备

称取2.72 gm KH2PO4，溶于1000 ml HPLC水中，制备0.02 M KH2PO4缓冲液。流动相由750 ml甲醇和250 ml 0.02 M KH2PO4混合制备。使用邻磷酸(1%)将pH调整为3。用Whatman滤纸(41号)过滤，声波10分钟，作为流动相。

标准原液的制备

准确称量CBP(10毫克)和ACF(10毫克)，并转移到两个单独的10毫升容量瓶中，溶解在几毫升甲醇中。用甲醇使体积达到标记，得到分别含有1000 μg/ml CBP和1000 μg/ml ACF的溶液。从上述溶液中取适量等分液，流动相稀释，分别得到100 μg/ml CBP和100 μg/ml ACF。

色谱条件

Phenomenex®C-18 (250 x 4.6 mm id)色谱柱与流动相甲醇:0.02 M KH2PO4 (75:25， % v/v)平衡。pH值3用邻磷酸(1%)调整。流动相流速保持在1 ml/min，流出物监测在280 nm。样品以20 μL固定回路进样，总运行时间为12 min。

CBP和ACF校准曲线

取适量的CBP和ACF原液于相同的10ml容量瓶中。将体积调至流动相标记处，得到CBP的终浓度分别为0.01、0.1、1、5、10、20 μg/ml, ACF的终浓度分别为0.1、0.5、2、10、20、40μg/ml。

验证参数

线性和范围

CBP在0.01 ~ 20 μg/ml范围内呈线性关系，相关系数为0.9990。ACF在0.1 ~ 40 μg/ml范围内呈良好的线性关系，回归系数为0.9990。对校准曲线进行了回归分析表格2而且3.．

精度

盘中精度

通过每天3次测量3种浓度的反应来进行日内研究。日内CBP和ACF的% RSD值分别为0.49 ~ 1.02和0.51 ~ 0.93。这些%RSD值均小于±2.0，表明该方法是精确的(表格4＆5)．

可重复性

重复性研究通过测量每天6次单一浓度的反应进行。CBP和ACF重复性的% RSD值分别为0.54和0.80 (表6)．RSD值均小于±1.0，表明方法准确。

精度

采用标准加法法计算CBP和ACF的回收率，确定了方法的准确性。CBP和ACF的加样回收率分别为99.57 - 101.10%和99.78 - 101.81% (表7)．

检测极限和定量极限

LOD是可检测但不能定量的分析物的最低量。色谱直观观察，CBP和ACF的检出限分别为0.003 μg/ml和0.03 μg/ml。LOQ是可检测和定量的分析物的最低量。定量限分别为0.01、0.1 μg/ml。上述数据表明，两种药物的微克量均可准确测定。

鲁棒性

通过改变流动相组成、pH值和流速(表8)．结果无明显变化，表明该方法具有鲁棒性。

特异性

通过制备含药物和辅料的合成混合物，对微晶纤维素、乳糖、硬脂酸镁等辅料的干扰进行了特异性研究。进行特异性研究，以检查辅料的干扰。两种药物加样回收率均在98%以上。特异性研究的结果见表9．

溶液的稳定性

在室温下测定CBP和ACF标准溶液和样品溶液的稳定性。两种药物均稳定，回收率均超过98% (表10)．

系统适宜性参数

进行了系统适用性测试，结果总结在表11．

验证参数总结在表12．

上市配方分析

采用该方法对已上市配方进行分析，CBP和ACF的回收率分别为99.49%和110.01%。在CBP和ACF色谱图中观察到Rt分别为4.2 min和9.0 min，并且未观察到来自已上市片剂配方中辅料的干扰(表13)．

结论

建立了测定CBP和ACF的高效液相色谱法。根据ICH Q2 (R1)指南对所提出的方法进行了准确性、精密度、线性度、特异性和鲁棒性验证。该方法已成功应用于已上市的配方中。

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