药学与药学研究与评论“雷竞技苹果下载，
菜单e-ISSN:2320-1215 p-ISSN: 2322-0112
e-ISSN:2320-1215 p-ISSN: 2322-0112
伍Ghosh1雷吉娜·利希蒂·宾兹2, Ratan Sadhukhan2， Asitikantha Sarma3.，苏布拉塔·库马尔·戴伊4,马丁Hauer-Jensen2鲁帕克·帕塔克2＊
3.大学间加速器中心(IUAC)， Aruna Asaf Ali Marg，印度新德里
4西孟加拉邦毛拉·阿布·卡拉姆·阿扎德理工大学生物技术与生物科学学院生物技术系(前身为西孟加拉邦理工大学)BF-142，西孟加拉邦加尔各答一区盐湖城
收到日期:02/04/2018;接受日期:08/05/2018;发表日期:14/05/2018
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主要挑战是根除癌症是对化疗和/或放疗产生耐药性。最近的研究表明，粒子辐射或高let(线性能量转移)辐射比低let γ或x射线更有效地杀死癌细胞，可能是通过诱导复合物染色体畸变(CAs)。然而，各种高let辐射诱导染色体损伤的功效尚未得到充分研究，特别是在对化疗药物和电离辐射都有抗性的细胞中。为了解决这个问题，我们将来自中国仓鼠肺成纤维细胞V79细胞的抗化学辐射细胞株M5暴露于12C -和16使用粒子加速器的o束。采用Giemsa染色技术对两种不同照射时间(24 h和48 h)的像差频率进行评分。ca在24小时和48小时后呈线性剂量依赖增加12C-irradiation。之后也观察到类似的线性剂量反应16o照射24小时，而48小时没有。此外，辐射质量和辐照后孵育时间的差异引起像差谱的差异。剂量-反应曲线显示12c束诱导的ca比16O-beam。这些数据清楚地表明，染色体损伤的程度和范围取决于高let辐射的质量以及辐照后的孵育时间。这些发现可能在强子治疗(高let放射治疗)中选择束参数，特别是根除化学放射耐药方面有潜在的应用价值肿瘤．
线性能量转移，染色体畸变，相对生物效能，抗辐射，抗化疗，放射治疗。
对化疗药物和/或治疗药物耐药辐射仍然是癌症治疗的主要障碍。化疗耐药可通过增加药物失活和/或外排而增强DNA修复抑制细胞死亡，促进上皮-间充质转化(EMT) [1]。另一方面，由于EMT，低let光子(X射线和伽玛射线)的常规放射治疗可能会产生抗放射的癌症干细胞[2]。因此，开发一种替代治疗策略是必要的，以有效地杀死肿瘤细胞，特别是那些已经发展出化疗-放射耐药的肿瘤细胞。
相对于低let光子，粒子辐射或高let辐射因其较高的相对生物效能(RBE)而更能有效杀伤细胞[3.]。粒子辐射较高的RBE被认为是多种因素的结果，例如:1)单位距离沉积更多的能量，2)产生不可修复的DNA损伤，3)形成复杂的染色体畸变(CAs)，以及4)与细胞周期阶段或细胞氧含量无关的类似细胞杀伤效率[4]。此外，与低let辐射相比，高let辐射更精确地沉积能量，从而显著降低正常组织的风险毒性肿瘤周围[4]。所有这些有益的特性都表明，在癌症治疗中，与γ射线或x射线相比，高let辐射可能是更好的选择。然而,首先需要确定质量的各种high-LET辐射影响基因毒性。
电离辐射(IR)通过诱导DNA双链断裂(dsb)发挥遗传毒性作用。dsb不恰当的重新连接导致ca，随后可能导致诱导细胞凋亡［5]。我们证明了暴露于IR后，细胞死亡与CAs/凋亡水平之间存在很强的相关性[6-8]。重要的是，DNA损伤的性质取决于辐射的质量，影响着ca的光谱、产量和复杂性。例如，与低let辐射相反，高let辐射产生“密集”电离事件，导致“聚集”DNA损伤[9]。这些聚集性损伤更容易诱发复杂ca。然而，没有研究确定各种高let辐射对ca的影响。
在这篇文章中，我们检查了M5细胞中ca的光谱，a化疗药物(甲氨蝶呤)及抗γ射线细胞株[10，11]，在暴露于不同剂量的12c型钢(让= 295 keV /μm)16o型束流(LET = 625 keV/ μm)在不同时间间隔的研究。我们观察到ca的频率和模式取决于辐射质量和辐照后时间。
细胞系和细胞培养
本研究采用M5细胞株。M5的起源和特征已在前面作过描述[10，11]。细胞在Eagle MEM培养基中培养(HiMedia，印度);补充10%热灭活膜灭菌胎牛血清(以色列生物工业公司)和1%抗生素庆大霉素(罗氏诊断公司)。
辐照
辐照程序已在别处有所描述[8]。简而言之，辐射暴露前20小时，0.6 × 106细胞在每个特制的类似于培养皿的结构中播种，该结构由直径为24毫米的钢环和6 μ厚的聚丙烯片组成。将融合细胞单层暴露于12C -和16在国际大学加速器中心(印度新德里)，使用15UD Pelletron加速器，如前所述[8]。细胞暴露于不同剂量的12c束(0、1.18、2.36和4.73 Gy)和16o束(0,2.46,4.91,9.83 Gy)，对应相同的粒子通量(0,1 × 10)6， 5 × 106， 1 × 107粒子/ cm2)。光束能量是用蒙特卡罗代码TRIM计算的。用装有准直器的表面阻挡探测器(孔径面积0.886 mm)测量光束的均匀性2)．照射后，细胞立即进行短暂胰蛋白酶化，恢复正常组织培养培养皿，在收获前孵育24小时和48小时。
剂量测定法
剂量学已在先前的文献中有所描述[7]。简而言之，一个硅表面势垒探测器被用来计算粒子的数量，也用来测量束流能量。根据探测器数量与准直器孔径面积的关系计算了影响。剂量(Gy)由以下量的通量计算:
剂量[格雷]= 1.6 X 10−9X (dE / dx) [keV / μm] X F [p / cm2X 1/ ρ [cm。3./通用)
其中dE/dx = LET， ρ =阻挡物质的密度(在这种情况下，细胞被认为是水当量，因此ρ值为1)，F =粒子通量。
中期染色体的制备、染色及评分技术
在中期染色体被捕2 h秋水仙胺治疗(0.1μg / mL)。然后将细胞胰蛋白酶化，PBS洗涤两次，低渗溶液(0.56% KCl, 37°C, 20分钟)，甲醇:醋酸(3:1)固定液固定。最后，将细胞悬浮液滴到冷却的、预先清洗过的玻璃载玻片上。将载玻片在4%吉姆沙PBS (pH 7.0)中染色。在1000倍放大下对100个中期扩散进行评分。对中期扩散进行染色体型畸变分析，包括染色体型断裂、双分钟、双中心、环和染色单体型畸变，包括染色单体型断裂和染色单体型交换。对环状染色体和双中心染色体作了特别的考虑。例如，当一个双中心或环形染色体被标记时，从细胞中发现的片段数量中减去一个无中心的片段。
统计分析
除了48小时后16所有ca数据均拟合成线性方程(Y = αD)。频率上的标准误差由√a/ a计算，其中“a”是考虑的数量，“a”是分析的细胞总数[12]。
染色体畸变的剂量-反应关系
图1显示不同类型结构像差的代表性显微照片。不同结构像差谱如图所示表1．我们观察到，暴露于这两种物质后，各种类型的结构ca的剂量依赖性增加12C -和16O-beams。
| 12c型钢 | 的敏感性 | 影响 (粒子/厘米2) |
剂量 (Gy) |
Chromatid-type 畸变 |
Chromosome-type 像差 |
总计 | ||||
| 施 | Cte | Csb | 迪拜国际资本 | Dimn | 环 | |||||
| 24小时 | 0 | 0 | 0.00±0.00 | 0.03±0.02 | 0.03±0.02 | 0.00±0.00 | 0.00±0.00 | 0.00±0.00 | 0.06±0.02 | |
| 0 | 3. | 3. | 0 | 0 | 0 | 6 | ||||
| 1 × 106 | 1.18 | 0.02±0.01 | 0.09±0.03 | 0.18±0.04 | 0.10±0.03 | 0.11±0.03 | 0.00±0.00 | 0.50±0.07 | ||
| 2 | 9 | 18 | 10 | 11 | 0 | 50 | ||||
| 5 × 106 | 2.36 | 0.07±0.03 | 0.16±0.04 | 0.35±0.06 | 0.17±0.04 | 0.19±0.04 | 0.02±0.01 | 0.96±0.10 | ||
| 7 | 16 | 35 | 17 | 19 | 2 | 96 | ||||
| 1 × 107 | 4.73 | 0.15±0.04 | 0.21±0.05 | 0.52±0.07 | 0.23±0.05 | 0.62±0.08 | 0.05±0.02 | 1.78±0.13 | ||
| 15 | 21 | 52 | 23 | 62 | 5 | 178 | ||||
| 48小时 | 0 | 0 | 0.02±0.01-2 | 0.00±0.00 | 0.01±0.01-1 | 0.00±0.000 | 0.00±0.00 | 0.00±0.00 | 0.03±0.02 | |
| 0 | 0 | 0 | 3. | |||||||
| 1 × 106 | 1.18 | 0.02±0.01-2 | 0.04±0.02 | 0.04±0.02-4 | 0.05±0.02-5 | 0.05±0.02 | 0.01±0.01 | 0.21±0.05 | ||
| 4 | 5 | 1 | 21 | |||||||
| 5 × 106 | 2.36 | 0.08±0.03-8 | 0.08±0.03-8 | 0.02±0.01-2 | 0.08±0.03 | 0.20±0.04 | 0.02±0.01 | 0.48±0.07 | ||
| 8 | 8 | 2 | 8 | 20. | 2 | 48 | ||||
| 1 × 107 | 4.73 | 0.08±0.03 | 0.12±0.03 | 0.03±0.02 | 0.12±0.03 | 0.44±0.07 | 0.03±0.02 | 0.82±0.09 | ||
| 8 | 12 | 3. | 12 | 44 | 3. | 82 | ||||
| 16O-beam | 24小时 | 0 | 0 | 0.01±0.01 | 0.00±0.00 | 0.03±0.02 | 0.00±0.00 | 0.00±0.00 | 0.00±0.00 | 0.04±0.02 |
| 1 | 0 | 3. | 0 | 0 | 0 | 4 | ||||
| 1 × 106 | 2.46 | 0.05±0.02 | 0.18±0.04 | 0.23±0.05 | 0.21±0.05 | 0.26±0.05 | 0.02±0.01 | 0.95±0.10 | ||
| 5 | 18 | 23 | 21 | 26 | 2 | 95 | ||||
| 5 × 106 | 4.91 | 0.12±0.03 | 0.31±0.06 | 0.33±0.06 | 0.40±0.06 | 0.38±0.06 | 0.04±0.02 | 1.58±0.13 | ||
| 12 | 31 | 33 | 40 | 38 | 4 | 158 | ||||
| 1 × 107 | 9.83 | 0.17±0.04 | 0.60±0.08 | 0.46±0.07 | 0.77±0.09 | 0.78±0.09 | 0.02±0.01 | 2.80±0.17 | ||
| 17 | 60 | 46 | 77 | 78 | 2 | 280 | ||||
| 48小时 | 0 | 0 | 0.00±0.00 | 0.00±0.00 | 0.01±0.01 | 0.00±0.00 | 0.00±0.00 | 0.00±0.00 | 0.01±0.01 | |
| 0 | 0 | 1 | 0 | 0 | 0 | 1 | ||||
| 1 × 106 | 2.46 | 0.07±0.03 | 0.11±0.03 | 0.04±0.02 | 0.04±0.02 | 0.13±0.04 | 0.01±0.01 | 0.40±0.06 | ||
| 7 | 11 | 4 | 4 | 13 | 1 | 40 | ||||
| 5 × 106 | 4.91 | 0.09±0.03 | 0.17±0.04 | 0.05±0.02 | 0.11±0.03 | 0.27±0.05 | 0.02±0.01 | 0.71±0.08 | ||
| 9 | 17 | 5 | 11 | 27 | 2 | 71 | ||||
| 1 × 107 | 9.83 | 0.06±0.02 | 0.07±0.03 | 0.03±0.02 | 0.05±0.02 | 0.24±0.05 | 0.01±0.01 | 0.46±0.07 | ||
| 6 | 7 | 3. | 5 | 24 | 1 | 46 | ||||
图1:M5细胞中期扩散的代表性显微照片。图A:显示正常中期扩散，22条染色体。面板B:显示箭头所示的染色单体型断裂。图C:表示染色单体型交换(箭头表示)和染色体型断裂(箭头表示)。图D:显示箭头所示的双中心染色体。图E:环状染色体(箭头所示)。图F:显示双分钟染色体(箭头表示)。
图2显示24 h和48 h总ca的剂量响应曲线。在24 h，两种辐射类型的总ca频率与辐射剂量呈线性相关，但在12C-irradiated细胞。在中观察到总ca的类似剂量依赖性线性增加12c照射M5细胞48小时后16o辐照后，总ca频率无线性增加;照射9.83 Gy后，总像差频率急剧下降(图1)．48 h时，总ca的剂量-反应曲线显示12c -束比同剂量的16O-beam (图1而且表1)．
图2:M5细胞染色体畸变的剂量-反应曲线。图A和B分别显示12C-和16o束照射24小时和48小时后M5细胞总染色体畸变的频率。
ca的时间动力学
两种辐射类型的像差频率随着孵育时间的延长而显著降低表1．例如，我们观察到，与暴露于4.73 Gy的环境中24 h的M5细胞相比，48 h时总ca减少了约54%和84%12c束和9.83 Gy的16o型梁，分别(表1)．
畸变频谱
分析不同照射后时间的像差谱显示，两种辐射类型的染色体型像差频率均远高于染色单体型像差(表1)．例如，照射4.73 Gy后24 h总染色体型畸变的频率约为染色单体型畸变的3.9倍和2.6倍12c束和9.83 Gy的16分别O-beam。有趣的是，24 h时染色体型断裂的频率高于双中心12c辐照的细胞，而更多的双中心比染色体型断裂暴露在细胞16O-beam (表1)．
ca的定量是更好地理解高let辐射的放射生物学效应的重要参数。高LET辐射诱导的复合dsb直接影响细胞修复和增殖动力学[9]。我们证明了高let 7Li-，12C -,16o束能比60Co更有效地杀伤耐化学辐射M5细胞伽马射线细胞死亡与ca的频率密切相关[6-8]。因此，比较研究各种高let辐射照射后的ca，将有助于了解辐射的物理性质如何影响染色体的结构异常。这些知识对于制定治疗计划至关重要。
总的来说，目前的研究表明12c -束在24小时和48小时引起总ca的线性剂量依赖增加16在48 h时，总ca的频率在4.91 Gy时呈线性增加，之后在9.83 Gy时急剧下降16O-irradiation。这种下降可能是由于从种群中消除了严重受损的细胞。当V79细胞暴露于9.83 Gy的剂量时，我们观察到类似的下降16O-beam [8]。剂量-反应曲线斜率分别为0.38±0.01和0.29±0.0112C -和16O-beam在24 h,分别标明12c -束对染色体的损伤比16O-beam。这些数据表明LET值相对较低的粒子辐射可能引起更多的染色体损伤。这验证了Tenhumberg等人之前的发现。13，他注意到12LET值相对较低的c离子(153.3 keV/μm)比ni离子(2455 keV/μm)更能诱导人成纤维细胞的细胞遗传损伤[13]。由此可见，LET值与畸变率之间存在很强的相关性。
我们还注意到M5细胞的总ca随着辐照后孵育时间的增加而大幅下降，这证实了我们之前对V79细胞的观察[8]。然而，下降的速度取决于畸变类型。例如，染色单体型断裂的下降幅度远远小于染色体型断裂。在4.73 Gy的12Cbeam照射48小时后，观察到染色细胞断裂和染色体断裂分别减少了约46%和94%。9.83 Gy后也有类似趋势16O-irradiation。有趣的是，在24小时，12c束比二心束诱导更多染色体型断裂16o照射则呈现完全相反的趋势。两种辐射类型的染色单体型交换频率均显著高于染色单体型断裂频率。24 h后，染色单体型交换与染色单体断裂的比率显著升高16阿比12C-irradiation。这些数据表明，辐射质量对像差谱有很大影响。
这两个12C -和16o束诱导的染色体型畸变多于染色单体型畸变，提示融合的M5细胞在照射时处于G1期。这可能是由于接触抑制细胞增殖。雷竞技网页版G0/ G1期细胞的照射也被认为有利于染色体型畸变[14]。有趣的是，我们观察到染色体和染色单体型畸变在相同的中期扩散，这与一般的看法相反，这表明这些染色单体型畸变是在dna合成前阶段诱导的。这可能是高let辐射诱导G1细胞碱基不稳定位点或单链DNA断裂的结果;由于大量的单链断裂仍然是“未修复的病变”，并导致染色单体型畸变的形成。Ritter等人也报道了在G1期暴露于高LET ar离子(LET = 1840 keV/μm)的V79细胞的相同中期扩散中染色体和染色单体型畸变的存在[15]。与低let γ射线或x射线不同，高let辐射后染色体和染色细胞型畸变的存在，预计会增加整体畸变负担，导致细胞周期扰动和有丝分裂延迟，并最终增强有丝分裂死亡。
对化疗药物和放疗的耐药性是癌症治疗成功的主要限制因素。甲氨蝶呤仍被用于治疗某些类型的人类恶性肿瘤，放疗被用于治疗一半的癌症患者，这可能会使肿瘤细胞最终产生耐药性治疗．使用甲氨蝶呤+抗辐射细胞系(M5)，目前的研究清楚地表明，高let辐射的质量以时间依赖的方式决定染色体损伤的程度和频谱12c束诱导ca比c束诱导ca更有效16O-beam。这些发现将有助于设计高let放射治疗癌症患者的策略。
本研究由阿肯色大学医药科学学院种子基金支持;教资会资助大学计划(印度新德里);美国国家卫生研究院(P20 GM109005) [MH-J]。这些机构在研究设计、数据分析或本手稿的准备中没有任何作用。资深作者(RP)感谢N.P. Bhattacharyya教授，C&MB分部，萨哈核物理研究所，盐湖，加尔各答700064，慷慨地提供M5细胞株，也感谢Inter大学加速器中心(新德里，印度)Pelletron小组的所有成员在高let辐照期间的真诚帮助。
