研究与评论:生物学研究雷竞技苹果下载杂志
菜单ISSN: 2322 - 0066
ISSN: 2322 - 0066
Priyadarshini N. Canning＊
再生科学与工程系，器官与组织重建实验室，53 Shogoin kawhara - cho, Sakyo-Ku，京都，日本
收到日期:26/09/2020;接受日期:12/10/2020;发表日期:19/10/2020
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摘要目的:观察碱性成纤维细胞生长因子和胶质细胞系来源的神经营养因子对体外2D和3D培养的影响，以确定不同剂量的生长因子处理后胰腺β细胞球的细胞存活率、细胞增殖和胰岛素分泌功能。
设计:用三种不同剂量的FGF-2 (10,100,1000ng/mL)和GDNF (100,200,400 ng/mL)处理单层培养和球形培养的betaTC-6细胞。采用细胞WST-8法测定两种培养模型中β细胞的增殖和存活率。采用胰岛素ELISA法测定体外胰岛素分泌功能。
结果:在2D培养上获得的结果与在3D培养上获得的结果有显著差异。当添加10 ng/mL FGF-2时，500和1000个细胞/球体的细胞增殖得到改善。然而，相同剂量的FGF-2对2D500和2D1000培养物显示出细胞毒性作用。用GDNF处理的S500球体在所有剂量的GDNF下均表现出较高的细胞增殖。2D500培养在100和400 ng/mL时细胞增殖略有改善，但在200 ng/mL GDNF时没有任何改善。
结论:近年来，3D培养模型在药物发现和药物开发等研究中越来越受欢迎，因为它们能够相当准确地模拟体内环境。这项研究表明，与2D培养模型相比，3D培养模型可以更好地预测生长因子在体内的反应。
Β细胞球状体;碱性成纤维细胞生长因子;胶质细胞系来源的神经营养因子
药物发现和新药开发是一个昂贵而复杂的过程。导致药物失败的主要原因是临床前试验方法不准确和所选择的体外模型效率低。所选模型和方法的数据生成不足和可预测性差，导致药物开发过程在临床前晚期阶段终止。在临床前试验和体外模型中使用新技术可以通过产生足够准确的数据来提高药物开发过程的成功率[1-3.］．
细胞分析是药物发现和开发过程中的无敌工具。虽然传统的2D细胞培养主要用于HTS，但3D细胞培养技术在药物发现中的应用正取得快速进展。3.D cultures have been used in different stages of drug discovery including disease modeling, target identification, validation, drug screening, potency profiling, target selection and toxicity assessment.The most effective cell-based assays with 3D cultures are cell viability, cell proliferation, signaling and migration.Different growth factors and their receptors play vital roles in the pathogenesis of pancreatitis. Studies on embryonic systems show evidence of the beneficial roles of basic fibroblast growth factor (bFGF or FGF2) in pancreatic development [4，5bFGF是一种在人胰腺癌中显著过表达的FGF家族成员[6，7］．它与包含细胞内酪氨酸激酶结构域的跨膜受体结合[8-12］．胶质细胞产生的胶质细胞系衍生神经营养因子(GDNF)在肠神经系统的发育中发挥重要作用[13，14］．
胰腺细胞与神经元细胞有一些共同的生物学特征，包括神经元转录因子的表达[14-16一些研究将GDNF与β细胞的存活及其功能的维持联系起来。据报道，胰岛损伤后，GDNF在胰岛β细胞附近表达增加，这表明GDNF参与了胰岛的生存和修复[17-21］．大多数关于细胞和组织调节的研究都依赖于在二维(2D)细胞培养模型中生长的细胞的分析，这些模型无法重建细胞在活的有机体内细胞微环境;这些2D培养物通常无法维持其分化的功能[22］．为了充分理解组织的形成和功能，以及它们的病理生理学，研究细胞和组织如何作为由多种紧密对立的组织类型组成的整个活器官的一部分是至关重要的，这些组织类型在其三维(3D)结构、力学特性和生化微环境方面具有高度动态和可变。虽然制定了一个标准，简化了，在体外适合生物和病理研究和药物发现的3D模型可能还不可行，单个组织或器官的标准化模型是可能的[20.-24］．本研究旨在探讨bFGF和GDNF对胰腺β细胞存活率%、增殖及胰岛素分泌功能的影响在体外，将单层(2D)培养模型与三维培养模型的结果进行比较。本研究还揭示了三维培养模型在准确预测肿瘤的有效性在活的有机体内对生长因子的反应。
细胞培养的制备
β-TC-6细胞系购自American Type Culture Collection (ATCC)。在处理过的组织培养皿(100 × 20 mm;美国康宁公司)。细胞在Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM，高葡萄糖;Wako，批次TWF 7025)补充15%胎牛血清(Gibco by Life Technologies，批次1927414)，1% glutaMAX-I (100X;Gibco)， 1%丙酮酸钠(100X;Gibco)和1%抗生素(100X;Gibco，批号1924801)，以下称为“补充DMEM”。培养物保存在37°C、5% CO的加湿培养箱中2．每2天更换一次培养基。当细胞达到80% ~ 90%合流时，进行传代培养。
球状体的制备
当细胞达到80%-90%合流时(图1)．用血细胞计计算活细胞的数量。根据“附录”中解释的公式，制备球状体(S500、S1000、S2000和S4000)所需的细胞悬液的体积已经准备好。为了获得不同尺寸的球体，我们分别为S500、S1000、S2000和S4000在96个MP设备的每个孔中植入500、1000、2000和4000个细胞。然后，细胞在96mp设备中播种，如图所示图2 - 5并置于96孔板(Falcon，组织培养处理，平底，低蒸发盖)中，根据所述板设计获得3D培养样品图6．播种后，将96孔板放在双振动筛上，转速为100-120转10分钟。然后将板放在37°C的加湿培养箱中，温度为5% CO2．在播种细胞三天后，就得到了具有所需细胞数量的球体。
图1:基本FGF处理样品。
图2:基本FGF处理样品。
图3:基本FGF处理样品。
图4:基本FGF处理样品。
图5:GDNF处理过的样品。
图6:GDNF处理过的样品。
基本FGF处理样品
S500 0=由500个细胞组成的球体，每个球体播种，不添加基本FGF。
S500 10=用10 ng/ml碱性FGF处理的S500。
S500 100=用100 ng/ml碱性FGF处理的S500。
S500 1000=用1000 ng/ml碱性FGF处理的S500。
2D500 0=500细胞，形成单层培养，不添加基础FGF。
2D500 10=用10 ng/ml碱性FGF处理的2D500。
2D500 100=用100 ng/ml碱性FGF处理的2D500。
2D500 1000=用1000ng /ml碱性FGF处理的2D500。
经GDNF处理的样本(图5 - 8）
图7:GDNF处理过的样品。
图8:GDNF处理过的样品。
S =球体
2d =单层培养
500 1000 2000 4000都不是。细胞的种子。
测试的GDNF剂量为0、100、200、400 ng/ml。
2D培养样品的制备
对于2D培养样品的制备，除了一个步骤，即根据所选择的板设计，将细胞在没有MP设备的情况下直接播种到96孔板中，其余步骤与制备球体的步骤相同。各组分别为2D500、2D1000、2D2000和2D4000。
bFGF治疗
bFGF(重组人碱性fgf) (154 a.a.)(目录# 100-18B，批次# 041808)购自Peprotech(美国)。根据制造商的说明进行了重组。在球体形成的第3天，收集球体，在22-23°C下，以10 Xg离心1分钟。小心地丢弃上清液。用新鲜的完全培养基和相应剂量的待测bFGF轻轻地重悬球体。然后，将球体添加到各自的96孔板中，并在5% CO的37°C的加湿培养箱中保存2对于2D培养，根据平板设计，将培养基替换为含有相应剂量bFGF的新鲜完整培养基，并在5% CO中37℃的加湿培养箱中培养224小时。
GDNF治疗
重组人GDNF(目录#450-10，批号#0606B64)购自Peprotech公司。根据制造商的说明进行了重组。在球体形成的第3天，收集球体，在10 Xg和22-23°C下离心1分钟。小心地丢弃上清。用新鲜的完全培养基和相应剂量的待测GDNF轻轻地重悬球体。然后，将球体添加到各自的96孔板中，并在5% CO的37°C的加湿培养箱中保存2对于2D培养，将培养基替换为根据平板设计含有相应剂量GDNF的新鲜完全培养基，并在37°C的5% CO的加湿培养箱中培养224小时。
细胞活力测定
CCK-8 (WST-8)的检测灵敏度高于其他四唑盐如MTT、XTT、MTS或WST-1。因此，我们使用CCK-8进行细胞活力测定。根据制造商的方案，将培养基替换为含有CCK-8试剂(Dojindo Molecular Technologies)的新鲜完整培养基。培养板孵育1小时，用Bio-Rad微孔板阅读器使用微孔板管理软件version 6在450nm波长下读取吸光度。应用100 μL的路径长度校正，并逐级读取。4 h后读取吸光度。由于WST-8甲醛是水溶性的，它不会像MTT那样形成晶体。因此，在CCK-8溶液孵育4小时后，450nm光密度(OD)的测量与活细胞数量相关[24］．细胞存活率(%)按以下公式计算:
存活率(%)=[样品−Ab] / (Ac - Ab) × 100样品=样品吸光度
Ab=空白吸光度
Ac=阴性对照的吸光度。
在体外胰岛素分泌的2D培养
将2D培养物(2D500, 2D1000)接种到24孔板上，并在37℃、5% CO的加湿培养箱中保存2．当细胞达到80%-90%合流后，用无葡萄糖Krebs/HEPES Ringer溶液[115 mMNaCl, 24 mM NaHCO3.， 5mmkcl, 1mm MgCl2， 2.5 mM CaCl2， 25 mM HEPES (pH 7.4)] 3次，用不含葡萄糖的Krebs/HEPES Ringer溶液在37℃下孵育30分钟。然后，细胞在含有1mg /mL牛血清白蛋白和葡萄糖(正常、低血糖和高血糖条件)的Krebs/HEPES Ringer溶液中孵育1小时。收集100 μL上清液用于ELISA。用小鼠胰岛素酶联免疫吸附测定试剂盒(Mercodia mouse insulin ELISA kit, 10-1247-01, Lot no. 1)检测胰岛素的释放量。27936)。结果以皮摩尔表示为至少两个独立实验的均值±SEM (图7 - 10)．
图9:在基本FGF处理的样品中，这是比较2d和3d培养的存活率。
图10:在GDNF处理过的样品中，存活率是这样的。
在体外从球状体分泌胰岛素
收集球体，将20±2个球体放置在24孔板中并允许附着。然后，用不含葡萄糖的Krebs/HEPES Ringer溶液洗涤三次，并在37°C下用不含葡萄糖的Krebs/HEPES Ringer溶液预孵育30分钟。接下来，在含有1mg /mL牛血清白蛋白和葡萄糖(3.37和16.7 mM)的Krebs/HEPES Ringer溶液中孵育1小时。收集上清液用于ELISA。采用Mercodia小鼠胰岛素ELISA试剂盒检测胰岛素释放量。结果用皮摩尔表示为至少两个独立实验的均值±SEM。
统计分析
所有数据均以均数±SEM表示。采用单因素方差分析(One-way ANOVA)检验统计学意义。P<0.05为差异显著。
当10 ng/mL bFGF处理时，500和1000个/球的细胞增殖得到改善。然而，相同剂量的bFGF对2D500和2D1000培养物(即，单层培养物以500个细胞/孔和1000个细胞/孔在96孔板上播种)显示出细胞毒性作用。高剂量bFGF(100和1000 ng/mL)对S500球状体有细胞毒作用，但对S1000球状体有促进细胞增殖的作用。用10 ng/mL bFGF处理S500和S1000组细胞存活率(%)较高。用1000ng /mL bFGF处理的S1000组细胞存活率高于2D培养。不同剂量bFGF治疗的S500、S1000、2D500和2D1000组胰岛素分泌功能维持不变，与未治疗组无显著差异或差异很小。以1000 ng/mL bFGF处理S2000组细胞增殖率最高。在1000ng /mL bFGF作用下，S4000细胞增殖率较高。用1000ng /mL bFGF处理2D4000细胞增殖率更高。各组胰岛素分泌功能均正常，但胰岛素分泌未见明显增加。 This indicates that bFGF significantly contributes toward cell viability, cell proliferation, and cell survival in β-cell spheroids but does not play a significant role in the insulin secretion function of β-cell spheroids.
用GDNF处理的S500球体在所有剂量的GDNF下均表现出较高的细胞增殖。2D500培养在100和400 ng/mL时细胞增殖略有改善，但在200 ng/mL GDNF时细胞增殖没有任何显著改善。S1000组在GDNF浓度为100 ng/mL时增殖能力最强。2D1000培养组在100 ng/mL时增殖率最高。在S2000和S4000组中，100 ng/mL的GDNF处理显示出最大的增殖。然而，用任何剂量GDNF治疗的2D2000和2D4000组均未观察到明显的增殖。GDNF浓度为100 ng/mL时，球形组细胞存活率最高，2D培养组细胞存活率未见明显改善。使用GDNF治疗的S500组胰岛素分泌没有改善，但S1000组在低血糖、正常血糖和高血糖情况下维持了胰岛素分泌功能在体外．各组胰岛素分泌功能均未见明显升高。2D培养组胰岛素分泌高于球形培养组。
2D培养模型的优势在于其低成本的维护和功能测试性能。但缺点也是多种多样的。众所周知，细胞与细胞之间的相互作用和细胞与细胞外的相互作用在二维模型中不能准确地表示，这些相互作用对于细胞分化、增殖、生存能力、药物代谢和对刺激的反应至关重要。
当从起源源分离出来并转移到二维环境中时，细胞形态发生改变，细胞分裂的模式也发生改变。多样性的表型缺失。这些变化影响功能，细胞内结构的组织，分泌和细胞信号。极性的丧失改变了这些细胞对细胞凋亡等现象的反应。此外，单层细胞无限地暴露在介质的成分中。虽然在活的有机体内，组织以这种方式接触营养物质的可能性最小。建立3D模型的概念是为了在多细胞三维结构中培养来自供体组织的细胞，这将更准确地模仿亲代组织的结构。该模型保证了改善细胞与细胞以及细胞与细胞外环境的相互作用。形态、极性和细胞拓扑在这样的模型中保持不变。
球体是无支架的3D培养物，具有多种特性，如生长因子有效扩散的梯度等。球体的大小取决于所种细胞的数量，可以增加到与目标组织相似的氧气和营养梯度的大小。球体可以很容易地分析成像使用光荧光和共聚焦显微镜。Vinci等人解决了3D培养中重复性低的问题，他们在96孔超低附着板中每孔创建一个球体[REF]。
在这项研究中，使用我们实验室开发的设备，我们能够在96口井的超低附着板中每口井生成10±2个球体，这有助于降低成本并提高再现性。3D模型由于能够模拟原生组织环境，现在在药物发现研究中越来越受欢迎。大量研究一致表明，基因表达谱、细胞表型、分化能力和功能受到组织结构的影响。因此，药物评估过程将极大地受益于3d工程组织模型在暴露于感兴趣的药物时所显示的细胞反应的准确预测在体外［21］．单层细胞同样暴露于介质中的生长因子，但在球形中，生长因子可能无法到达靠近核心的细胞。此外，单层细胞处于细胞周期的同一阶段，而在球形细胞中，有的细胞处于增殖阶段，有的细胞处于静止状态，有的细胞坏死或缺氧。在3D球体中，细胞似乎对药物表现出更多的耐药性，但这些模型更好地预测了药物的耐药性在活的有机体内药物反应。
本研究旨在研究bFGF和GDNF对不同剂量生长因子处理的胰腺β细胞球形细胞存活率、增殖和胰岛素分泌功能的影响在体外．这些结果也在2D和3D培养之间进行了比较。
FGF-2通过诱导蛋白酶的合成促进血管生成[9]，内皮细胞迁移和DNA合成[10]，以及体外毛细管分化[11］．本研究发现FGF-2增加了胰腺β细胞的增殖、活力和胰岛素分泌功能。但2D培养显示出对剂量的细胞毒性作用，否则在3D培养中显示出积极的结果。转基因小鼠神经胶质细胞中过表达GDNF可增加β细胞存活率并改善糖耐量[12，15-18］．GDNF已显示出改善移植后胰岛移植功能。它之前已经显示出治疗帕金森病的潜力。胰腺中产生的GDNF作为肠道神经祖细胞的神经营养因子。它可能是增加β细胞质量的治疗靶点。尽管GDNF在胰腺发育中具有有益作用，但其在β细胞再生中的潜力尚未被探索。
虽然这项研究证明了FGF-2和GDNF在1型糖尿病治疗中的有用性，但需要进一步详细的体内研究来验证这些发现。2D培养不能准确复制在活的有机体内的情况。因此，我们观察到2D培养和3D培养的结果不一致。二维和三维细胞培养模型被广泛应用于药物研发领域。尽管存在局限性，2D文化仍在全球范围内实践，但最近被认为是不准确和不可靠的模型。
3D细胞培养有望弥合传统的2D培养和在活的有机体内动物模型。然而，理想的3D模型仍然不存在。在本研究中，WST-8实验显示，在两种不同类型的培养物中，细胞的增殖有不同的结果，在3D培养物中获得的结果更接近预期在活的有机体内细胞的反应。这项研究证明，3D模型在研究新的生物标志物和新的治疗策略方面具有更大的潜力，这将引导我们实现个性化医疗的最终目标。进一步的研究可以提高重复性、高通量分析和兼容性，以展示统一标准化和验证的3D模型，这将有助于识别药物发现中的相关疗效和毒性数据。
感谢器官与组织再生实验室全体成员的指导、支持与配合。
没有相互竞争的利益需要申报。
这项研究没有从公共、商业或非营利部门的资助机构获得任何特定的资助。
