热休克蛋白(HSPs)鉴定的一种综合方法

摘要

由于没有任何模型能够完全复制临床人类伤口愈合，因此必须谨慎选择所使用的模型。在解剖学和生理学上，家禽皮肤在许多方面与人类皮肤相似。因此，本研究对有机鸡皮(离体烧伤皮肤模型)进行了分析。将模型鸡皮样品加热到模拟烧伤事件的温度并刺激热休克蛋白(Heat Shock Proteins, HSPs)的释放后，进行醋酸盐电泳(CAE)、微生物学程序、傅里叶变换红外光谱(FTIR)和扫描电子显微镜(SEM)分析。通过醋酸纤维素电泳分离出分子量较小的HSP37蛋白聚集体。红外光谱测试显示，将干燥的有机鸡皮加热到沸点会产生β-片状聚集体，这是蛋白质对热休克的反应。热休克蛋白37的聚集物在热损伤中产生，在这个模型中皮肤的抗菌活性并没有全部丧失。因此，通过显微镜、微生物学、电泳和光谱学检查，证实了烧伤皮肤中发现的抗菌肽、HSP蛋白。

关键字

热休克蛋白/微生物分析，醋酸纤维素电泳，红外光谱/模型动物皮肤胶原蛋白。

缩写

DPS:干纯鸡皮;DS30:干燥鸡皮加热至沸点30秒;IDS30-40:干燥的鸡皮加热至沸点30秒，然后在大约沸点的HSA存在下孵育30-40秒;IDS60-120:干燥鸡皮加热至沸点60s，然后在60°C的HSA存在下孵育1-2小时;WPS:湿纯鸡皮;WS30:湿纯鸡皮;湿鸡皮加热至沸点(100°C加热)30s;IWS30-40:湿鸡皮加热至沸点30秒，然后在大约沸点的HSA存在下孵育30-40秒;DS60:干燥鸡皮加热至沸点60秒;IDS60:干燥的鸡皮加热至沸点60s，然后在60°C的HSA存在下孵育1小时; HAS: Untreated Concentrated Human Serum Albumin; HSAS: Concentrated HSA in Presence of Chicken Skin; HSASS: Solution of HSA in Presence of Chicken Skin.

简介

烧伤与明显的炎症反应有关[1］．烧伤诱发急性期反应，血浆白介素(IL)-6和肿瘤坏死因子(TNF)-a水平升高，应激激素:儿茶酚胺和皮质醇[2］．

与未烧伤对照组相比，热损伤患者血浆中白细胞介素1β (il β)和白细胞介素6 (IL6)等细胞因子显著升高[3.-5］．这两种细胞因子在受伤后的第一周最高，并随着时间的推移而下降。

热休克反应，或应激反应，可能是最古老和最保守的应激反应形式。加热电池[6]或生物体产生一类被称为热休克蛋白(HSP)的蛋白质的表达。HSP家族既包括本构成员，也包括应力诱导成员，其主要功能是与天然蛋白和变性蛋白相互作用，以防止异常折叠蛋白的聚集，促进天然蛋白的折叠，促进变性蛋白的再折叠，并帮助细胞内蛋白质运输[7，8］．

伤口感染可能由内源性(患者菌群)或外源性微生物(环境、人员菌群、手术和治疗过程中使用的材料)引起。大多数感染是由病人自身的菌群引起的。细菌中最常分离出的病因是革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌，肠球菌sp.，凝固酶阴性葡萄球菌，链球菌和革兰氏阴性铜绿假单胞菌杆菌(通常负责感染糖尿病足溃疡和烧伤)。开放性伤口中微生物的存在是自然的，通常不会导致延迟愈合。然而，如果细菌和宿主之间的相互作用变成感染，伤口状况就会恶化。慢性伤口潮湿且营养丰富，为病原体的繁殖提供了完美的环境。细菌可以作为单细胞生存和繁殖，尽管绝大多数细菌具有形成主要由细菌组成的生物膜的能力葡萄球菌而且假单胞菌．生物膜[9]是一种有组织的定居微生物结构(能够附着在伤口表面，其他生物组织或无生命元素)，周围是由细菌产生的有机和无机物组成的细胞外黏液层。它保护它们免受不利的环境条件(pH值、温度和辐射)、抗菌剂(抗生素)和宿主的免疫系统(抗体、吞噬细胞、中性粒细胞)的伤害。

本研究的目的是监测温度对有机鸡皮胶原蛋白的影响;我们使用了一个模型，在人血清白蛋白存在和不存在的情况下，鸡皮暴露于各种热损伤。分析是在将样品加热到模拟烧伤事件的温度后进行的。该实验旨在确定生理/病理生理温度下的热休克是否会刺激热休克蛋白的释放。

材料与方法

有机鸡皮样品的制备

有机鸡皮样本(及体外烧伤损伤皮肤模型)的收集和确定，如前所述[10］．有机鸡皮样品通过在滤纸条(WPS、WS30和IWS30-40)上干燥制备，用于FTIR光谱分析。样品DPS、DS30、ID30-40、IDS60在实验室烘干机中45°C干燥3天。相比之下，HSA中的液体样品在-18°C冷冻24小时。

微生物分析

对有机鸡皮样品进行了检测。他们暴露在可引起医院感染的细菌中，即革兰氏阳性金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性金黄色葡萄球菌大肠杆菌．生理盐(2 cm3)倒入两个无菌试管中。使用无菌(红色热)接种回路，大肠杆菌从富集琼脂(用于培养特别苛刻的细菌菌株)上提取样品，插入其中一个试管并在盐中稀释。使用移液管，将三滴悬浮液转移到富集琼脂上;然后，使用冷却的无菌细菌播散器，将它们散布在琼脂表面。之后，再次对播散器进行消毒，并将一部分皮肤放置在培养皿的中心。

同样的程序被重复金黄色葡萄球菌，置于甘露醇盐琼脂上(含7.5% NaCl抑制其他细菌生长)。随后将培养皿放置在试管中，然后在37°C的实验室加热器中保存24小时和48小时。将有机鸡皮样本暴露在相同的细菌中:大肠杆菌在麦康基琼脂上(含有胆汁酸盐和结晶紫，抑制革兰氏阳性细菌的生长)和金黄色葡萄球菌在甘露醇盐琼脂上(高浓度的NaCl抑制了其他细菌的生长)。样品在37°C的实验室加热器中保存24小时。确切的指定程序载于[10］．

电泳分析

样品在巴比妥缓冲液(pH 8.6)中，在6 mA、最大200 V的条件下，在醋酸纤维素膜条带(CASYS-MINI)上电泳0.5小时。条带用0.5%甲苯胺蓝在3% HOAc溶液中染色，然后用蒸馏水冲洗，风干。用0.5%胺黑在5% HOAc溶液中染色，然后固定在甲醇、HOAc和水中(18:4:18);然后用5% HOAc溶液和蒸馏水漂洗，风干。采用GELSCAN v.1.45软件对样品中蛋白质含量进行半定量分析。

红外光谱分析

FTIR光谱分析使用Nicolet 6700傅里叶变换分光光度计(Thermo Scientific, USA)， OMNIC 7.0软件，并配备扩散附件EasiDiff (Thermo Nicolet Industries)(光谱区域:4000- 500 cm⁻¹分辨率:4厘米⁻¹固体样品(纯有机鸡皮样品的碎片或HSA中的液体样品)，扫描次数:160次。每个样品的三个重新包装的子样品的光谱平均为一个光谱。所有光谱都使用线性基线进行，并使用傅里叶平滑进行预处理(Grams 32 AI软件，Galactic Industries)。

扫描电镜分析

采用JEOL公司提供的JSM 5500LV扫描电子显微镜对鸡皮表面进行扫描。样品被安装在铝存根上并涂上金(JFC 1200 Jeol)。加速电压为10kV，进行了二次电子(SE)和后向散射电子(BSE)观测。缩微照片在35倍的放大倍数下拍摄。

结果

烧伤是一种复杂的创伤性事件，具有多种局部和全身影响。长时间暴露在高于40°C的温度下会导致蛋白质变性，最终失去其质膜完整性。这个过程很快，当暴露在高于60°C的温度下，即火焰燃烧时，可能只需要一秒钟[11］．

在本研究中，将样品加热到模拟烧伤事件的温度后，进行醋酸盐电泳(CAE)，微生物程序和傅里叶变换红外光谱法(FTIR)。扫描电子显微镜(SEM)分析照片说明了这些试验。

扫描电镜分析结果见(图1)，这是一系列测试的代表性分析实例。这些图像显示了测试样品表面形态的明显差异，甚至包括对皮肤表面的非特异性损伤。这种差异可以在随后的热处理阶段中看到。加热至沸点30秒的皮肤样本(图1 b)，以及将皮肤样本加热至沸点30-40℃，然后在沸点孵育30℃(图1 c-1 e)，表面严重受损，有明显的凸起、光滑和水泡，而(图1 e)表示皮肤表面因长期暴露在高温下而变得光滑。

众所周知[12在烧伤事件发生后，皮肤不再是外部因素的机械和生物屏障。所有的烧伤都有感染的风险，因为细菌可以进入破损的皮肤。败血症或血液感染可在最严重的情况下发生。这会导致休克甚至死亡。由此产生的坏死性结痂是微生物扩散到皮肤和皮下组织的良好培养基。金黄色葡萄球菌凝血酶阴性葡萄球菌(如美国epidermidis)是烧伤伤口中最常分离的细菌[13］．

长时间暴露在沸点温度下会导致皮肤样品的变形。将皮肤样品加热到沸点30-40秒，然后在沸点孵育30秒，与WPS的参考样品进行比较。然而，事实证明[12]烧伤损伤的皮肤并没有完全失去抗菌能力(表1)．严重烧伤与炎症介质的释放有关，最终导致局部和远处的病理生理效应。包括活性氧和活性氮在内的介质在受影响的组织中增加，这与烧伤患者观察到的病理生理事件有关。黄嘌呤氧化酶升高和中性粒细胞活化似乎是烧伤的氧化剂来源。自由基已被发现对抗菌作用和伤口愈合有有益的影响。然而，在烧伤后，会产生大量有害的活性氧，与炎症、全身炎症反应综合征、免疫抑制、感染和败血症、组织损伤和多器官衰竭有关。因此，临床对烧伤的反应取决于自由基的产生和解毒之间的平衡。

此外，在烧伤皮肤中发现的抗菌肽(可能是HSP蛋白)解释了为什么在没有抗菌特性的敷料下，烧伤可以在没有临床感染迹象的情况下愈合。这可以解释增加抑制带的存在，如(表1)的样本:WPS、WS30、IWS35及IWS40。

其他方法，如二维PAGE已被用于证明去除或分离高丰度蛋白质可以大大提高低丰度蛋白质的检测[14］．白蛋白是最常见的血清蛋白[15，16］．本研究以醋酸纤维素膜电泳为重点，对其热敏性和热耐受性进行了研究。白蛋白是最常见的血浆蛋白[17占所有血液蛋白质的55-65%。它们是相对较小的分子，重量为66.5-66.9 kDa。据估计，在烧伤事件发生后，白蛋白和转铁蛋白的水平会下降多达50-70%。构成蛋白质(如白蛋白)的浓度下降，除其他因素外，是由于蛋白质大量从毛细血管逃逸到血管外空间和烧伤伤口而造成的[2，18，19］．在热休克后的炎症反应中，白蛋白浓度降低，甚至可以转化为低质量的蛋白质，这可能是由于血清中形成复合物[17］．在这项CAE研究中(图2)，在热应激过程中观察到白蛋白浓度显著降低，并发现与较低的分子量有关。热休克蛋白聚集物带的出现可能与样品在沸水温度下调节30-40，特别是2分钟时热休克蛋白的分泌有关(图2)．热休克蛋白[20.]，特别是HSP70家族，可能是一个人的耐热耐受性的客观指标，并有利地影响烧伤皮肤的愈合。HSP升高与心排血量和血压升高相关，同时降低循环的促炎细胞因子[20.］．检测烧伤组织中热休克蛋白的局部表达[21]，这表明二度和三度烧伤后皮肤中HSP32和HSP70浓度增加。样本的电泳图(图2)揭示了一个额外的寡聚物带，可能来自HSP32。

热稳定性是胶原蛋白在生物医学应用中的重要特性[22，23］．因此，将鸡皮加热至沸点30-120s，然后在沸点孵育的FTIR光谱进行分析和比较(图3)．干燥和湿样品均被选择。首先，在(表2)，分析了酰胺I、II、III谱带位置和吸收比I1235/ I1450的变化。1720 - 1600厘米^－1, 1600 - 1480厘米^－1和1400 - 1200厘米^－1分别被划分为酰胺I、酰胺II和酰胺III波段(表2)．酰胺I带(1649-1659厘米)⁻¹)在红外光谱中通常属于α-螺旋结构[24];两个肩膀[10]长1620厘米⁻¹1680厘米⁻¹可能是分子间β-片状聚集物所致。这些聚集物被识别出来。最高1677厘米^－1纯干鸡皮的酰胺带明显转移到约1692-1699 cm的区域^－1干燥的鸡皮样品加热到沸点30-40秒，然后在HSA存在的沸点下孵卵30秒，这证实了热诱导的蛋白质聚集物确实形成了分子间β-片结构。对于湿鸡皮，换算约1649cm^－1发生于1651-1634厘米的地区^－1．最高1649厘米^－1湿纯鸡皮酰胺带(表2)明显地转移到大约1634厘米的区域^－1将湿鸡皮样品加热至沸点30-40秒，然后在HSA存在下以大约沸点的温度孵育30秒。这可能是由于分子间β-sheet聚集和氢键的增加。酰胺III波段与1470-1450厘米之间的强度比^－1带被用来表示胶原蛋白的三螺旋结构。早期报道表明，在纯胶原蛋白的FTIR光谱中，红外吸收比为I1235/I1450 cm^－1为1.00，而据报道明胶膜(变性胶原蛋白)的该比值为0.59，表明三螺旋度的丧失[25］．此损失由(中的数据表示。表2)．将干燥的有机鸡皮加热至沸点60秒(图3)导致1650- 1550厘米的宽频带消失^－1区域，将有机鸡皮加热到沸点120秒，导致在1700-1600厘米的波段转换^－1面积，这可能归因于分子间β-片状聚集物。

红外光谱可以潜在地用于识别受早期异位骨化影响的组织区域，以及可能倾向于HO形成的组织区域[26］．最高1660厘米^－1也与预期的蛋白带一致，包括骨组织中存在的胶原蛋白。1450厘米^－1条带是蛋白质和脂质CH的组合₂摇摆振动;骨矿物带在958厘米处达到峰值^－1(PO₄³⁻)和1070厘米^－1(有限公司_3.²⁻)，分别具有独特的磷灰石矿化特征(图4)．

通常，使用FTIR光谱记录纯生化化合物溶液的红外光谱是非常复杂的，但测定液体样品FTIR光谱的变化是发现有效生物标志物的基础。在本研究中，从热改性血清的冷冻样品中记录了FTIR光谱。分析这样的样本是复杂的;获得的光谱结果是液体体液的信噪比较差，而1638 cm处的水的贡献很强^－1．首先，分析了酰胺I带位置的变化(表3而且图5)．红外光谱中最具诊断性的峰位于(表3)．然而，当溶液浓度增加时，可以看到样品的不同特征在系统地进化。单带在1652厘米处^－1所观察的血清在经过热休克蛋白修饰的环境中分离。酰胺I带从1661 cm开始逐渐偏移^－1（图5 b)至1657厘米^－1（图5 c)和酰胺II带在1550厘米处^－1变得更加明确。一条1580厘米左右的新带子^－1也出现(图5 c)．精确分析这些波段内的变异性是困难的，因为酰胺键的热稳定性最终受到各种因素的影响。

讨论

烧伤创面愈合是一个复杂的生物过程，包括用活组织替代受损组织。预防严重烧伤的不良代谢后果不仅是一个严重的临床问题，也是一个有趣的分析问题，这是正在进行的研究和本文的主题。本文集中讨论了人体对热烧伤反应的分析基础，即HSPs的释放，以及是否有可能使用微生物程序、醋酸纤维素电泳和红外光谱直接或间接识别这些蛋白质的问题。

众所周知，烧伤皮肤不再是外部因素的机械和生物屏障。由此产生的坏死性结痂是微生物深入皮肤和皮下组织的良好滋生地。研究发现，生物膜细菌可以从60%的慢性伤口中分离出来。原子力显微镜和电子显微镜显示生物膜存在于所有类型的慢性伤口:胫骨溃疡，压疮，烧伤和糖尿病足溃疡。这种细菌生物膜对慢性伤口愈合的存在和作用目前正在研究中，引起了微生物学家和临床医生的争议。通过激活免疫反应的级联反应(包括“氧爆炸”，或释放具有强抗菌作用的活性形式的氧气)，免疫细胞对宿主的组织造成严重损害，而不会影响生物膜，导致其根除。此外，被“氧气爆炸”降解的宿主细胞成分为细菌提供了完美的营养物，并有助于生物膜的完整结构的快速恢复[27］．最初，燃烧区域被认为没有主要的微生物污染。然而，汗腺和毛囊深处的革兰氏阳性细菌可能在最初损伤的高温下存活，除非使用局部抗菌剂，否则这些细菌在损伤后的48小时内大量定植在伤口上[28］．

铜绿假单胞菌(21.6%),大肠杆菌(13.6%)和金黄色葡萄球菌(13.2%)是从烧伤创面分离出的主要菌株[28］．根据其他作者的说法，铜绿假单胞菌细菌通常被认为是一种在烧伤伤口上定居并导致烧伤患者败血症的微生物，由于使用了有效和有针对性的抗生素，它最近变得不那么流行了。金黄色葡萄球菌凝血酶阴性葡萄球菌(如美国epidermidis)是烧伤伤口中最常分离的细菌[29］．

确定造成伤口生物负担的病原体尤其重要，因为耐多药细菌的流行正在增加，需要使用适当的抗菌剂进行治疗。创伤的病理改变伴随着分子环境的根本变化，可以用振动光谱分析。由于拉曼光谱和FTIR光谱的特异性，它们也可以用于评估伤口的生物负担。细菌种类和菌株的拉曼光谱分布差异明显[25］．

然而，事实证明，在烧伤中受损的皮肤并没有完全失去抗菌能力(表1)．在烧伤皮肤中发现的抗菌肽，可能是HSP蛋白，解释了为什么在没有抗菌特性的敷料下，烧伤可以在没有临床感染迹象的情况下愈合。这可以解释增加抑制带的存在，如(表1)的样本:WPS、WS30、IWS35、IWS40及IWS60。

虽然血清是最难表征的蛋白质组样本之一，但蛋白质组学的驱动力之一是发现生物标记物，即与特定生物过程或疾病相关的浓度或状态变化的蛋白质。浓度变化的测定，相对或绝对，是发现有效的生物标志物的基础。烧伤伤口环境中组织热损伤的一个生物标志物是血清中白蛋白的组成。虽然这些研究是在动物皮肤模型样本上进行的，这是一种常见的临床前标准，但结果可能会在从烧伤病房获得的样本上进行研究时得到实际考虑。

在蛋白质代谢的背景下，肝脏在对热损伤的反应中起着核心作用。它合成至少17种主要血浆蛋白，是白蛋白和α-球蛋白的唯一来源[19］．炎症是身体对破坏组织或器官结构的物质的防御反应。在损伤性刺激后，炎症反应有一个急性期，从几十秒到近12小时不等，随后导致慢性期。作为炎症反应的一部分或在组织损伤过程中，炎性细胞因子被释放，导致急性期蛋白的释放。血清白蛋白是一种阴性急性期蛋白。炎症反应中有五组急性期蛋白[30.]，包括白蛋白和α-2-巨球蛋白。

就分子质量而言，高敏感蛋白可分为以下几个科[31HSP27(属于存在于皮肤上表皮层的“小热休克菌”);HSP32(当细胞受到压力或暴露于毒素或紫外线辐射时增加);HSP47, HSP60, HSP70, HSP90和HSP110。HSP70是细胞中最易受应激诱导的蛋白质之一[32]，参与蛋白质合成、折叠和降解的调节。HSP反应与增加生存率和减少器官损害有关。Western Blot检测烧伤组织中热休克蛋白的局部表达[21]，这表明二度和三度烧伤后皮肤中HSP32和HSP70浓度增加。样本的电泳图(图2)揭示了一个额外的寡聚物带，可能来自HSP32。通过识别这些条带得出的结论与早期微生物学研究是一致的。

FTIR光谱对检测聚集体的主要结构之一β-片结构具有诊断价值。一般来说，我们都知道蛋白质在热和化学变性诱导下聚集形成分子间β-片结构。本文从模型动物组织中获得的胶原蛋白超分子结构中的β-片状聚集物和其他变化的分析，再次回答了热休克光谱反应的问题。波长分析在1500厘米之间^－11700厘米^－1显示出两个峰，对应于酰胺结合蛋白的区域。近年来对胶原蛋白热聚集过程的研究表明，胶原蛋白热聚集的第一步是蛋白质原生构象的部分开放。

对模型动物皮肤样本的观察也证实了N-H拉伸和C=O之间氢键的形成。在这个光谱范围内[33]，与酰胺I带重叠的水仅在1638 cm处表现出单一特征^－1与酰胺II带区(1580-1490 cm)部分重叠^－1)．酰胺I，其特征波数在1600-1700厘米^－1范围，主要与骨干C=O拉伸振动有关。酰胺II一般负责NH面内弯曲和CN拉伸振动的结合[34］．由于胶原蛋白中的分子间相互作用，酰胺III峰是复杂的，包括来自酰胺键的C-N拉伸和N-H平面内弯曲的成分，以及来自CH的摆动振动引起的吸收₂甘氨酸主链和脯氨酸侧链上的基团，表明氢键参与了胶原蛋白。

在本IR研究中，当干燥有机鸡皮加热到沸点60秒时，会导致1650-1550 cm的宽波段消失^－1面积，表示样品变性，将有机鸡皮加热到沸点30-40℃，会导致1700-1600 cm的波段转换^－1区(图3)，这可能是由于分子间β-表聚集。这里需要强调的是，对于真实的生物样品，如动物皮肤，波段位置的变化趋势是作为一种规则来讨论的，而不是光谱波段的确切位置。

拉曼光谱和FTIR光谱可以通过监测创面上皮化的关键成分，如角蛋白、弹性蛋白和胶原蛋白，通过识别和量化细菌负荷，以及通过检测HO(“异位骨化”)，提供客观的评估手段[26］．HO被定义为软组织中骨的病理形成，在骨科手术、烧伤、创伤性脑损伤和脊髓损伤中观察到。这些观察还表明，在抗氧化剂的影响下，组织破坏的过程可以逆转。l -抗坏血酸和改性正硅酸作为模型烧伤过程抑制剂的作用是作者先前研究的主题[10］．

测定液体样品FTIR光谱的变化是发现有效生物标志物和检查烧伤瘢痕组织血清中体液环境的基础。通常，用FTIR光谱记录纯生化化合物溶液的红外光谱是非常复杂的;虽然指纹区域仍然是关于样品分子组成的最具信息量的区域，但水的贡献明显较少[34］．沉积和风干血清的主要限制方面仍然是所产生的沉积物的不均匀性。然而，从水溶液中记录红外光谱，至少在指纹区域，是可能的，因此是研究人血清的最佳候选。在本研究中，从热改性血清的冷冻样品中记录了FTIR光谱。单带在1652厘米处^－1所观察的血清在经过热休克蛋白修饰的环境中分离。该条带的鉴定也证实了早期的微生物、电泳和光谱测试。

结论

由于没有任何模型能够完全复制临床人体伤口愈合，因此必须谨慎选择所使用的模型。例如，猪和人的表皮都很厚。人表皮范围为50 ~ 120 μm，猪表皮范围为30 ~ 140 μm [35］．在这项研究中，有机鸡皮(an体外烧伤损伤皮肤模型)。用醋酸纤维素电泳分离HSP37蛋白聚集物。FTIR测试也证实了这些聚集物的存在，这些聚集物是由于三螺旋性的丧失而形成的分子间β-片结构。一般来说，似乎只有全面的分析，如CAE、IR、微生物学和sem(皮肤表面变化的微观说明)，才能被视为有效的生物标志物，试图解释热休克或应激的物理化学反应。进一步的研究将集中于寻找一种有效的屏蔽改性剂，以支持中和热氧化应激影响的过程。本研究可作为分析临床试验的综合分析程序的范例。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

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