快速检测氯霉素和卡那霉素残留的点酶连接适体吸附试验(点- elasa)

摘要

一种基于核酸适体和核酸适体原理的点酶连接适体吸附测定方法(Dot-ELASA)Dot-ELISA用于检测氯霉素(CAP)和卡那霉素(直)残留。该方法能够快速检测牛奶中CAP和KAN残留量，检测浓度低至10-7 g/L。

关键字

Dot-ELASA;氯霉素;卡那霉素;适体;检测;牛奶

简介

氯霉素(CAP)是一种广谱抗菌药物，广泛用于动物治疗多种疾病传染病由于其优异的抗菌能力和低廉的成本。CAP通过抑制蛋白质合成来达到抗菌作用，对多种革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌表现出良好的活性。然而，CAP已被发现对人类有严重的副作用，如灰色婴儿综合征、白血病和再生障碍性贫血[1，2］．许多国家对CAP在食用动物中的使用进行了管制，例如，欧盟(EU)规定了0.3 μg/ kg的最低性能要求[3.］．卡那霉素(KAN)是另一种抗菌药物通常用于治疗各种感染。它通过与原核核糖体的30S亚单位相互作用诱导误译并阻止易位[4］．KAN还会导致严重的副作用，包括听力损失和通过食物摄入或药物过度处方对肾脏的毒性。欧盟已规定牛奶中KAN的最大残留限量为150 μg/kg [3.］．食品中抗菌药物残留已日益成为公众健康关注的问题。检测食品中是否含有残留具有重要意义抗生素在市面销售前超过最高残留限量[5，6］．色谱法、酶法和免疫法已报道用于检测食品中的抗菌药物残留，但还需要更可靠、准确和用户友好的方法[7，8］．

适体主要是欧力多核苷酸(ssDNA或RNA)可以结合它们的配体，具有很高的亲和力和特异性。自[引入适体]以来9，10]以及指数富集配体系统进化(SELEX)技术的发展[11]，已报道针对不同目标的多种适体，包括有机分子、抗生素、多肽、蛋白质和病毒[12-14］．与抗体相比，适体具有良好的稳定性以及较高的亲和力和特异性，特别是对小分子。此外，适体很容易扩增[15，16]，综合，修改，操纵和描述[17，18］．因此，许多基于适体的生物分析方法被提出并应用于不同分子的检测[19-22］．最近，基于适体的传感器已被用于检测抗菌药物，如卡那霉素，妥布霉素，及四环素[23-25］．但这些检测方法需要特定的仪器，难以作为一种快速简便的方法进行标准化。斑点酶联免疫吸附试验(Dot- elisa)作为一种检测系统，能够将分子转化为光信号，所需试剂和处理时间较少[26，27］．点- elisa的另一个优点是可以用肉眼检测结果。在本工作中，我们利用适体和点-酶联免疫吸附试验(Dot- elasa)的原理，建立了一种用于快速检测CAP和KAN残基的新系统。

材料与方法

适配子序列

CAP适体序列为5 ' - Biotin-ACA GTG AAA AAA GAC GTG TGA ATG TCA CAC TGA AAA [28]， KAN适体序列为5 ' - Biotin-ACC GCG GGG TTG CGG ACC GGG AGC TCC AGC [29］．CAP和KAN适体的二级结构如图所示（图1）．这些适体的DNA序列由TakaRa (Dalian, China)合成。

点- elasa的程序

将0.2 μm的硝酸纤维素(NC)膜(Pall, USA)切成合适尺寸的条状。将抗菌药物与10×负载缓冲液(中国大连)(pH 9.6)混合后加入牛血清白蛋白(BSA) (NEB,USA)，终浓度为6%。将溶液涂抹在NC膜条上(10 μl/点)，55℃孵育1 h。然后用含4%无脂奶粉的PBS (ph7.4)在37℃堵塞膜条1 h, PBS- tween 20 (PBST) (ph7.4)洗涤3次，每次15 min。40℃干燥30 min, 55℃60 μM生物素标记apatmer浸泡1 h, PBST洗涤3次，每次10 min。膜在40°C下干燥10分钟，在10 mL 500倍稀释的链霉素标记的辣根过氧化物酶(HRP) (MD, USA)中浸泡1小时，然后用PBST清洗3次，每次10分钟。最后，膜在40℃下干燥5分钟，然后用3,3 ' -二氨基联苯胺(DAB) (Pierce, USA) 37℃底物孵育15分钟，使阳性斑点变成蓝色，阴性斑点变成无色。

优化抗菌药物捕获条件及适体结合温度

由于在NC膜上捕获抗菌药物并与抗菌药物结合适配体至关重要，因此评估了BSA浓度(1% ~ 10%系列稀释)和抗菌药物与生物素适配体结合的温度(37、40、45、50、55、60、65、70℃)。CAP和KAN、牛奶、适体和HRP的默认浓度为10^－2g/L、2%、100 μM和1:500稀释。所有的膜在40°C干燥，37°C孵育。同时比较0.01 mol/L PBS (pH 7.4)和0.05 mol/L tris缓冲盐水(TBS) (pH 9.6)作为加载缓冲液。

优化Dot-ELASA条件

在NC膜上用10 μL抗菌药物(10^－2g/L)用0.05 mol TBS (pH 9.6)稀释于6%的BSA中。并对生物素适体(100、80、60、40和20 μM)和链霉亲和素- hrp(1:250、1:500、1:100、1:150、1:200)进行稀释。阻塞牛奶的浓度为2%。除生物素-适体和抗菌药物组合在55°C外，所有膜在40°C干燥，37°C孵育。对无脂牛奶的连续稀释(1,2,3,4,5%)也进行了阻塞测试。

敏感性和特异性评价

在最佳反应条件下，通过一系列稀释(10^－2, 10³, 10⁴, 10⁵, 10⁶, 10⁷和10⁸g/L)的CAP和KAN。每种浓度的试验都进行了三次。浓度可检测或较高的斑点呈蓝色，而浓度不可检测的斑点无色。CAP, KAN，新霉素和四环素在10^－2g/L测定CAP特异性适体和KAN特异性适体的特异性。

点- elasa在牛奶样品中的应用

CAP和KAN以10的连续浓度加在生牛奶中^－2~ 10⁸g / L。加标后的牛奶样品在12000 rmp下离心5分钟以去除脂肪。上清液按1:1的比例加入2×加载缓冲液和终浓度6%的BSA。每次试验都进行三次。

结果

优化抗菌药物捕获条件及适体结合温度

在NC膜上捕获抗菌药物是该方法的关键步骤。如果无蛋白存在，抗菌药物的小分子会从NC膜中逃逸。我们发现，当样品溶液中BSA浓度为> %，最佳浓度为6%时，BSA有利于抗菌药物在NC膜上的保留。抗菌药物与生物素适体结合的温度是本试验的另一个关键因素。可检测抗菌药物的温度范围为50~65℃，最佳温度为55℃。对于加载缓冲液，0.05 mol/L TBS (pH 9.6)比0.01 mol/L PBS (pH 7.4)效果更好。

Dot-ELASA条件的优化

为了获得最佳的条带试验灵敏度，采用二维棋盘滴定法筛选生物素适体浓度和链霉亲和素- hrp的量。生物素适体的适宜浓度为60 μM，链霉亲和素- hrp对CAP和KAN的最佳稀释量为1:500。用2~5%的低脂牛奶在Dot-ELASA中阻断NC膜，发现最佳脂肪浓度为4%。在37°C、45°C和55°C孵育时，没有观察到显著差异，但样品在55°C的膜上干燥得更快。与孵育15分钟或30分钟相比，孵育1小时可提高检出率。

Dot-ELASA的敏感性和特异性

Dot-ELASA的敏感性和特异性结果见（图2而且3.）分别。如（图2），带>的斑点10⁸g/L CAP和KAN为蓝色，其他为10⁸g/L浓度变为无色。结果表明，两种抗生素的最低检出浓度均为10⁷g / L。如（图3）CAP特异性适体仅与CAP结合，与KAN、新霉素、四环素无交叉反应。同样，KAN特异性适体仅对KAN有反应，对其他抗生素无反应。

点- elasa法检测牛奶样品中CAP和KAN

（图4）图中为加药牛奶样品中CAP和KAN的点- elasa检测。在加药的牛奶样品中，两种抗生素的最低检测浓度均为10⁷g / L。

讨论

在基于适体的方法中，结合温度是一个关键因素。CAP和KAN在50~65℃范围内均可检测到，55℃为ssDNA适体结构稳定的最佳温度。其他研究人员也报告了类似的发现[30.］．超过60°C的温度会使适体变性，使抗生素失活，从而引起其构象的改变，从而导致抗生素与其适体之间的识别失效。Dot-ELASA的检出限为3.1 × 10⁷毫米(10⁷g/L)， 1.72 × 10⁷毫米(10⁷g/L)为牛奶样品中的KAN。CAP的检出限与传感器法相似[1]，但低于以往报道的其他方法[31，32］．KAN的检出限与基于生物素-链霉亲和素的免疫传感器相似[33]，但低于免疫吸附试验［34]和其他报道的方法，包括比色检测方法[23，30.，35］．但本工作中Dot-ELASA的检出限符合现行国际标准(欧盟MRLs)。

核酸适配体在检测小分子方面具有亲和力高、特异性强、易合成等优点[17，18］．基于适配体的方法面临的挑战之一是适配体与目标结合后的检测。不像免疫测定基于这种方法，很难将未结合的适体与结合的适体分开。为了克服这一挑战，无标签传感器[30.]和基于适配酶的传感器(适配体和催化核酸的组合)正在成为检测抗体的替代方法[36］．基于催化信标的方法[37]和金纳米颗粒聚集[23，35也有报道。然而，这些方法的设计是基于抗生素等不固定小分子的条件。本文所述的点- elasa方法是基于首先固定目标抗生素。因此，检测过程非常简单，结果可以像传统的点- elisa一样肉眼检测。斑点- elasa法是一种特异性强、快速、经济、可行的检测牛奶样品中CAP和KAN的方法。未来的工作是评估该方法在其他类型的食品样品中检测CAP和KAN和其他抗生素。此外，在建立标准检测曲线后，可以进行定量检测。

致谢

本工作由珠海市卫生局科研项目(2009077)和中国检验检疫科技基金项目(2011IK237)资助。

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