一个液相色谱–Alpha-Ketoglutaric酸的质谱方法测定人血浆。

文摘

Alpha-ketoglutaric酸(一公斤)目前正在调查为有前途的癌症细胞损害的代理和氰化物解药。一个简单的、具体的液相色谱-光谱法(质/ MS)测定方法开发的定量测定人血浆一公斤。一公斤的衍生化是通过使用N-methyl咪唑在trifluroacetic面前使脱水。几个参数,影响收益率的衍生化反应,反应温度和时间等进行了优化。一公斤的咪唑衍生物提取使用甲基叔丁基醚和量化在正电子敏捷电离模式(质荷比(m / z): 197)。该方法充分验证使用的参数(如特异性,线性,检测极限和量化,精度、准确性、复苏、鲁棒性和强度。线性了100 - 2500的浓度愤怒ng mL-1相关系数(R2) 0.9991。检测和量化的极限是40和100 ng mL-1分别。内部,inter-day准确度和精密度都容许极限内(< 8%)。鲁棒性和强度评估使用Plackett-Burman实验设计。

关键字

Alpha-ketoglutaric酸(α-KG)、质/ MS,等离子体,氰化物解药

介绍

Alpha-ketoglutaric酸(一公斤)戊二酸的衍生物。这是一个关键化合物的代谢的必需氨基酸和细胞能量的转移在柠檬酸循环。结合L-glutamate, alpha-ketoglutaric酸可以降低氨的水平在大脑中形成,肌肉和肾脏,以及有助于平衡身体的化学和防止氮氮过剩在身体组织和体液。口服或注射用一公斤导致减少氧化应激和改善术前运动能力。反过来,这导致更短的恢复时间和减少并发症的风险与合成快架手术计划和肺手术住院和发病率低。此外,据说一公斤帮助治疗或预防健康问题如细菌感染、白内障、肾脏疾病和真菌感染1,2]。一公斤正在追求广泛的氰化物解药,一公斤与氰化物反应形成无毒氰醇衍生物[3- - - - - -6]。

几种方法已经开发出来的量化alpha-ketoglutaric酸生物样品中相应的phenyl-hydrazone dinitrophenylhydrazone或quinoxalone耦合光度检测8- - - - - -11]或作为其dipyrene、2-quinoxalinol quinoxalinone或zinc-pyridoxamine衍生品耦合fluorimeric检测(12- - - - - -16]。

本研究的目的是开发一个质/ MS法测定人血浆的一公斤。在目前研究一公斤derivatized使用n-methyl咪唑和衍生化反应对反应温度和时间进行了优化。目前的常规分析方法可能是有用的在人血浆样品一公斤。

实验

化学药品和试剂

Alpha-ketoglutaric酸二钠盐(纯度96%)从Sigma-Aldrich购买,美国。N-methyl咪唑(敝中断),trifluroacetic酐(TFAA)和甲基叔丁基醚(MTBE)从σ-奥尔德里奇,购买美国。所有其他的溶剂和试剂为分析纯来自默克(达姆施塔特,德国)。

仪表和质/ MS条件

alpha-ketoglutaric酸的量化是由安捷伦1200液相色谱系统(德国)组成的二元泵、一个autosampler,二极管阵列检测器和温度控制的柱温箱,耦合到力量女士与电子Spry离子化检测器(ESI)接口。的分离进行Zorbax某人C8(4.6×75毫米,3.5μ)使用权力平等主义的混合物65:35 v / v(甲酸乙腈:水0.1%)。

制备的标准解决方案

标准储备溶液含有100 mg / L(一公斤准备在蒸馏水和储存在4°C。工作标准溶液被稀释股票刚做好的蒸馏水。

优化的衍生化反应

衍生化反应是优化通过比较的峰值区域derivatized一公斤。一公斤的离子m / z 179监控以确保衍生尽可能高效。进行衍生化反应在不同的温度下(60、65和70°C)和时间(30、60和90分钟)和fivereplicate分析为每个条件进行。反应是由蒸发一公斤的标准溶液干燥在试管中温柔的氮。然后,40μL衍生化试剂是补充道。试管被允许站60和80°C 30 60 - 90分钟。由此产生的解决方案注入质/女士。

样品制备、萃取和衍生化

一公斤一百毫升水中等离子体或水样品溶液(100μg /毫升)被添加到一个玻璃小瓶,混合着20μl N-methyl咪唑试剂。20毫升trifluroacetic酐是添加到混合物中。15分钟的反应被允许继续在65°C水浴。增加了3毫升的甲基叔丁基醚(MTBE)混合物和瓶被关闭后短期剧烈漩涡和提取10分钟手腕动作瓶。在4000转离心5分钟后,收集有机层,溶剂蒸发的蒸汽下氮、和甲醇,干残渣重组样本转入自动取样器瓶。瓶被关闭crimp-top帽和储存在-20°C到质/ MS分析。

方法验证

特异性

特异性的方法评估通过分析不同的空白样品。这样做是为了调查是否有内源性物质的干扰。为任何干涉检查获得的色谱保留时间通过监测离子179 m / z和197 m / z。翘尾因素的方法评估注入高浓度的一公斤飙升等离子后跟空白样品。

线性和范围的方法(LOD和定量限)

方法的线性评估通过校正曲线(在空白矩阵和溶剂)浓度100 - 2500 ng / mL。校准曲线的峰面积与浓度由策划一公斤。确定系数是评价。

检测的极限(LOD)和量化的限制(定量限)建立了基于以下表达式。

LOD = Xb + 3 s

定量限= Xb + 10

,Xb是空白的平均峰面积和S标准差的峰面积。

量化的限制(定量限)是最能被探测到的浓度和量化的一个可接受的精密度和准确度。在定量限点可接受的精密度和准确度分别为20%和80 - 120%,分别。

精密度和准确度

方法的精密度和准确度被执行当天和评估inter-day精密度和准确度的测试。当天来执行测试,100年μL血浆样本中掺入适量的一公斤标准溶液以获得样本三个浓度水平(100年、500年和1500年ng / mL)。质/ MS分析的样品处理和分析在同一天。评估inter-day精密度和准确度,血浆样品三个浓度水平(100年、500年和1500年ng / mL)准备在5日和分析每一个5天。在每个浓度水平五个复制样品(n = 5)在重复的准备和分析。在每个样本的浓度一公斤计算斜率和截距从校准曲线,获得每日构造。精度是由百分比相对标准偏差(%相对标准偏差)和准确性是表达的偏见。

复苏

经济复苏进行了研究在三个不同的浓度水平(100年、500年和1500年ng / mL)。适当的工作标准飙升到100年μL空白血浆和波谱分析的样品处理和质/ MS。

鲁棒性和强度

方法的鲁棒性和强度使用Plackett-Burman实验设计同时进行。五个变量选择,重要的表现方法12实验运行进行(表1和2)。实验以随机的顺序进行最小化不明原因的变化对响应的影响。结果是评估使用STATISTICA 10统计软件。

结果与讨论

N-methyl咪唑被选为衍生化试剂,以咪唑组介绍给一公斤。一公斤的可能的反应提供了甲基咪唑图2。一公斤-甲基咪唑反应,反应时间对反应的影响产生60,65和70°C是评估。每个温度测试20、30、50分钟,收益率在不同条件下的反应了图3。结果发现,65°C的反应是最有效的。收益率的反应是增加在60分钟时间从60到65°C。因此,得出的结论是,65°C的反应优化进行了30分钟。

方法验证

特异性

色谱获得特异性测试的任何干涉检查一公斤的保留时间。没有检测到干扰。因此被认为是特定的开发方法。

质/ MS测定,没有延滞问题是重复注射后观察到高浓度的一公斤。

线性和范围的方法(LOD和定量限)

LOD和定量限是100 ng / mL和ng / mL (RSD为4.9%)。该方法线性浓度范围的100 - 2500 ng / mL确定系数(R2)大于0.999。

精密度和准确度

结果的精密度和准确度进行了总结表3。内部和inter-day精度不超过7.58%,而精度不同的值在-1.98%和0.13%之间。开发的方法因此被认为是精确和准确。

复苏

每个浓度点的恢复值确定他们在71.36 - -89.65%的范围,计算精度值在每个点保持在3.01 - -1.12%,这意味着一公斤是一致的和精确的复苏。

鲁棒性和强度

Plackett-Burman实验设计的方差分析测试是用来确定每个因素对响应的影响。结果表明,所选变量对响应的影响不显著(p > 0.05)。换句话说,这个方法没有显著的变量对响应的影响。因此,该方法可以被认为是健壮和崎岖的关于变化检测研究中。

结论

拟议中的质/ MS方法很容易申请的识别和量化α-KG人血浆样品。质/ MS分析之前,一个简单的dericvatization方法成功应用甲基咪唑和咪唑的导数α-KG成立。获得导数检测与特征碎片(m / z 179和197)和质谱分析。实现了线性浓度范围的100 - 300 ng / mL。验证数据显示,发达的方法是具体的、精确的,准确的,健壮的广告的。

确认

作者感谢管理,IIBAT,提供必要的设施进行实验。

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