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菜单ISSN: 2319 - 9865
ISSN: 2319 - 9865
R Arunkumar1*,Olaganthan2,Nageswara饶2,V Sankar2,年代Gunasakaran2
1药理学系Chettinad医院和研究所Kelambakkam,印度泰米尔纳德邦- 603103。
2Azidus实验室有限公司、学校道路、Rathnamangalam Vandalur,钦奈- 600048,印度泰米尔纳德邦,。
收到:31/01/2013;修改后:07/02/2013;接受:19/04/2013
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头孢克肟是一种第三代头孢菌素对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌有效。它可以在固体和液体口服剂量100毫克,200毫克和400毫克。它是用于治疗呼吸道和尿路感染。在这项研究中,液体相色谱光谱测定方法对人血浆中头孢克肟。方法的量化范围是114.5033到9374.2050 ng / ml和方法验证为制药发展根据美国FDA标准。头孢氨苄作为内部标准。色谱和质谱条件和萃取过程进行了优化量化水平人血浆中头孢克肟的准确。所需100μL K3EDTA人类血浆样品处理。提取头孢克肟和头孢氨苄是由液液萃取和分离是通过反向阶段液体色谱法。特异性、选择性、基体效应、校准曲线精度、准确性、强度、复苏、稳定和稀释完整建立人血浆中头孢克肟。所有验证参数的方法满足验收标准,可以成功地应用于头孢克肟的人体药代动力学和生物等效性研究。高度敏感的生物分析方法和选择性估计头孢克肟的人血浆样品中含有的药物
头孢克肟,生物分析方法,方法验证,LCMS /女士
第三代口服头孢克肟是一种半合成头孢菌素有抗菌活性。化学,(6 r, 7 r) 7 - [2 - (2-Amino-4-thiazolyl) glyoxylamido] 8-oxo-3-vinyl-5-thia-1-azabicyclo 4.2.0 oct-2ene-2-carboxylic酸,72 - (Z) - [O -(羧甲基)肟]三水合。其分子量为507.50三水合形式和化学公式是C16H15N5O7年代2.3H2O。
图
头孢克肟的抗菌活性是由于抑制细菌细胞壁的合成。是积极的对革兰氏阳性和阴性细菌,如肺炎链球菌,酿脓链球菌、流感嗜血杆菌、莫拉克斯氏菌属复活,大肠杆菌、变形杆菌和淋球菌。
头孢克肟治疗简单的指示尿路感染中耳炎,咽炎,扁桃体炎,慢性支气管炎急性加重和简单的淋病。成人剂量400毫克/天,小儿剂量是8毫克/公斤/天管理在一个或两个分裂的剂量。
口服后,最大值血清浓度出现2到6小时为一个200毫克片剂、单400毫克平板或400毫克头孢克肟的悬架。最大的血清浓度出现2到5个小时后一个200毫克的悬架和3至8小时后口服单一400毫克胶囊。头孢克肟不是体内代谢和消除尿液中不变。健康受试者的血清半衰期是独立的剂型和平均3 - 4个小时1]。
本工作的目的是开发和验证一个特定的液相色谱-质谱/质谱(质/ MS)过程测定头孢克肟的人类K3EDTA(乙二胺四乙酸盐Tripotassium)支持生物等效性/生物利用度和/或等离子体药代动力学头孢克肟的研究涉及配方。
头孢克肟,分子量453.45 (2]
头孢氨苄,分子量347.389 (3]
正常的钾3EDTA等离子体、脂血症的hemolysed K3EDTA等离子体
114.5033到9374.2050 ng / ml
高效液相色谱与autosampler和柱温箱使用质谱检测器。
液液萃取100μl等离子体
100μL血浆样品转移到管子的标签。25μL内部标准(头孢氨苄10000.000 ng / mL在乙腈:水/ 1:1 (v / v)被添加到所有管除了管空白的标签。涡流之后,20毫米甲酸铵100μL补充道。然后2毫升的乙酸乙酯是补充道,涡30分钟在2000 rpm。管是离心机在4°C 4000 rpm 20分钟。有机层转移到适当的标记管子和蒸发在40°C 15 psi使用低容量蒸发器。样本重组1毫升流动相(乙腈:10毫米甲酸铵pH值4.15 [65:35 (v / v))。重组样本涡1分钟和样本转入350μL插入适当的标签自动取样器瓶。
下面的色谱条件。
¢列——Hypurity C18, 50 x 4.6毫米,5μ
一个¢流动相乙腈:10毫米甲酸铵pH值4.15 [65:35 (v / v)]
一个¢流量- 0.4毫升/分钟
一个¢Autosampler温度- 5ºC
一个¢柱温箱温度- 30ºC
一个¢注入体积- 15.0μL
¢运行时间- 3.5分钟
一个¢分析物的保留时间为2.2分钟,1.7分钟。
一个¢离子源- ESI +射流
一个¢极性——积极的
¢气体温度(ºC) - 300
¢气体流(1 /分钟)- 5所示
一个¢喷雾器(psi) - 50
¢鞘气体温度(ºC) - 300
¢鞘气体流(1 /分钟)- 10
一个¢毛细管(V) - 3000
一个¢喷嘴电压(v) - 1000
校准曲线是由8标准(std)以下浓度头孢克肟的ng / ml。性病1 - 114.5033,性病2 -229.0066,性病3 - 572.5164,性病4 - 1431.2911,性病5 - 3766.5556,Std 6 - 5380.7937,性病7 - 7686.8481和Std 8 - 9374.2050
四个水平的质量控制(QC)中使用了头孢克肟样本组成分析。
一个¢下限的量化QC (LOQQC) - 117.4614 ng / ml
一个¢低水平QC (LQC) - 355.9435 ng / ml
一个¢中间层QC (MQC) - 3786.6331 ng / ml
一个¢高水平QC(认证机构)——7498.2834 ng / ml
方法验证按照指南推荐的USFDA生物分析方法验证(4]。
代表的水标准溶液色谱图(分析物和内标),标准空白血浆,标准零与内部标准(空白),LOQQC, LQC、MQC和头孢克肟的认证机构和校准曲线所示图1 - 8。
图1:代表水样品的色谱图
图2:代表空白基质样品的色谱图
图3:代表空白基质样品的色谱内标(零样本)
图4:代表LOQQC样品的色谱图
图5:代表LQC样品的色谱图
图6:代表MQC样品的色谱图
图7:认证机构代表色谱样品
图8:代表校准曲线的回归分析
特异性和选择性进行评估通过分析共有六个大量的等离子体(4很多空白人类K3EDTA等离子体和每一个很多脂血症的发生溶血K3EDTA等离子体)获得独立的来源。没有观察到显著的干扰分析物的保留时间和很多的内部标准评估。分析物的干扰是6.22%和1.44%水样本。1.87%,分析物为3.59%,血浆样品。结果在可接受的范围之内的。
携带随着计算峰面积百分比在处理空白血浆注射后立即处理ULOQ(量化的上限)校准标准。没有继续观察分析物和内标。延续对分析物的比例是0。
co-extracted潜力矩阵分量影响探测器响应的分析物,是人类K3EDTA评估在四个独立的许多空白的等离子体和一个很多脂血症的发生溶血等离子体。
水标准相当于LQC目的和认证机构水平浓度以及内部标准浓度上升后提取空白矩阵。
每批的比例矩阵效果LQC分析物的浓度是1.70,8.29,-3.04,-1.78,-4.24和-1.04。基体效应比例在每批LQC浓度为-1.09,6.13,-2.54,-2.68,-3.14和-1.08。简历比例矩阵因子的分析物和内标LQC被发现分别为4.54和3.54。
基体效应的比例每批认证机构的分析物浓度为2.66,7.78,0.50,-0.52,0.85和-0.32。基体效应比例在每批认证机构浓度5.47,6.69,4.67,0.69,2.94和0.47。简历比例矩阵因子的分析物和内标LQC被发现分别为3.08和2.47。
基体效应的结果在可接受的范围内。
线性建立了准备了8个标准校准曲线在人类K3EDTA头孢克肟等离子体覆盖浓度范围从114.5033到9374.2050 ng / ml使用头孢氨苄作为内部标准。三个精密度和准确度(堵井)批次分析在这个范围内产生可接受的结果。校准曲线的计算是通过最小二乘线性回归分析的响应率(分析物/内部标准)的校准标准使用的权重因子为1 / X2。重新计算浓度头孢克肟的校准标准确定为每一批使用最佳回归曲线计算。头孢克肟校准线被证明是线性对所示图8。相关系数(r2)一直大于0.99验证过程中堵井批次。
来确定是否符合数据校正曲线加权或未加权的线性回归,的功能依赖的自然对数标准差分析物/内部标准面积比的自然对数样品浓度的评估。所使用的权重因子是1 / X2因为回归线的斜率(m) = 0.783。
分析物的LLOQ人类K3EDTA等离子体分析的基础上确定LLOQ精密度和准确度的验证批次。LLOQ 114.5033 ng / ml的确定方法。准确度和精密度的头孢克肟三堵井批次分别为102.86和2.60%,分别是在可接受的范围之内。
检测极限成立的分析解决方案的已知和减少药物的浓度最低可检测水平。头孢克肟的检测极限是7.1565 ng / ml的这种方法。
头孢克肟Inter-batch校准标准精度从106.70%至92.74不等inter-day精确值的0.73 - 2.38%的过程中验证证明可接受的线性分析。相关系数(r2)一直大于0.99。头孢克肟校准曲线代表人类K3EDTA等离子所示图08年。并给出了细节表1。
表1:重新计算校准曲线浓度分析物和内标
测定精密度和准确度(国米批处理和批内)值测定精密度和准确度在三个批次通过分析六个复制每个LOQQC LQC、MQC和认证机构在每一批样品。不同分析的精密度和准确度进行批次不同的列,以确保强度的方法。
测定的准确性被定义为之比的绝对值的平均值计算质量控制样品各自的名义值表示为百分比。
表2:头孢克肟的批内精密度和准确度
表3:Inter-Batch或头孢克肟的精密度和准确度
的内部批头孢克肟的准确性LOQQC范围从93.92到104.51%,LQC从92.42到98.81%,MQC认证机构从100.09到106.57%,从92.05到100.64%。
国米批头孢克肟的准确性LOQQC被发现和LQC, 99.70% 96.39%。对于MQC和认证机构,分别是96.34%和102.89。
测定的精度是衡量比例系数的变异LOQQC的浓度范围,LQC、MQC和头孢克肟的认证样品的过程中验证。
在批处理精度为LOQQC头孢克肟的范围从2.05到4.70%,LQC从1.01到2.11%,MQC认证机构从1.43到3.32%,从1.19到1.81%。
头孢克肟的总精度LOQQC被发现和LQC 5.70%, 3.46%。MQC,认证机构分别持股3.56%和4.00%。
头孢克肟的复苏是由探测器响应的比较分析物提取的三个不同的水平低、中、高质量控制样品与探测器响应来自unextracted水质量控制样品。头孢克肟的平均回收率为66.66%。
的恢复是由提取的平均探测器响应的低,中等和高质量控制样品与平均探测器响应来自unextracted水质量控制样品。意味着复苏的内部标准是80.14%。变异系数(CV)的内部标准溶液提取的1.70%和2.06%,分别。
头孢克肟的六个复制样品LQC和认证机构集中在人类K3EDTA等离子体三个冻融循环后进行了分析。存储的样本和测试在两个温度,一个低于-70ºC,另以低于-20ºC。稳定性是由计算百分比名义LQC和认证样品刚做好的校准曲线的标准并与批量对比样品。
稳定性样品的平均名义百分比计算与刚做好的CC LQC认证机构和浓度都低于-70ºC和低于-20ºC 93.47与93.50%、92.11和90.34%,分别。稳定性样品的平均百分比名义与比较样本相比LQC和认证机构水平低于-70ºC和低于-20ºC 98.18与101.47%、96.75和98.04%,分别。结果在可接受的范围内三个冻融循环。
头孢克肟的板凳上稳定在人类K3EDTA等离子体是在室温下进行。六个复制LQC和认证机构的样本处理后保持样品台06小时31分钟。板凳上稳定评估通过计算百分比名义LQC和认证机构对刚做好的校准曲线并与对比样品。
台式的平均百分比名义稳定性样品计算与刚做好的CC LQC和认证机构水平分别为92.51%和92.88,分别。稳定性样品的平均百分比名义与比较样本相比LQC和认证机构水平分别为97.56%和100.40%,分别展示了可接受的桌上型稳定在室温下至少6小时31分钟。
六复制LQC和认证样品加工的堵井批次完成分析后被保留并保持存储在自动取样器在08°C 11小时32分钟。自动取样器稳定性决定反对刚做好的校准曲线的标准和比较反对大部分比较样品LQC和认证机构的水平。自动取样器的平均百分比名义稳定性样品计算对刚做好的CC LQC和认证机构在08年11小时32分钟后°C 94.34和95.21%,分别。稳定性样品的平均百分比名义与比较样本相比LQC和认证机构水平分别为103.33%和99.10,分别展示接受自动取样器稳定至少11小时32分钟分钟在08°C。
六个复制LQC和认证机构加工和重组。他们转移到注射器瓶,在室温放置6小时52分钟。样本注射后6小时52分钟和分析对样品刚做好的校准曲线的标准和比较。
湿法提取稳定计算样本的平均百分比名义对刚做好的CC LQC和认证机构06小时52分钟后96.38和96.57%,分别。稳定性样品的平均百分比名义LQC和认证机构相比,比较样本被发现是101.24和104.81%,分别展示接受湿提取稳定在室温下至少6小时52分钟。
六个复制LQC和认证机构加工和重组。样品被转移到注射器瓶放置了23小时07分钟2 - 8°C。样本注入后23小时07分钟和分析对样品刚做好的校准曲线的标准和比较。
湿法提取稳定计算样本的平均百分比名义对刚做好的CC LQC和认证机构23小时07分钟后96.81和93.46%,分别。稳定性样品的平均百分比名义LQC和认证机构相比,比较样本被发现是101.69和101.43%,分别展示接受湿提取稳定在室温23小时7分钟。
分析物的稳定性,是被暴露评估股票的解决方案所需的时间。所需的存储期完成后,样品分析和稳定性样品和刚做好的解决方案的结果进行比较。百分比稳定存储股票分析物06小时21分钟后为100.31%
百分比稳定存储的是06年小时21分钟后为99.19%
CC, LQC和认证机构堵井的一个批次样品吸收和再现性分析。比例为LQC名义,MQC头孢克肟和认证机构为96.54,104.42和99.63%,分别。LQC百分比的简历,MQC头孢克肟和认证机构为2.97,1.17和1.22%。
强度是评价的精度和准确性由不同的分析师组成的6批处理复制LOQQC的QC样品LQC、MQC和认证机构的水平。
意味着LOQQC精度,LQC、MMQC MQC和认证机构分别为111.68%,91.20%,94.37%,分别为107.14%和102.27%。精度LOQQC、LQC MQC和认证机构分别为11.44%,2.70%,5.73%,分别为1.68%和11.17%。
头孢克肟样本准备在人类K3EDTA等离子体在2倍浓度的高质量控制样品和稀释2倍和4倍与人类K3EDTA等离子体。头孢克肟的名义比例为2倍和4倍稀释92.46和99.43%,分别。
头孢克肟bio-analytical方法量化人力等离子体的范围114.5033 - 9374.2050 ng / ml被成功验证。此法适用于样本分析支持Bio-equivalence /生物利用度(BA /是)和/或涉及头孢克肟的配方的药代动力学研究。方法是非常具体的,有选择性的、精确的、准确的,崎岖的和可再生的人血浆中头孢克肟的估计。
作者真诚地感谢Azidus实验室有限公司,金奈的批准进行研究。