研究和评论:微生物学和雷竞技苹果下载生物技术杂志》上
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P - ISSN: 2347 - 2286
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1Sri Venkateswara大学微生物系Tirupati 502 - 517。印度安得拉邦
2植物学、斯里兰卡Venkateswara大学Tirupati 502 - 517。印度安得拉邦
收到日期:2013年2月19日接受日期:2013年3月02
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新的兼性alkaliphilic杆菌物种隔绝云母矿山市辖区内的安得拉邦,印度。这个菌株革兰氏阳性杆状的,能动的细菌能够增长在有氧条件下pH值12.0表现出最优增长pH值10.0。氧化压力,过氧化氢酶阳性,脲酶阳性,能水解淀粉,明胶,能利用乳糖,D -葡萄糖和蔗糖并产生酸。它还将硝酸盐转化为亚硝酸盐。此外,表现出积极的结果对甲基红和Voges Proskauer反应。压力显示最优增长0.5%氯化钠甚至能够茁壮成长的蔗糖浓度更高。16 s rDNA序列显示,99%相似与芽孢杆菌sp19 (HQ433576)和最近的亲戚是杆菌amyloliquifaciens (JN086147)。的效率这一毒株不溶性钾溶解的云母在体外评价。修改Alexandrov中补充了0.1%的云母粉是用于调查的钾溶解活动芽孢杆菌spSVUNM9压力。最后的pH值、总酸度、可溶性钾含量和释放有机酸测定在文化媒体经过21天的孵化。K含量增加到2.5倍的控制。 Mineral potassium solubilisation was directly related to the pH drop by the strain. The analysis of the culture medium by high pressure liquid chromatography identified gluconic acid as the main organic acid released by Bacillus sp.SVUNM9.This study is the first report on the isolation and characterization of native potassium solubilising bacteria from mica ore.
兼性、alkaliphile杆菌spSVUNM19、云母核心,16 s rRNA、钾溶液化
Alkaliphiles一类extremophilic微生物,表现出的能力增长pH值为9.0以上。alkaliphiles已经取得了丰富的产品,适用于工业规模[1]。产品工业重要性已经商业化的alkaliphiles洗涤剂和食品领域的行业。不值得,工业生产的产品,从alkaliphiles远远不足以满足需求。真正alkaliphiles大体上pH值为9.0,显示以上生长最佳生长在pH值为10.0。尽管存在相当大的多样性在alkaliphiles但更多的从未知的区域仍有待挖掘。小说alkaliphiles Bioprospection从未知的栖息地为特定产品是否适合广泛的植物形式技术可以提供环境友好和具有成本效益的解决方案。
本研究旨在分离和描述alkaliphilic细菌与云母钾soluilizing属性核。云母是一个复杂的矿物分为一个硅酸铝,但发生在结合一个或多个元素,如钾、钠、镁、锂、钒和铁。在安得拉邦富裕存款市辖区内的云母是可用的。云母带躺在经度纬度140 - 001和150 - 001和790 - 351和800 - 001。Nellore云母的化学属性中列出表1。
表1:云母矿的化学成分
尽管云母的具有酸性环境pH值为5.6,这是一个很好的来源alkaliphiles多样性在41%(数据没有提交)。另一方面迄今为止没有报告这些微生物在云母内核。这是第一个报告关于alkaliphilic杆菌物种从云母矿。
云母是主要K-bearing矿物之一。进一步的钾氮磷钾三要素之一,植物的生长和繁殖所必需的。然而最大的“K”部分土壤中不溶性岩石、矿物质和其他形式。微生物可以提高矿物溶解率由产品生产和排泄代谢与矿物表面[2]。研究记录了“K 'release硅酸盐矿物的降解细菌(3、4)。由于农业的快速发展K-defiency成为印度主要土壤[5]。印度的肥料协会在2007年报道,印度在钾肥消费排名第四。整个消费的钾肥进口钾肥的形式和硫酸钾肥导致巨大的外汇。在这种背景下识别替代土著K来源是至关重要的。因此本研究旨在分离和描述土著与增溶的潜在存在于云母钾细菌可耕种的核心。
孤立的微生物
微生物分离得到云母核心从Utukur mandal, Gudur部门Nellore Dt。印度安得拉邦,通过以下方法。云母核分裂成碎片使用无菌分割和使用无菌粉研钵和研杵。这细粉被分发到0.85%氯化钠溶液和孵化2小时轨道振动器在28°C。后来这种悬架放在trypticase大豆琼脂pH值10和孵化37°C为4天。
殖民地的选择
殖民地文化特征的基础上,选择喜欢的形式,海拔,边缘和纹理。目前研究孤立M9被选中,有几次Trypticase大豆琼脂和净化。深造纯化殖民地甘油保存在20%股票和储存在-20°C。
孤立的形态和表型鉴定
植物细胞的形态,孢子囊孢子的形状和位置显微镜下观察(奥林巴斯)使用水下100 x放大。除了下面的表型进行了测试。活性,过氧化氢酶,Voges-Proskauer测试,甲基红试验、气体和酸生产乳糖、葡萄糖和蔗糖和硝酸盐还原,形成吲哚、硫化氢生产、柠檬酸利用[6]和明胶液化。退化的尿素、淀粉和纤维素进行测试根据以前报道的方法[7,8]。
DNA提取和序列测定
基因组DNA是使用奥苏贝尔的方法分离出纯细菌菌落et al ., (1995) [9]。16 s rRNA基因是使用通用引物扩增。(向前“5 'cag CAG 20 CGG TAA TAC 3 '和扭转“5”——ACG GGC GGT GTG TAC 3 ')。放大产品受到1.5%的琼脂糖凝胶电泳。1.4 Kb产品从凝胶中提取使用硅胶柱和测序。由此产生的DNA序列提交到冗余核苷酸数据库在基因库使用基本的局部比对搜索工具(爆炸)计划来确定它的识别。
序列分析
多个M9分离序列的比对和近亲使用生物编辑序列比对编辑器进行[10]。序列相似性计算的百分比之间的隔离和其他近亲属使用Clustal W项目[11]。系统发育树构建使用邻居加入方法使用phylip版本3.67程序套件[12]。
经济增长研究
增长进行了化验使用trypticase酱油汤。分析pH值公差100摩尔/ 1醋酸钠,磷酸钠和碳酸钙用于调整pH值,分别为9、10、11和12。耐盐测定添加不同数量的生理盐水(0.5%、5%和10% (w / v))在pH值10 trypticase酱油汤。温度对微生物生长的影响,研究了在30°C, 40°C, 50°C和60°C Trypticase酱油汤在pH值10。
分析渗透压力(公差)在不同浓度蔗糖(0.5% 15%和60% (w / v))成立在介质pH值10。
钾溶解试验
芽孢杆菌菌株接种到修改Alexandrove的介质组成5.0 g / l[13]蔗糖;磷酸氢二钠(Na2HPO4) 2.0 g / l;硫酸镁(MgSO4.7H2O) 0.5 g / l;氯化铁(FeCl3) 0.005 g / l;碳酸钙(碳酸钙)0.1 g / l;云母粉(不溶性钾源)1.0 g / l;蒸馏水1000毫升;介质的pH值调整到7.0使用稀酸或碱。除了云母ingradients都溶解在1000毫升蒸馏水,然后云母粉是补充道。烧瓶是插在1200 c与棉花和消毒和0.1 mpa在高压釜20分钟。 To this sterilized medium 1ml Bacillus SVUNM9 culture was added and incubated for 21days on a shaker at 180 rpm. After 21 days of incubation, the cultures were filtered through 0.2μm membrane filter and pH was directly measured by pH meter. The total acidity of the culture media was determined according to the method described by Helrich (1990)[14]. The K content in the digested solutions was measured using the induction coupled plasma Optimal Emission Spectroscopy (ICP-OES Optima 4300 DV, Perkin Elmer).
有机酸的分析
有机酸在文化过滤的液体是由高效液相色谱分析高效液相色谱法(休厄尔帕卡德1050)与ODS柱(200毫米,4.6毫米,50米)。0.1%的操作条件包括H3PO4为流动相探测器,VMD (210 nm)和恒流量1.0 ml / m - 1 pH值调整到2为磷酸和有机酸提取50 ul注射,有机酸,通过比较测定的色谱保留时间和峰地区的标准。有机酸标准包括葡糖酸、醋酸、柠檬酸和苹果酸。
微生物隔离
细胞悬液放置在碱性介质。孵化后的各种隔离隔离M9入选本研究。根据形态和生理特征属于芽孢杆菌属。显微观察结果表明,微生物孢子形成,革兰氏阳性棒。他们表现出对过氧化氢酶阳性结果,甲基红,Voges Proskauer反应,硝酸还原,利用葡萄糖、乳糖、蔗糖水解的淀粉、明胶、尿素和吲哚柠檬酸生产和无法代谢负(表2)。
表2:M9隔离的生理生化特征
16 s rDNA序列分析
基因序列一致,比较它们之间的序列10相关类群从公共数据库来确定其系统发育地位。在分类学上M9应变集中在rRNA i组系统发生的集团的定义为芽孢杆菌属和占领系统发育地位密切相关杆菌sp 19(加入创银行没有。HQ662601)。的16 s rDNA序列相似性值云母隔离M9杆菌sp.19为99% (表3)。
表3:显示对齐视图使用基因库和RDP数据库
经济增长研究
为了确定pH值对微生物生长的影响,隔离在孵化pH值7,9、10、11和12所示。虽然应变能增长pH值7,最优增长是观察到酸碱10和极端碱性条件像12增长下降(图1)
图1:增长的M9隔离在不同的氢离子(pH)浓度
隔离M9能够从10ºC 55ºC的最佳44ºC。微生物生长的氯化钠浓度高达10% (w / v)和应变能忍受渗透压力的15% (w / v)蔗糖。表4总结了在不同实验条件下的应变增长属性
表4:盐度的影响,渗透压力和温度对增长的M9云母隔离
钾溶解试验
的钾溶解试验进行确定alkalophilic杆菌sp, NMM9(基因库加入金桥9221141)不溶性云母矿物。相比一般的pH值控制接种媒体补充与不溶性云母pH4.8进而增加总酸度降低培养基。% K释放是培养基的40%。芽孢杆菌产生的有机酸中葡糖酸含量(313 ng / l)比其他高酸。这到处都是观察到的硅酸盐增溶的属性(表5)。
表5:表明钾溶解试验的结果
芽孢杆菌物种是主要的工业微生物的重要作用可以追溯到一千多年[15]。不同种类的芽孢杆菌的发酵在不同pH值和温度使得科学家们各种商业酶的发展,产品所需的温度使得科学家各种商业酶产品的开发与所需的温度,pH值活动和稳定特性来解决一个巨大的各种各样的特定的应用程序。在这项研究中从云母芯隔离M9被隔离。这一毒株被确认为杆菌物种与杆等典型的表型特征形状和形成孢子的能力[16]。16 S rDNA序列分析显示,孤立的近亲Bacllus sp.19(加入基因库No.HQ662601)。尽管杆菌。Sp19and M9隔离16 s rDNA相似性值表明它是应变99%相同的类型。然而有一些差异在生理特征。
云母矿山杆菌sp.产酸发酵的一些碳水化合物。属性修改pH值是一个重要的特点。尽管云母具有酸性环境这一毒株能够生长在碱性条件下和修改pH值接近中立。同样的几个作者称alkaliphiles的隔离酸性环境[17]。
芽孢杆菌。sp综合商业上重要的酶如淀粉酶、脲酶脂酶,几丁质酶和蛋白酶浸膏酶的能力活跃在碱性pH值在生物技术的应用程序可能是有利的。一些酶表现出最佳pH值活动9或在碱性条件下稳定(18、19、20、21)。据报道,当细胞的兼性alkaliphiles生长在中性酸碱接触碱性酰胺酶被激活,细胞壁水解[22]。然而,当兼性alkaliphiles增长碱性pH值,细胞壁变厚并显示增加负电荷适时保护细胞免受碱性环境[23]。内部pH值维持在8左右,尽管8到11外部pH值高,因此在碱度的一个关键特性是与细胞表面相关歧视和维护细胞内神经环境独立于细胞外的碱性环境[24]。在这项研究alkaliphile孤立于酸性环境这可能是因为地下云母矿alkaliphilic口袋的存款。
一般杆菌菌株显示变量在硅酸盐矿物溶解性程度的代谢效率,我们的结果也表明,“K”释放云母被孤立的应变Bacillus.sp显著增强,NMM9。矿物学和矿物的化学成分可能决定他们对微生物的易感性和硅钾动员(25、26)。pH值下降导致总酸度增加不是唯一原因释放的可溶性k .溶解矿物质是通过生产含有有机酸的代谢产物的活性成分(27 28 29)。过程通过直接氧化途径,革兰氏阴性细菌大多是涉及,有机酸生产的周质很容易扩散到相邻的环境中,随后溶解不溶性形式的矿物质如钙磷酸盐[30]能力的隔离,以减少生长介质的pH值被视为中等酸化[31]。而那些溶解水不溶性K被认为在高质量生产有机酸的能力尤其是葡糖酸。本研究首次提供了信息杆菌居民在云母矿石。
这个结果提供信息自主alkalophilic云母与潜在的居民钾使溶解能力将biogeocycling具有广泛的应用前景,结合德兴铜矿,生物降解的外源性物质,无机化能营养和biomineralizer农业。
这项研究工作得到了格兰特从大学拨款委员会(UGC),新德里。
