研究和评论:微生物学和雷竞技苹果下载生物技术杂志》上
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P - ISSN: 2347 - 2286
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Vijayakumar Arul床铺1,Murugesan Subban2*,Jayapal Jmbulingam3,Panneerselvam Annamalai3,Kalaichelvan PT1
1圭因迪校园,高级研究中心植物学、马德拉斯大学600025年钦奈,印度泰米尔纳德邦,
2Periyar大学植物学系Periyar Palkalai Nagar,萨勒姆- 636011,印度泰米尔纳德邦,
3植物学和MicrobiologyA.V.V。米斯Pushpam学院(自治),Poondi 503 - 613。Thanjavur (Dt),印度泰米尔纳德邦,
收到日期:03/12/2013;接受日期:30/12/2013
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细菌表现出细胞外从石灰石土壤过氧化氢酶活性被隔离。过氧化氢酶是一个重要的组成部分,与氧化应激细胞应对。这项研究由板处理简单的检测方法测定过氧化氢酶活性的细菌不动杆菌calcoaceticus AV-6。快速检测方法需要镀上的浮在表面的衬底与染料结合琼脂。这个试验给了结果在60年代,生产区域。这种酶提取固定相在36 h。蛋白质的分子量决定是大约60 kDa。测序研究进行了应变不动杆菌calcoaceticus AV6部分测序。结果意味着这个行业的检测方法的重要性。
石灰石土壤过氧化氢酶、过氧化氢、钾铁氰化物,氯化铁
酶已被隔绝广泛的原核和真核微生物1]。过氧化氢酶快速进化的有效分解过氧化氢和氧气和水(2]。根据酶细菌的过氧化氢酶的性质分为三类;heme-containing单功能的过氧化氢酶,heme-containing双官能catalase-peroxidases, non-heme-containing过氧化氢酶(3]。自1990年以来的过氧化氢酶四聚体由子单元描述每个含有血红素辅基的分子质量从220 - 270 kDa。多个过氧化氢酶被发现在几乎所有的细菌物种,包括枯草芽孢杆菌(4和大肠杆菌5]。曾有一些报道说对过氧化氢酶的嗜盐菌(6,7],嗜热菌[8),和它们9,10]。
过氧化氢(H2O2)商业在纸等行业,半导体、食品、纺织工业漂白,由于其强大的氧化剂作为杀菌剂的代理活动。然而,由于其毒性对环境和人类健康,必须消除过氧化氢后从工业过程。因此,利用过氧化氢酶在这些工业部门消除过氧化氢(12]。
样本收集和筛选
从1厘米深度收集土壤样本的帮助下无菌抹刀在无菌塑料袋从石灰石地区Kovil帕蒂(77.9经度和纬度9.2。)在泰米尔纳德邦。收集土壤样本被带到实验室和0.25克样品称重和悬浮在25毫升Luria Bertani肉汤培养基和培养1小时轨道瓶30ºC。,0.2毫升样品Luria琼脂板上扩散,孵化30ºC 24 - 48 h (12]。
多个细胞殖民地检测过氧化氢酶活动通过添加0.003% H2O2(默克公司)和氧代视觉估计(13];高度活跃的殖民地被选中,亚文化。重复这个过程,直到一个殖民地是孤立的。孤立的殖民地(AV-6)子培养在Luria Bertani琼脂培养基pH值在7.2在25°C 24 h和进一步受到酶试验。这种文化是保持Luria Bertani琼脂斜面在4ºC进行进一步的实验。
鉴定的菌株
鉴定菌株AV6是由16 s核糖体RNA基因测序。部分核糖体基因的DNA片段PCR扩大了使用意识和反义底漆(转发:5“aga GTT TGA太极拳TGG CTC AG-3的逆转:5 'acg GCT ACC TTG TTA CGA CTT-3”)因此部分900个基点测序和基因银行提交。(加入没有HM130705)
文化条件
细菌培养是描述(14)修改蛋白胨的LB培养基含有1.0克,0.5 g的牛肉膏和0.5克氯化钠100毫升蒸馏水(10毫升preculture 1000毫升)在2 l Haffkine烧瓶内,在200 rpm轨道瓶30ºC。文化是收获结束时固定(36小时)阶段。然后收获文化是通过离心收集在12000 g×15分钟在4°C,上层的收集。然后收集到的浮层被认为是作为进一步研究原油提取和储存在4ºC。
酶测定
使用浮在表面的酶进行分析。过氧化氢酶活性是通过测量吸光度转换期间H2O2氧气和水(15]。Catalase-catalyzed分解H2O2监控的减少在240 nm的吸光度,利用消光系数39.4 M-1cm-1。生成的活动是使用标准曲线计算不同浓度的H2O2监控在240海里。一个单位的活动得到的酶催化了消费1μmol H2O2每分钟(16]。
为catalase-Plate试验方法确定的测试
两克琼脂添加到100毫升蒸馏水(2%)在一个锥形瓶,煮,直到完全溶解。熔融琼脂3%的H2O2默克(30%)补充道。agar-H约20毫升2O2混合物被倒在Petriplate并保持10分钟。威尔斯无聊使用无菌软木钻孔机和50μl样本中加载。板块在孵化28ºC 6 h无菌。
新的解决方案(染色溶液)含2%每个K3铁(CN)6和FeCl3.6H2O在30毫升无菌蒸馏水。包含样本培养皿充斥着染色的解决方案。培养皿稳步动摇,直到一个绿色的颜色出现了,染色溶液干涸,冲洗和装满蒸馏水17]。
聚丙烯酰胺凝胶电泳法
过氧化氢酶活性染色
非变性不连续凝胶电泳进行10%的聚丙烯酰胺凝胶没有十二烷基硫酸钠(SDS)和β-mercaptoethanol (18)。蛋白质乐队与考马斯亮蓝染色- 250。过氧化氢酶乐队被染色使用过程的可视化伍德伯里et al .(19)与10每口井的原油μl过氧化氢酶。乐队是由格里高利的过程和Fridovich(20)对过氧化氢酶活性。2.6.2 SDS - PAGE电泳
SDS-gel电泳运行所描述的拉姆勒(21)。包含10%的丙烯酰胺和聚丙烯酰胺凝胶0.1% SDS装满5到10μl粗蛋白样品的处理5%的2-mercapto-ethanol和2% SDS 10分钟100°C。蛋白质染色与考马斯亮蓝r - 250执行。
观察结果的过氧化氢酶活性上层清液,3中盘子被一个作为控制另一个包含原油样品和第三个包含部分纯化酶样品浓缩50μl文化的上层清液分别装载在7毫米。(图1所示。a、b&c)。6小时孵化后,30毫升2%的钾铁氰化物和氯化铁的混合物被孵化板上几秒钟,观察5厘米直径的区域。
图1:。控制,b。区域显示原油的过氧化氢酶活性在50µl样本,c。区显示过氧化氢酶活动50µl原油冻干样品
当本机凝胶运行相同的样本检测基于板试验(图2所示。b),SDS页面运行检查蛋白质的存在与考马斯亮蓝染色- 250 (图2 c)。图2是标准的蛋白质标记Geni从班加罗尔2.5 lμ)。
图2:5。蛋白质标准标记µl从班加罗尔精灵,b。显示蛋白质的存在区间过氧化氢酶在SDS页彩色c。本地页面上显示过氧化氢酶带的存在使用铁氰化物负染色剂染色
这是第一次报告的一个方便和快速分析检测由细菌细胞外过氧化氢酶生产(不动杆菌sp AV6和其他细菌)。虽然微生物过氧化氢酶是研究只有少数数据从极端微生物的酶的报告。此外板试验方法已经报道了蛋白酶等酶(48 h(孵化)(22),脂酶(48 16 h) (23)和polyurethanases (18 - 20 h) (24]。
但是我们现在的研究表明,过氧化氢酶检测结果板的试验方法(30 C 6 h)举办我使用这种方法量化了过氧化氢酶(数据没有)。
板试验方法是本地副本页染色法(14),它使用氯化铁铁氰化钾的2%和2%。氯化铁(高pH值)底物结合H2O2产生一个深绿色的颜色。另一方面,酶分解H2O2到H2O, O2,因此染料无法绑定到该地区周围,产生间隙区域内1 - 2分钟。
这种方法还允许文化上层清液中酶活性的量化关系的直径间隙区。因此这份报告是一个创新的和快速的方法检测和量化细胞外过氧化氢酶的细菌。
这项研究发现同时允许筛选多个生物工业用途。这种方法使我们能够想象和比较多种生物的酶的活动同时公约的泡沫相比,方法必须单独完成比较活动。它还允许快速量化的过氧化氢酶酶不使用传统的分光光度法,因此是更有利的和廉价的方法检测过氧化氢酶的酶产生菌。这种方法将有用的行业中筛查过氧化氢酶经常使用传统的方法。
我感谢大学大委员会提供的金融支持为研究Maritorial奖学金的形式。
