高效液相色谱(HPLC)技术综述

摘要

色谱法被定义为一套用于分离混合物中的成分的技术。该技术包括两个阶段固定阶段和流动阶段。组分的分离是根据两相的分配系数的差来进行的。色谱一词来源于希腊单词chroma(颜色)和graphein(书写)。色谱法是一种非常流行的技术，主要用于分析。有不同类型的色谱技术，即纸张色谱法、天然气色谱法，液体色谱法，薄层色谱法(TLC)，离子交换色谱法最后高性能液体色谱法(高效液相色谱)。本文主要综述了高效液相色谱技术的原理、类型、仪器仪表和应用。

关键字

色谱，流动相，固定相，分析物

介绍

高性能液体色谱法也被称为高压液相色谱法。它是一种流行的分析技术，用于分离，鉴定和定量的混合物的每个成分。高效液相色谱法是一种先进的柱状液相色谱技术。溶剂通常在重力作用下流过色谱柱，但在高效液相色谱技术中，溶剂将在高达400个大气压的高压下流动，以便借助相对亲和性的差异将样品分离为不同的成分[1-7]。

在高效液相色谱(HPLC)中，泵将用于将包括样品混合物在内的加压液体溶剂输送到充满固体吸附剂材料的柱中。各样品组分之间的相互作用是不同的，这就造成了各组分流速的差异，最终导致了色谱柱组分的分离。

色谱可以描述为包括吸附在内的质量交换过程。高效液相色谱依靠泵使加压流体和样品混合物通过一个装有吸附剂的部分，从而促使样品段的划分。吸附剂的动态部分通常是由2 μm至50 μm大小的固体颗粒(如二氧化硅、聚合物等)制成的颗粒状材料。示例混合物/混合物的段彼此隔离，因为它们与保留颗粒的不同连接程度。加压流体通常是溶剂(例如水、乙腈和/或甲醇)的混合物，被称为“流动相”。它的组织和温度通过影响样品段和吸附剂之间的连接在划分过程中起着重要作用[8-15]。

高效液相色谱法是从传统的(“低重量”)液相色谱法中识别出来的，因为操作压力基本上更高(50 bar到350 bar)，而普通液相色谱法通常依赖于重力的力量来通过便携式段。由于在科学高效液相色谱中分离的样品量小，柱截面测量的距离为2.1 mm至4.6 mm，长度为30 mm至250 mm。此外，HPLC片段由更小的吸附剂颗粒(正常分子大小为2 μm至50 μm)制成。这使得HPLC在分离混合物时具有很高的测定或分辨能力(识别组分的能力)，这使其成为一种突出的色谱方法[16-25]。

历史

之前的HPLC研究人员使用标准液相色谱方法。由于溶剂的流动速率依赖于重力，液相色谱系统是低效的。分开要花好几个小时，有时甚至要花好几天。气相色谱法(GC)在当时比液相色谱(LC)更有效，在任何情况下，相信气级划分和研究极极性高原子量的生物聚合物是不可能的。由于溶质的热不稳定性，气相色谱对一些有机化学家来说是无效的。因此，人们提出了替代技术，这些技术将很快推动高效液相色谱技术的发展。

在Martin和Synge 1941年的原始工作之后，卡尔·吉丁斯(Cal Giddings)、约瑟夫·胡贝尔(Josef Huber)等人在20世纪60年代预测，通过将压下分子测量大大降低到常规LC(和GC)水平150 μm以下，并利用压力扩大通用级，可以在高熟练模式下工作LC速度。这些期望在60年代到70年代经历了广泛的实验和改进。早期的开发探索开始于LC颗粒增强，外透分子Zipax的创新为高效液相色谱技术提供了广阔的应用前景。20世纪70年代在设备和仪器方面取得了许多进步。专家们开始使用泵和注射器来制作一个简单的HPLC系统配置。气体放大泵是完美的，因为它们在一致的压力下工作，不需要释放自由密封或止回阀，以实现稳定的流量和良好的定量。

虽然仪器的进步是重要的，但HPLC的历史背景主要是关于分子技术的历史和发展。在可渗透层颗粒出现后，减小分子尺寸以提高效率已成为一种稳定的模式。然而，随着分子尺寸的减小，新的问题出现了。缺点是不必要的压降，预计将驱动多种液体通过段和麻烦建立一个均匀的压制到很大程度的细材料。每当分子的大小完全减小时，通常应该进行另一轮仪器进步来处理压力。

操作

待分离和解剖的样品共混物以离散的小体积(通常为微升)进入流经色谱柱的流动相流中。样品的片段以不同的速度穿过片段，这是与吸附剂特殊物理连接的组成部分(同样称为静止段)。各组分的速度取决于其复合性质，流动相的组成。特定的分析物洗脱(从色谱柱中上升)的时间称为其保留时间。在特定条件下测量的保留时间是给定分析物的区分正常值[26-36]。

各种各样的色谱柱是可用的，装载不同分子大小的吸附剂，在其表面的性质(“表面科学”)。小分子包装材料的利用需要利用较高的操作压力(“背压”)，并定期增强色谱决议(即序列分析物之间从列中上升的划分程度)。吸附剂颗粒在性质上可能是疏水的或极性的。所使用的基本流动相包括与不同天然溶剂(最广泛认可的是乙腈和甲醇)的任何可混溶混合物。一些HPLC系统使用无水流动相。流动相的水段可含有酸(例如，甲酸、磷或三氟乙酸腐蚀性)或盐，以帮助分离样品组分。在色谱检查过程中，流动相的组成可以保持不变(“等距洗脱模式”)或改变(“倾斜洗脱模式”)。等容洗脱通常能成功地分离在固定阶段倾向上没有完全不同的样品组分。在梯度洗脱中，流动相的组织通常从低到高的洗脱质量波动。流动相的洗脱质量由分析物的维护时间来反映，洗脱质量高，洗脱速度快。

流动相(又称洗脱液)的选择结构取决于不同样例部分(“分析物”)和固定阶段之间的连接力(例如，旋转阶段HPLC中的疏水连接)。根据他们对固定阶段和移动阶段的偏爱，分析了两者之间的划分。在样品分离过程中发生。这个过程就像在液-液萃取过程中发生的一样，但是是连续的，而不是逐步的。在这种情况下，利用水/乙腈角度，一旦流动阶段在乙腈中填充得更多(即处于更高洗脱质量的多功能阶段)，更多疏水部分将在较晚的时间内洗脱(从色谱柱上脱落)[37-45]。

仪表

HPLC仪器包括泵、进样器、色谱柱、检测器、积分器和显示系统。在列中发生分离。包括:

•溶剂水库:流动相的内容物存在于玻璃容器中。在高效液相色谱中，流动相或溶剂是极性和非极性液体组分的混合物。根据样品的组成，极性溶剂和非极性溶剂会有所不同。

•泵:泵从溶剂储层中抽吸流动相，将流动相强制输送到色谱柱，再输送到检测器。42000kpa为泵的工作压力。这个操作压力取决于色谱柱的尺寸、粒径、流速和流动相的组成。

•样本注入器:该注射器可以是单独注射或计算机化注射框架。用于HPLC框架的注射器应在0.1 mL至100 mL的体积范围内，在高重复性和高压(高达4000 psi)下输液。

•列:柱通常由清洁的不锈钢制成，长度约为50毫米和300毫米，向内距离约为2毫米和5毫米。它们的分子尺寸一般为3 μm ~ 10 μm。内径< 2mm的柱通常被称为微孔段。在研究过程中，流动相和色谱柱的温度最好保持一致。

•检测器:位于色谱柱末端的高效液相色谱检测器将分析物从色谱柱中洗脱出来。常用的检测器有紫外光谱、荧光、质谱和电化学标识。

•数据收集设备或集成商:来自检测器的信号可以在图形记录仪或电子积分器上收集，这些积分器在多方面的质量和处理、存储和再处理色谱信息的能力上波动。PC机将指示剂的反应与每个部分进行协调，并将其放入难以解释的色谱仪中。

HPLC仪器的原理图通常包括采样器、泵和定位器。采样器将样品带入流动相流，流动相流将样品输送到色谱柱中。泵通过柱输送流动相。检测器生成一个相对于从段中上升的样本分量测量的符号，因此考虑到示例部件的定量调查。计算机化的微芯片和软件控制高效液相色谱仪器并提供信息数据。在高效液相色谱仪器中，几个型号的机械泵可以将多种溶剂按比例随时间变化组合在一起，在便携式阶段产生一个合成斜坡。大多数HPLC仪器同样有一个柱式烤炉，考虑改变进行分割的温度[46-53]。

高效液相色谱的类型

根据所使用的底物(即固定相)的不同，HPLC可分为以下类型[54-63]：

•正相高效液相色谱-在这种方法中，分离是基于极性。固定相为极性，多采用二氧化硅，非极性相为己烷、氯仿和乙醚。极性样品保留在柱上[58]。

•反相高效液相色谱法-反相高效液相色谱法。流动相是极性的，而固定相是非极性或疏水的。非极性的性质越多，它就会被保留得越多。

•凝胶排阻高效液相色谱-色谱柱将与精确控制的底物分子结合。根据分子大小的不同，成分会发生分离。

•离子交换高效液相色谱法-固定相具有与样品电荷相反的离子电荷表面。所使用的流动相为水缓冲相，可控制pH值和离子强度[56]。

高效液相色谱的应用

高效液相色谱法在药学、法医、环境和临床等领域有多种应用。它还有助于化合物的分离和纯化[57-83]。

•制药应用程序:药物应用包括药物稳定性控制、溶出度研究和质量控制。

•环境应用程序:监测饮用水中的污染物和成分。

•法医应用程序:分析纺织染料，生物样品中药物和类固醇的定量。

•食品及香料应用:果汁中的糖分析，蔬菜中多环化合物的检测，防腐剂的分析。

•临床应用:内源性神经肽检测，血液和尿液等生物样本分析。

结论

高效液相色谱法是最常用的分析技术。它有几个优点。使用高效液相色谱法可以生产出极纯的化合物。它可用于实验室和临床科学。使用高效液相色谱法可以提高准确性、精密度和特异性。HPLC的唯一缺点是成本高。

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