研究与评论:动物科学杂雷竞技苹果下载志
菜单e-ISSN: 2321-6190 p-ISSN: 2347-2294
e-ISSN: 2321-6190 p-ISSN: 2347-2294
Kushwaha T1维什瓦卡玛1拉胡尔·帕里瓦尔1Sashidhar Burla2和Shweta Yadav3.*
2的能源印度新德里研究所
3.中央大学生物科学学院，印度Sagar (MP)， Pin code 470003
收到日期:2015年11月12日;接受日期:2015年12月21日;发表日期:2015年12月25日
浏览更多相关文章研究与评论:动物科学杂雷竞技苹果下载志
建立了一种简单的方法，从不同种类的单蚓科蚯蚓(Drawida travancorensis D.pellucida, parambikimala, D.modesta)中提取高质量的DNA;大绦虫科;八尾绦虫科;产自印度西高止山脉的绵蝇科(八绵蝇，绵蝇，绵蝇)。获得了良好的DNA含量(261.6 ~ 151 μl)。目前修改后的协议。A260/A280比值为1.91 ~ 1.98，常规方案为1.48 ~ 2.24 μl。提取的DNA分别用LCO1490和HCO2198引物扩增683 bp的细胞色素氧化酶I (COI)基因。利用最大似然法对所有扩增基因序列进行比对、编辑和分析，以表征不同种类的蚯蚓。本研究所采用的改良方案可方便、高效地从不同种类的蚯蚓中提取高质量的DNA。
有机物，遗传毒性
生物多样性的一个重要方面是物种在生态系统功能中的相对重要性;特别是到目前为止，调节土壤有机质和养分动态的土壤生物群。土壤生物资源已被公认为可持续生计和粮食安全的基础。蚯蚓的重要性不容忽视，因为它们在可持续改善土壤条件方面具有巨大的潜力。蚯蚓是古老的生物，因为它们已经在我们的星球上存在了6亿年。他们在大灭绝中幸存下来，并通过耕种和施肥帮助地球上的生命和人类文明得以维持。早在1881年，伟大的博物学家查尔斯·达尔文(Charles Darwin)就观察到:“可能会怀疑是否有许多其他物种动物它们在世界历史上扮演了如此重要的角色，就像这些孤独的有组织的生物一样，整个地球上的每一寸土壤肯定都经过了蚯蚓的肚子好几次。”
世界上已知的蚯蚓大约有3700种，但估计的种类可能高达8000种[1]。在印度，根据形态特征对属于69属的418种和亚种进行了重组[2]。随着对大片未开发地区的广泛调查，这一数字预计将上升到800左右。印度蚯蚓多样性高主要是由于其地理位置具有宽的纬度范围(在8.4°N和37.6°N之间，纵向范围为68.7úºE和97.25úºE)，复杂的地形，多变的气候(喜马拉雅从温带到北极，印度半岛从热带)和过去的地质历史，这些历史与古冈瓦纳超级大陆有关，冈瓦纳大陆在侏罗纪晚期分离，并在始新世与亚洲大陆碰撞[3.]。
蚯蚓也被用作生态毒理学、生理学、生化基因研究[4，5不同菌株的基因组成关系环境也影响它们在生物转化过程和土壤肥力管理中的有效性" [6-10]。成年蚯蚓的种类鉴定只能通过解剖其前端。然而，这种方法是劳动密集型的，耗时的，而且对于非专业人员来说非常困难，特别是在处理由几种不同蚯蚓种类组成的实地收集时。此外，鉴定仅限于成虫，因为大多数生命阶段是无法识别的，蚯蚓的许多形态和解剖特征是可变的[3.]。因此，变异的程度可以不同，特征可以重叠的分类群[11]。目前，包括DNA条形码在内的分子标记有望解决这一分类困境[j]。12]。然而，这不能取代传统的分类学，但可能是识别蚯蚓物种的有力工具。
一般来说，分子技术需要分离基因组DNA进行表征，也需要对污染物引起的DNA修饰进行量化。因此，高质量DNA的分离是分子研究的重要环节。已经建立了几种从植物组织中分离纯DNA和完整DNA的方案，细菌、血液和许多其他动物，包括昆虫和哺乳动物的组织[13-21]。但是对蚯蚓的研究仍然有限。在目前的研究中，我们开发了一种简单的方法，可以在短时间内从不同种类的蚯蚓中分离出高质量的DNA。哪个是改性CTAB(十六烷基三甲基)铵(溴)法，由Murray和Thompson(1980)描述，一般用于提取植物DNA [22]。一般来说，CTAB基因组DNA提取方法涉及细胞裂解以及氯仿:异丙醇和蛋白酶k的使用。结果与市售试剂盒和原始CTAB方法进行了比较(Doyle & Doyle, 1987) [23]。
不同种类(travancorensis, d.p elucida, d.p odesa, D.parambikulamana;Travoscolides chengannures;Perionyx sansibaricus;Octolasion cyaneum;Eisenia安德烈;Eisenia fetida;Eudrilus eugeniae)收集自印度西高止山脉(喀拉拉邦Wayanad森林)的2-5只蚯蚓，并在100%乙醇中保存。coi基因的DNA提取和扩增在印度新德里的能源研究所进行。
1 M Tris HCl (pH-8.0);氯化钠(NaCl);0.5 M乙二胺四乙酸(EDTA) pH-8.0;十六烷基三甲基溴化铵;氯仿:异戊醇(24:1);乙醇;1xTE缓冲液(pH-8.0);Tris Hcl 1 M, EDTA 0.5 M;琼脂糖(分子级)用于提取DNA。通用引物LCO1490和HCO2198 (Folmeret al。细胞色素氧化酶I (COI)基因扩增683 bp。PCR反应为:0.3 μl(±30 ng) DNA模板，12.5 μl PCR Master Mix (Xceleris)， 11 μl核酸酶游离水和各引物10 pmol (1 μl)。PCR循环包括94°C初始变性步骤4分钟，然后在94°C 1分钟，45°C 1分钟和72°C 1分钟进行35个循环。最后在72°C 10分钟，然后在4°C 10分钟完成反应。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳(含溴化乙啶、DNA染色染料)，在透照器发射紫外线下拍照。在MEGS v5中对所有序列进行比对、编辑和分析。提取DNA的步骤如下:
•蚯蚓组织在清洁干燥的尾管中取长至1cm的不同物种。
•加入200 μl 1xTE缓冲液(1 M Tris Hcl, 0.5 M EDTA)，加入ddH使体积达到1 L2Doyle & Doyle, 1987)。
•添加500 μl CTAB缓冲液(1 M Tris Hcl, 5 M NaCl, 0.5 M EDTA, 20%十六烷基三甲基溴化铵(CTAB))，使总体积达到1 / dd H2O跟随Doyle & Doyle, 1987)。
•添加3-5 μl蛋白酶K (20 mg/ml)。
•大力漩涡。
•加入RNase (2 μl) (10 mg/ml)，在-20°C孵育1小时或过夜。(还添加了RNase以防止RNA污染)。
•在55℃下孵育1小时。
•间歇性混合。
•加入等量氯仿:异戊醇(24:1)。
在14000 rcf(相对离心力)下离心7分钟。
•将水相转移到新的离心管中，重复上述步骤两次。
•加入35 μl冷冻7.5 M醋酸铵，200 μl异丙醇(0.5体积)。让DNA静置20分钟。
•14000 rcf离心10分钟。
•丢弃上清。
•加入500 μl 70%乙醇。
•14000 rcf离心3分钟。
•丢弃上清。
•加入等体积的100%乙醇。
•14000 rcf离心3分钟。
•丢弃上清。
•试管保存在室温下干燥。
•在30 μl 1X TE (10 mM Tris)中溶解干颗粒或DNA。HCl和1mm EDTA)缓冲液，室温孵育2小时。
•保存在-20°C，以备以后使用。
采用纳米滴法测定A260和A280处的光密度(od)来定量DNA。样品在1X TE缓冲液中在110v下电泳30分钟。将分离的基因组DNA用2 μl6 × 3 μl的上样染料负载在溴化乙啶染色的1%琼脂糖凝胶上，检查DNA的质量，并拍照(图1)凝胶文件系统(简单蛋白荧光化学)的研究。总核酸平均产率为261.6 ~ 1517.6 μl(表1)。
图1:采用改良方案提取不同种类蚯蚓的高分子量总DNA，经1%琼脂糖凝胶电泳(含溴化乙啶、DNA染色染料)，在紫外照射下拍摄。
表1:在NanoDrop 2000c/紫外-可见分光光度计下观察到的DNA浓度(μg/μl)的定量估计。
这比商业试剂盒和其他可用方法获得的结果要高得多。A260/A280比值在1.91 ~ 1.98之间，说明该核酸纯度较高。整个程序在340分钟内完成，而其他程序则需要430分钟左右。用这种方法提取的DNA产生了可重复的条带，证明了其适合PCR扩增(图2)采用凝胶萃取。测序色谱显示清晰的峰，没有混合/不间断读取(图3)。
图2:线粒体细胞色素c氧化酶I (COI)基因的PCR扩增采用LCO1490 FP和HCO2 198基因特异性引物，在45℃退火温度下扩增线粒体细胞色素c氧化酶I基因的部分序列。PCR扩增产物在含有乙啶的1%琼脂糖凝胶电泳上电泳溴化使用DNA染色染料，并在发射紫外线的泛照明灯下拍摄。
图3:使用LCO1490正向引物的EW样品测序色谱图显示清晰的峰，没有混合/不间断读取。从早期研究中获得的序列的GenBank登录描述显示在系统发育树中。我们这里使用的组是Sepia aculeata COI基因，墨鱼(软体动物)。分支处的值显示了以百分比给出的ML引导值。Bar 1的变化/10个字符。
GenBank对早期研究序列的描述显示在系统发育树中(图4)。这里使用的Out组是Diplocardia komaerkiCOI基因gi.82400071。分支处的值显示了以百分比给出的ML引导值。Bar 5个变化/100个字符。由coi基因DNA序列推断的最大似然树显示了样品EW-41-A34、EW-47-A42、EW49-A46和EW-41-A36的系统发育位置travancorensis, d.p elucida, d.p odesa, D.parambikulamana分别;电子战- 74 - 25Travoscolides chengannures;EW-48-A46为Perionyx sansibaricus;EW-33-7为八氟氰;电子战- 65首次购物Eisenia安德烈;EW-34-6;电子战- 71 - 25Eudrilus eugeniae。研究证实，修改后的方案有助于提取不同生态位不同种类蚯蚓的高产量DNA。这可用于识别蚯蚓和其他应用研究。
图4:最大似然系统发育分析三爪猴(Perionyx sansibaricus, EW 48-A92)， GenBank对早期研究序列的描述见系统发育树。我们这里使用的组是Sepia aculeata COI基因，墨鱼(软体动物)。分支处的值显示了以百分比给出的ML引导值。Bar 1的变化/10个字符。
改进的CTAB方法减少了处理步骤，消除了长时间的孵育，在短时间内获得了不同生态位不同种类蚯蚓的高质量DNA。这对研究蚯蚓的分子和其他目的可能有帮助。不含有毒化学物质，为高质量、高产量的提取提供了明显的替代选择核酸来自不同种类的蚯蚓。
我们感谢新德里印度政府科技部生物技术司为开展本研究提供的财政支持。
