一个简单的协议从蚯蚓组织中提取DNA分子的研究

文摘

制定了一个简单的方案从不同物种中提取高质量DNA的蚯蚓家庭Moniligastridae (Drawida travancorensis D。方可成功,D。parambikimala D.modesta);Megascolecidae (Perionyx sansibaricus) Octochaetidae (Travoscolides chengannures);正蚓科(Octolasion cyaneum Eisenia安德烈,E.fetida) Eudrilidae (Eudrilus eugeniae)来自印度的西高止山脉。一个好的数量(261.6到151μg /μl)的DNA。与目前修改后的协议。A260 / A280也比在1.91 - 1.98范围的同时,常规协议1.48 - -2.24μg /μl记录。中提取DNA用于放大683个基点的细胞色素氧化酶(COI)基因与LCO1490 HCO2198引物。放大基因序列都是对齐的,编辑和使用最大似然方法进行分析,以确定不同种类的蚯蚓。看来,修改协议本研究中使用的是高效和容易从不同种类的蚯蚓中提取高质量DNA。

关键字

有机质、基因毒性

介绍

生物多样性的一个重要方面是物种在生态系统的功能的相对重要性;尤其目前土壤生物区土壤有机质和养分动态监管。土壤生物资源被认为是可持续的生计和粮食安全的基础。蚯蚓的重要性不容忽视,因为他们有巨大的潜力来改善土壤条件在可持续的基础上。蚯蚓古老的生物,因为他们已经在我们的星球上6亿年。他们已经通过大规模物种灭绝中幸存下来,帮助地球上生命维持和人类文明土壤耕作和施肥。早在1881年,查尔斯·达尔文,伟大的博物学家,观察“可能是怀疑还有许多其他的动物已经扮演了重要的角色在世界历史上有这些孤独的生物组织和整个星球上的每一寸土壤肯定通过蚯蚓的肚子好几次。”

大约3700种蚯蚓是世界上已知但估计物种的数量可能高达80001]。在印度,418种和亚种69属重组形态特征的基础上(2]。这个数字预计将上升到约800年的广泛调查大量未开发的地区。高蚯蚓多样性在印度主要是由于其地理位置与纬度的范围宽(8.4°N之间和37.6°N和纵向范围‹šE 68.7和97.25‹šE),地形复杂,气候多样(从温带到北极喜马拉雅山热带印度半岛)和过去的地质历史,与古代超级冈瓦纳大陆土地在侏罗纪末分离漂移与亚洲大陆碰撞在始新世3]。

蚯蚓也作为重要的模式生物在生态毒理学,生理学、生化和基因研究4,5”不同菌株的基因组成的关系环境也会影响其有效性的生物转化过程和土壤肥力管理”6- - - - - -10]。物种鉴定的成年蚯蚓是可能只有通过解剖前结束。然而,这种方法是劳动密集型,耗时和非专业人员很难,特别是当处理字段集合组成的几种不同的蚯蚓的物种。此外,识别仅限于成虫大多数生命阶段都无法辨认的,许多蚯蚓的形态和解剖特征变量(3]。因此可变性可以不同程度和特性可以重叠类群(11]。目前,分子标记包括DNA条形码可能是有前途的方法来解决这一困境的分类(12]。然而,这不能取代传统分类法,但是这可能是一个强大的工具识别物种的蚯蚓。

一般来说,分子技术需要隔离的基因组DNA描述和量化pollutant-induced DNA的修改。因此,孤立的高质量的DNA分子的研究是一个重要的过程。已经建立了几个协议隔离纯植物组织的DNA和积分,细菌,血液和许多其他动物包括昆虫和哺乳动物组织(13- - - - - -21]。但对蚯蚓的研究仍然是有限的。在本研究,我们开发了一个简单的协议隔离高质量的DNA在短时间内不同种类的蚯蚓。这是改良的CTAB (Cetyltrimethyl铵溴化)方法,描述了穆雷和汤普森(1980)通常用于提取植物DNA (22]。一般来说,CTAB基因组DNA提取方法包括细胞溶菌作用以及氯仿:异戊醇和使用蛋白酶k .结果与商用设备和原始CTAB方法相比(Doyle &柯南道尔,1987)23]。

材料和方法

不同的物种(Drawida travancorensis D。方可成功,D。modesta D.parambikulamana; Travoscolides chengannures;Perionyx sansibaricus;Octolasion cyaneum;Eisenia安德烈;Eisenia fetida;Eudrilus eugeniae)蚯蚓的人数(2 - 5)收集从西高止山脉(Wayanad森林,喀拉拉邦)、印度和保存在100%乙醇。提取的DNA和放大的coi基因——我是能源资源研究所,新德里,印度。

1米三羟甲基氨基甲烷HCl液ph值(- 8.0);5 m氯化钠(氯化钠);0.5 diaminetetra醋酸乙烯(EDTA) ph - 8.0;CTAB (cetyltrimethyl溴化铵);氯仿:isoamylalcohol (24:1);乙醇;1 xte缓冲区(ph值- 8.0);1米三羟甲基氨基甲烷盐酸,液0.5米EDTA;琼脂糖(分子级)被用于提取DNA。通用引物LCO1490和HCO2198 (Folmeret al。1994)被用来放大683 bp的细胞色素氧化酶(COI)基因。PCR反应由0.3μl (±30 ng) DNA模板,12.5μl PCR反应混合液(Xceleris), 11μl核酸酶自由水和10 pmol(1μl)每个引物的。PCR循环由最初的变性步骤在94°C 4分钟紧随其后35周期在94°C 1分钟,1分钟45°C和72°C 1分钟。最后在72°C扩展步骤10分钟紧随其后4°C 10分钟完成了反应。PCR扩增产品运行在1%琼脂糖凝胶电泳含有溴化乙锭,DNA染色染料和透照器发射紫外线下的照片拍摄。所有的序列对齐,编辑和分析兆v5。提取的DNA是在之后的步骤:

•蚯蚓组织不同种类的1厘米在清洁和干燥eppendrof管。

•添加200μl 1 xte缓冲区(1 M盐酸三,0.5 EDTA带来高达体积与ddH 1 L₂O所建议的柯南道尔&柯南道尔,1987)。

•增加了500μl CTAB缓冲区(生理盐水1 M盐酸三,5米,0.5米20% EDTA Cetyltrimethyl溴化铵(CTAB)带来总量与dd H₂跟着阿道尔&柯南道尔,1987)。

•3 - 5μl蛋白酶K(20毫克/毫升)补充道。

•积极漩涡。

•添加核糖核酸酶(2μl)(10毫克/毫升)和孵化-20°C 1小时或过夜。(核糖核酸酶也被添加到防止RNA污染)。

•在55°C 1小时孵化。

•混合断断续续。

•添加相同体积的氯仿:Isoamylalcohol (24:1)。

•离心机在14000 rcf(相对离心力)7分钟。

•水相转移到一个新的离心管及以上步骤重复两次。

•添加35μl冷冻7.5醋酸铵,200μl异丙醇(0.5卷)。和左DNA为20分钟安定下来。

•离心机在14000 rcf 10分钟。

•上层清液被丢弃。

•增加了500μl 70%乙醇。

•离心机在14000 rcf 3分钟。

•丢弃的上层清液。

•添加相同量的100%的乙醇。

•离心机在14000 rcf 3分钟。

•丢弃的上层清液。

•管是保存在室温下干燥。

•干颗粒或DNA溶于30μl 1 x TE三(10毫米。盐酸和1毫米EDTA)缓冲区和孵化在室温下2小时。

•为进一步使用存储在-20°C。

结果和讨论

DNA量化通过测量光密度(外径)A260和A280 nanodrop。样品受到电泳在1 x TE缓冲在110 v为30分钟。2μl6x加载染料3μl孤立的基因组DNA的加载1%琼脂糖凝胶与溴化乙锭染色检查质量的DNA,凝胶拍摄(图1)蛋白质在凝胶文档系统(简单的萤石化学。米),平均总核酸的产量范围261.6μg /μl 1517.6μg /μl(表1)。

这是远高于同商业工具和其他可用的方法。A260 / A280比率在1.91到1.98的区间表示核酸的纯度。整个过程在340分钟内完成但是别人大约需要430分钟。用这种方法提取的DNA产生了可再生的乐队证明PCR扩增的适当性(图2)使用凝胶萃取。测序色谱显示明显的峰值没有混合/不间断读(图3)。

基因库加入描述序列的早期研究显示在系统发育树中(图4)。这里使用组Diplocardia komaerkigi.82400071细胞色素氧化酶(COI)基因。分行显示了ML的价值引导的百分比值。酒吧5变化/ 100个字符。最大似然树推断从coi - i基因DNA序列显示的系统发育地位样本EW-41-A34 EW-47-A42 EW49-A46和EW-41-A36Drawida travancorensis D。方可成功,D。modesta, D.parambikulamana分别;电子战- 74 - 25Travoscolides chengannures;EW-48-A46为Perionyx sansibaricus;EW-33-7对于Octolasion cyaneum;电子战- 65首次购物Eisenia安德烈;EW-34-6 Eisenia fetida;电子战- 71 - 25Eudrilus eugeniae。研究证实了修改后的协议可能有助于提取DNA的高收益不同种类的蚯蚓可以在不同的生态位。这可能是用来确定蚯蚓和其他应用研究。

结论

目前改良CTAB协议减少数量的处理步骤,和消除长孵化项目取得了良好的质量来自不同物种的DNA不同生态位的蚯蚓在短时间内。这可能有助于研究蚯蚓对分子和其他用途。没有有毒化学物质使提取的一个明显的选择高质量和产量核酸从不同种类的蚯蚓。

确认

我们承认金融支持生物技术系的,科技部,印度政府,新德里,进行本研究。

引用

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