研究与评论:药物分析杂雷竞技苹果下载志
菜单e-ISSN: 2320 - 0812
e-ISSN: 2320 - 0812
T Sudha1＊Vamsi Krishna1和VR拉维库玛2
1药物分析系，腐蚀剂学院和研究所，腐蚀剂，泰米尔纳德邦，印度。
收到日期:14/10/2013;接受日期:19/11/2013;发表日期:22/11/2013
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一种简单稳定的指示装置液相色谱法建立了盐酸二甲双胍原料药、制剂和大样品纯度的测定方法药品剂型在其存在的杂质和降解产物中。的流动相缓冲液:乙腈(90:10% v/v)， pH 3.6 (0.006M磷酸调节)，等容模式下流速1.0ml/min。色谱柱为Inertsil ODS 3V (250 mm X 4.6mm id, 5 μ)，波长为218nm，采用紫外检测器进行分离。该方法符合美国药典(USP)对测定新方法的要求，包括准确度、精密度、特异性和特异性线性．目前的方法在50 ~ 200%的二甲双胍盐酸盐范围内显示出良好的线性关系。方法的准确度为97.11 ~ 98.36%。用重复的相对标准偏差反映该方法的精密度为0.27%。按照USP对杂质定量测定的准确度、精密度、线性度、选择性和定量限度的要求，对同样的方法进行了杂质测定的验证。
显影，反相LC，二甲双胍HCL，杂质，稳定性指示。
盐酸二甲双胍化学名称为咪地二羰基二胺，N-N-二甲基单盐酸。二甲双胍杂质相关化合物A (RCA)、相关化合物B (RCB)和相关化合物C (RCC)在化学上称为1-氰胍(RCA)、1-甲基双胍盐酸盐(RCB)和N, N二甲基(1,3,5)三嗪2,4,6三胺(RCC)。盐酸二甲双胍是一种双胍类降糖药，用于治疗非胰岛素依赖型糖尿病(使人们)．其作用机制不同于其他类口服降糖药。它通过减少肝脏葡萄糖的产生，减少葡萄糖的肠道吸收，改善血糖水平胰岛素敏感性通过增加外周葡萄糖摄取和利用[1］．USP和BP描述了一种非水滴定法作为二甲双胍HCL分析的方法和另一种单独的方法高效液相色谱法其杂质分析方法[2，3.］．然而，分析盐酸二甲双胍及其杂质(RCA、RCB和RCC)的稳定性指示试验方法是必要的。许多高效液相色谱方法如同时测定格里米普利、吡格列酮和盐酸二甲双胍反相高效液相色谱法方法平板电脑配方［4]，反相高效液相色谱法同时测定片剂配方中盐酸二甲双胍、格列齐特和吡格列酮的含量[5]被开发和验证。高效液相色谱和分光光度法测定盐酸二甲双胍的其他几种方法[6，7，8，9，10，11，12]也有报道。但这些方法均未用于盐酸二甲双胍及其潜在杂质的稳定性测定。报道了盐酸二甲双胍及其相关化合物(1-氰胍)片剂配方分析方法的建立和验证[13］．这种方法只分析了一种杂质。同时测定片剂配方中盐酸二甲双胍及其杂质的开发与验证[14的报道。然而，他们使用了一种亲水相互作用液相色谱技术，这种技术需要一个特殊的色谱柱，并且在这个领域有专家分析，这在一些实验室是没有的。因此，本工作的目的是建立一种简单的反相高效液相色谱法，用于分析盐酸二甲双胍及其片剂配方中相关化合物的稳定性。
对现行方法进行了片剂配方中盐酸二甲双胍含量的测定(测定法)和其三种杂质(RCA、RCB和RCC)的定量测定。盐酸二甲双胍分析方法的验证参照USP含量测定的当量，包括准确度、精密度特异性、线性度和范围;RCA、RCB、RCC方法的验证参照USP杂质定量测定的要求，包括准确度、精密度、特异性、线性度、范围和LOQ。
化学物质
乙腈HPLC级从Rankem公司获得，庚烷磺酸钠和氯化钠从默克公司(印度孟买)获得。相关化合物盐酸二甲双胍和二甲双胍均来自金奈的dicdicpharmaceuticals公司
装置
采用HPLC系统(waters 2489)，包括泵、自动进样器、色谱柱、烘箱和紫外检测器。使用Empower软件。色谱分析在Inertsil ODS-3V (5mm) (250mm长，6mm内径)色谱柱上进行。色谱柱温度保持在300℃。
原液的制备
将相关化合物(A、B、C)各1mg溶解于100ml稀释液中制备杂质原液，得到各相关化合物浓度(0.5mg/ml)的溶液。
在20ml稀释剂中加入5ml杂质原液，制备盐酸二甲双胍及其相关化合物的溶解液。配制盐酸二甲双胍(片剂)样品，将相当于125 mg盐酸二甲双胍的片剂溶解在100ml稀释剂中制备。取一部分样品溶液，3500rpm离心10分钟，将5ml上清液转移到50ml容量瓶中，加入稀释剂至刻度处(125mg/ml)，以检测盐酸二甲双胍片样品中可能存在的杂质和降解物。
样品溶液的制备方法如下。准确称量5片格列本脲/盐酸二甲双胍，计算平均重量及粉末状。将相当于250 mg盐酸二甲双胍的片剂粉末转移到50 ml容量瓶中，用稀释剂补充体积。取部分样品溶液，3500转/分离心10分钟，取5ml上清液倒入100ml容量瓶中，用稀释液2补充体积。
方法验证
精度
通过方法精度和系统精度验证了方法的精度。采用标准的适宜性溶液对系统精度进行了检验。配制标准适宜溶液并注入。记录了六次重复注射标准溶液的峰面积响应。通过在格列本脲和盐酸二甲双胍(1.25mg/250mg片)样品中注射六种单独的二甲双胍制剂，检查方法的精度。色谱图被记录下来。计算了三种杂质的%RSD面积，并计算了系统适用性。
检测限度以及量化的极限
用体积稀释标准液和杂质原液，测定检测限和定量限。定量限(LOQ)和定量限(LOD)用以下公式测定。
LOD = 3.3X残差标准差/斜率
LOQ = 10X残差标准差/斜率
线性
将二甲双胍原液从LOQ到检测物浓度400%的8个浓度水平(0.095、0.119、0.143、0.167、0.191、0.239、0.359和0.479μg/ml)配制成测定方法的线性测试溶液。峰面积与浓度数据采用最小二乘回归分析。将原液稀释至所需浓度，制备相关物质法线性测试溶液。从LOQ到规格水平200%的7个浓度级别制备溶液(LOQ, 30, 50, 80, 100, 150和200%)。
精度
采用50、100和200%三种浓度水平的样品(格列本脲中的二甲双胍和盐酸二甲双胍片)，对测定方法的准确性进行了三次评估。对样品进行了标准添加和回收实验，以确定相关物质方法的准确性。研究采用4个浓度水平LOQ(50、100和200%)进行了3次重复。计算了二甲双胍及其杂质的回收率。
鲁棒性
鲁棒性是一种方法能力的度量，它不受方法参数的微小、故意变化的影响，并提供了在正常使用期间方法可靠性的指示。为了确定所开发方法的稳健性，故意改变实验条件，并计算二甲双胍及其杂质的系统适宜性参数。流动相流速1.0ml/min。为研究流速对分辨率的影响，将流速由0.9 ~ 1.1ml/min改变0.1个单位。在35°C和25°C而不是30°C条件下研究了柱温对分辨率的影响。通过将乙腈浓度从-2 ~ +2%变化，研究了乙腈浓度对分辨率的影响。研究了缓冲液pH值在-0.2 ~ + 0.2范围内对分辨率的影响。
溶液的稳定性
测定二甲双胍溶液稳定性的方法是将样品和参比标准品的测试溶液均放在密闭的容量瓶中，室温下放置48小时。相同的样品溶液在研究期间间隔12小时进行分析。二甲双胍及其杂质在相关物质法中的溶液稳定性是通过将加标样品溶液放在紧盖的容积瓶中，室温下放置48小时来进行的。在研究期间，每隔12小时测定杂质A、B和C的含量。
强度
坚固性是在正常变化的操作条件下测试结果的可重复性的度量，例如，分析人员对分析人员，系统对系统，列对列和每天。通过注射6个不同浓度的二甲双胍制剂(125μg/ml)对照对照标准品，测定测定方法的精密度(重复性或中间精密度)。采用不同的分析人员对该方法的中间精密度进行了评价。杂质法的中间精密度由6个单独的格列本脲二甲双胍制剂(1.25mg/ 250mg片)以1.25 μg/ml的已知杂质为掺量，采用不同的分析人员和不同的时间进行测定。计算%RSD。
特异性(强制降解研究)
特异性是指该方法在潜在杂质存在的情况下对分析物反应的能力。对所开发的二甲双胍反相液相色谱方法的特异性进行了研究。在杂质A、B和c存在的情况下，对格列本脲和二甲双胍片进行了应激研究，以提供所提出方法的规格指示。在紫外光、酸(1N HCL)、碱(1N NaoH)、氧化(3% H2O2)和热(105°C)的胁迫条件下进行降解试验，以评估所提出的方法从其降解产物中分离二甲双胍的能力。对于热和光研究，研究时间为3天，而对于酸、碱和氧化研究则为3小时。采用PDA检测器对应力样品中的二甲双胍峰进行了峰纯度测定。
滤波器的研究
进行了过滤器研究，以确定所使用的过滤器的适用性，并确定在收集样品溶液进行分析之前要丢弃的滤液量。过滤器研究使用100%溶液下的准确度样品。这个样本被分成六部分。将制备好的样品的一部分离心(3500 rpm, 10分钟)，将离心管中的清上清注入并分析。离心样品被用作过滤器研究的对照。将前1ml、2ml、3ml、5ml滤液丢弃，用0.45μ尼龙过滤器过滤第二部分样品。精度100%样品被认为是0.45 μ PVDF滤波器。
方法开发
色谱柱为Xterra RP18 (150mm X 4.6mm, 5μ)，流动相为乙腈和缓冲液。(不同体积分数)用0.006M磷酸调节缓冲液pH 4.58。使用这些不同体积的流动相，然而，给出，峰尾被发现是二甲双胍峰，基线被干扰峰和峰形不好。然而，使用缓冲液(pH值3.65,0.006磷酸调节)与乙腈的混合物，比例为90:10%v/v和Inertsil C8 (250 mm X 4.6mm id, 5 μ)色谱柱。结果发现，USP板计数为3500，仅在3.06分钟发现了一个相关的复合峰(RC-A)。接下来，增加运行时间为40.0分钟，并加入已知杂质(RCB, RCC)。二甲双胍相关化合物C峰为20.042 min，相关化合物B峰缺失。采用对称的C18色谱柱代替Inertsil C8，相同的流动相，流速1.0ml/min。盐酸二甲双胍与相关化合物B的分离度非常低。然后采用Inertsil ODS 3V (250 mm X 4.6mm id, 5 μ)色谱柱，相同的流动相和流速。 The USP plate count for metformin HCL was found to be 11442 and USP resolution between metformin HCl and metformin related compound B was found to be 2.81 minutes. After this optimization this method was employed for the separation of and its related compounds (RCA, RCB & RCC) a good separation with adequate resolution was obtained图1．
图1:二甲双胍及其杂质色谱的优化
方法验证
所提出的方法根据美国fda指南进行了验证[15］．
在方法开发后，按照USP对测定的要求(药品制剂中有效成分定量的1类分析方法，包括准确性、精密度、特异性、线性度和范围)，对当前二甲双胍HCL的测试方法进行了验证
精度
从方法精密度和系统精密度两方面验证了相关物质方法的精密度。相关物质法精密度研究中A、b、C杂质面积的%RSD分别为1.94、2.97、3.63%。盐酸二甲双胍的系统精密度研究结果的RSD为0.27%。6种样品制剂中已知和未知杂质的%RSD值不应超过10.0%。结果表明，该方法具有较好的精度。系统适宜性参数值均在极限范围内。值显示在表1．
表1:系统精度数据
线性
测定方法在50 ~ 200%范围内得到线性校准图，相关系数为0.9991。结果表明，分析物的峰面积与浓度之间存在极好的相关性。在LOQ至200%的校准范围内，获得相关物质方法的线性校准图。RCA、RCB和RCC的相关系数(r2)分别为0.9994、0.9923和0.9924。线性回归数据表明，该方法在LOQ ~ 200%的浓度范围内呈线性。分析报告见表2．
表2:盐酸二甲双胍及其相关化合物的线性回归数据
检测极限和定量极限
文中给出了二甲双胍及其杂质的检测限、定量限和LOQ值的精密度表3．LOD和LOQ值表明，该方法对二甲双胍相关物质的测定是敏感的。
表3:盐酸二甲双胍及其杂质的LOD和LOQ数据
精度
二甲双胍的回收率为97.11 ~ 98.36%。二甲双胍、格列本脲片样品杂质回收率为81.30 ~ 12.30%。杂质和二甲双胍HCL的%回收率值显示在表4．因此，该方法的准确性是可以接受的。
表4:准确性研究的评价
鲁棒性
在所有有意改变的色谱条件(流速、柱温、有机溶剂流动相比和pH值)下，所有化合物对之间的分辨率均大于2.0,5次重复标准溶液的峰面积响应相对标准不大于5.0%。基于以上讨论，该方法不受流速、柱温、流动相比和缓冲液pH值的影响。
溶液的稳定性
48小时标准溶液的结果与初始标准浓度的百分比差异小于10.0%，因此发现浓度%差异不大于10.0%的验收标准。因此，如果在室温下储存，标准溶液可在制备后48小时内使用。结果表明，加标48小时后样品溶液的测定结果差异不超过20.0%。经比较发现，初始杂质百分比与验收标准的差异不应超过20.0%。溶液稳定性实验数据证实，标准溶液和加标样溶液在48小时内稳定。
强度
5次重复注入标准溶液的峰面积响应的相对标准偏差(RSD)为分析器-I为0.19，分析器-II为0.90。二甲双胍相关化合物B与盐酸二甲双胍的USP分辨率在系统适宜性溶液中不小于1.5。(分析师i为3.28，分析师ii为3.05)。杂质A、B和C的%RSD值分别为1.94、2.97和3.63(分析师- i)，杂质A、B和C的%RSD值分别为1.42、6.37和3.53(分析师- II)(杂质的%RSD值不应超过10.0%)。从两名分析人员获得的平均杂质值的比值被发现在所有杂质的0.80到1.20的接受标准之内。因此，该方法被发现是坚固的。
强制降解研究结果
二甲双胍样品溶液在碱和过氧化氢胁迫条件下降解显著。在酸胁迫条件下出现轻度降解。在光解和热应力条件下，发现它是稳定的。在强制降解过程中，没有观察到降解样品产生的二次峰干扰二甲双胍峰的洗脱。峰纯度分析采用光电二极管阵列检测器验证二甲双胍均匀性。所有已知杂质均不干扰二甲双胍峰。研究表明，该方法具有特异性和稳定性。分析报告见表4．
滤波器的研究
样品过滤部分的含量和杂质百分比与样品离心部分的含量和杂质百分比相当，不同过滤体积之间的含量和杂质百分比没有显著差异。因此，0.45μ PVDF和尼龙过滤器适用于验证和丢弃4ml样品溶液作为滤液，如方法中所述，在收集用于HPLC分析之前丢弃的体积是合适的。
建立了一种简便、准确、精密度稳定的高效液相色谱分析方法，用于片剂配方中盐酸二甲双胍的分析。目前的方法能够从相关化合物(RCA, RCB和RCC)中分离二甲双胍HCL。该方法对相关化合物的LOD和LOQ较低，可以在低浓度下检测和定量该杂质。
