丰富的蛭弧菌属bacteriovorus在猪胃肠道(GI)呼吸道隔离,表征和捕食猪Stomach-derived应变的能力

文摘

蛭弧菌属bacteriovorus是一种革兰氏阴性捕食者以其他革兰氏阴性细菌。因此,它被认为是一个潜在的替代剂抗生素,可以减轻多重耐药的出现(MDR)革兰氏阴性细菌感染动物产业。详细研究b bacteriovorus在猪消化道很少报道。这里的研究主要集中在检测大量的b bacteriovorus猪消化道,和隔离,表征和捕食能力stomach-derived bacteriovorus。在我们的研究中,总细菌的DNA提取猪消化道中的每个片段,然后由qPCR分析。结果充分表明,b . bacteriovorus确实存在于猪消化道,和其在盲肠的数量有显著区别(10 g - 1内容级e4.32副本)和十二指肠(10 g - 1内容级e2.77副本)(P < 0.05)。同时,b . bacteriovorus猪胃里digesta隔绝,其存在是进一步证实了透射电子显微镜(TEM)和16 s rDNA序列分析。作证的捕食能力隔离,大肠杆菌和沙门氏菌喂养在37°C。在此帐户,隔离可能会发挥一些作用控制畜牧业的革兰氏阴性细菌感染。

关键字

生态系统;细菌感染;基因组;营养物质

介绍

抗生素在动物疾病治疗和至关重要的增长促进了60多年(1]。对促进动物生长速度的影响,提高饲料效率和减少动物死亡率,提要,只有sub-therapeutic水平已经有据可查的(2]。尽管抗生素畜牧业的明显的好处,有一些潜在的问题可能会影响人类和动物的健康。越来越多的直接和间接证据在过去的40年里表明畜牧业的使用抗生素和之间的相关性的兴起和传播相关抗性基因在动物(3,4]。具体来说,抗生素使用加速的频率在基因组水平基因转移和耐药基因固定,这被认为是主要原因的出现多重耐药革兰氏阴性细菌(MDR) (5,6]。此外,据报道,畜牧业占总使用抗生素多达一半的抗生素在中国生产。自由和持续使用抗生素可能导致水库MDR的细菌,它出现了严重威胁人类和动物健康。因此,另一种抗生素剂是在畜牧业迫切需求7,8]。

蛭弧菌属bacteriovorus很小(0.2 - -0.5μm×0.5 - -2.5μm), uniflagellate,高度能动的革兰氏阴性细菌,属于一群细菌食肉动物叫什么蛭弧菌属就像生物(BALOs)猎物自然其他革兰氏阴性bacte - ria (9,10]。最这一组的成员,b . bacteriovorus可以连接到输入猎物周质,乘以使用宿主营养,然后溶解细胞释放的后代将继续寻找新的猎物入侵。大量研究表明,b . bacteriovorus控制范围广泛的革兰氏阴性细菌在体外和在活的有机体内。据报道抑制MDR的细菌感染。此外,最近的出版物已经证明对革兰氏阳性菌株b . bacteriovorus的限制性影响,金黄色葡萄球菌等b . bacteriovorus能有效地抑制金黄色葡萄球菌生物膜的形成,降低其毒性。尽管如此,b . bacteriovorus发现没有负面影响高等生物,包括动物和人类细胞。因此,b . bacteriovorus一直作为益生菌或生活的明智的候选人抗生素抑制细菌感染在畜牧业11- - - - - -19]。

b . bacteriovorus无处不在的陆生、水生环境,如土壤、根际和水,等。迄今为止,大多数研究有关吗b . bacteriovorus基于隔离从土壤和水等自然环境,而动物胃肠道tract-derived菌株很少参与。相比与传统的隔离(从水和土壤),隔离从动物消化道应该更适合应用于畜牧业,由于他们的生存能力在动物消化道的酸性和热环境。这使得胃肠道tract-derived隔离一个强有力的候选人,抑制病原体感染,特别是革兰氏阴性细菌,动物甚至人类肠道。我们的研究旨在检测的存在b . bacteriovorus在猪消化道,我们专注于隔离,标识和捕食猪stomach-derived应变的能力。这里介绍的工作亮点猪stomach-derived的潜在用途b . bacteriovorus作为一个有前途的替代代理控制畜牧业(革兰氏阴性细菌感染20.- - - - - -25]。

材料和方法

伦理语句

所有手术和动物护理程序在本研究遵循协议批准由中国法规和制度动物保健。

样本收集:Digesta随机收集在消化道(胃、十二指肠、回肠、盲肠和结肠)的四个Erhualian猪在同一农场。样品的一部分用于社区总DNA提取检测的丰富b . bacteriovorus各肠段qPCR;剩下的是孤立进行的b . bacteriovorus双层的技术。样本期间保持冷藏运输的实验室。

Digesta DNA提取

社区总DNA被QIAamp快速提取DNA凳子迷你包(试剂盒、希尔登,德国)制造商的指示。提取后,DNA浓度由Nano-Drop量化分光光度计(美国特拉华州热费希尔科学)在260 nm,连同260/280的比例。DNA样本存储在20°C。

定量pcr

定量PCR (qPCR)实施的标准曲线测定的丰富b . bacteriovorus在我们的样本。蛭弧菌属特殊引物和水解探测器是用来放大b . bacteriovorus特定区域的16 s rDNA序列。短暂,底漆使用Bd347F (3“-GGAGGCAGCAGTAGGGAATA-5”)和Bd549R (5“-GCTAGGATCCCTCGTCTTACC-3”),当探测器Bd396P (5 'fam-ttcatcactcacgcggcgtc-tamra3”)。qPCR反应混合是由10μL预混料TaqTM交货(探针qPCR)(豆类生物。公司,大连,中国),1.8μL(900海里)的引物,0.1μL探针(50 nM),和4μL模板。最终的反应体积与ddH 20μL调整₂o .热循环条件:95°C初始变性步骤(2分钟),紧随其后的是50 95°C变性的重复步骤(15秒)和一个60°C退火和延伸步骤(1分钟)。在退火阶段收集的数据。每个样品一式三份进行。建立标准曲线,一个积极的质粒被量化光谱学在260 nm和连续稀释10倍的范围109 - 103册。丰度值表示为“Lg (g副本¹)的样品26- - - - - -29日]。

菌株和隔离程序

剩下的从猪消化道用于digestab . bacteriovorus隔离。假单胞菌stutzeri被当作猎物0.5克样本无菌添加到5毫升无菌生理盐水。涡流使均匀彻底,孵化的稀释假单胞菌stutzeri使用双层技术(Stolp和斯塔尔1963)。具体地说,500μL每个稀释混合300μL暂停假单胞菌stutzeri在熔融营养琼脂稀释0.4%,混合传播到1%稀释营养琼脂板底部,然后向左盘子是不受干扰的巩固和孵化37°C 48 - 96 h对斑块的形成。斑块是可见的在48 - 60 h和他们认为是潜在的b . bacteriovorus经过进一步扩张了好几天。净化,单个斑块被连续培养纯化,直到溶解性斑块在琼脂板大小都是一样的。

电子显微镜

检查攻击阶段的形态b . bacteriovorus,一滴新鲜溶解产物被放在显微镜下铜网格在室温下2分钟。网格与一对钳,然后轻轻举起,多余的液体被吸去。样本然后counter-stained 1% (wt卷¹磷钨酸溶液(pH = 6.4) 30分钟,检查日立h - 7650透射电子显微镜。

PCR扩增

从细菌DNA的猎物,避免潜在的放大蛭弧菌属特殊技能底漆(底漆842 r;5 ' -CGWCACTGAAGGGGTCAA - 3 ')和bacteria-specific底漆(底漆63 f;5“-CAGGCCTAACACATGCAAGTC-3”)进行在PCR扩增16 s rDNA stomach-derived孤立的部分序列(Jurkevitch和Ramati) (22]。英杰公司的引物合成生物。公司(上海,中国)。PCR(25μL混合物)进行了通过使用一个可编程循环反应器(Biometra,哥廷根,德国)。每个反应混合物包含12.5μL 2 x反应缓冲区,1.25 U预混料的Taq(豆类生物。公司,大连,中国),0.5μL每个引物,对新鲜的溶解产物1μL模板,10.5μL ddH₂o . 95°C的PCR循环由最初的变性步骤(3分钟),34个周期94°C的变性步骤(1分钟),53°C退火步骤(50)和72°C扩展步骤(30岁)和最后一个扩展步骤10分钟在72°C。PCR产品2%琼脂糖凝胶上电泳检查成功的放大。b . bacteriovorus109 j作为积极的控制,提供的生物。公司(南京,中国)。

系统发育分析16 s rDNA序列

stomach-derived隔离的PCR产物直接测序表达载体生物。公司(上海,中国)。当时获得的16 s rDNA部分序列存入数据库基因库。BLAST-N搜索被用来确定物种最相关的隔离S1。此外,系统发育树构建使用Neighbor-joining方法以最大组合可能性模型和引导分析1000复制Mega6 [23]。

隔离S1的捕食能力大肠杆菌和沙门氏菌

孤立的捕食能力S1大肠杆菌和沙门氏菌形成明确的评估其能力裂解晕一个草坪上猎物的双层技术。这两个猎物最初从江苏省仔猪的粪便分离在这个实验室,和猎物细胞种植在磅12 h (Luria-Bertani)肉汤(cata Inc .、青岛、中国)达到106 CFU毫升的浓度¹。0.3毫升新鲜猎物细胞被添加到0.5毫升新鲜攻击阶段b . bacteriovorus和5毫升的0.4%熔融营养琼脂稀释如上所述。他们混合,倒在预热底部琼脂。盘子也孵化48 - 96 h在37°C。猎物的细菌被视为敏感如果双层琼脂板上的任何明显出现斑块,如果否则和犹豫。每个猎物细菌组有六个复制。

统计分析

方差分析(方差分析)和t检验进行了在这项研究中,统计分析使用GraphPad棱镜(Windows版本6.01)和P值小于或等于0.05被认为是显著的。

结果与讨论

丰富的b . bacteriovorus在猪消化道

b . bacteriovorus大量被qPCR调查评估其在猪消化道。使用的引物和探针qPCR与前面的研究报告(Iebba等)。所示图1,b . bacteriovorus显然是出现在所有五个肠段,即。,10 g e3.15副本¹内容在胃,10 g e2.77副本¹内容在十二指肠,10 g e3.94副本¹内容在回肠,10 g e4.32副本¹在盲肠内容,10 g e3.82副本¹在结肠内容。值得注意的是在盲肠的最高水平和十二指肠最低(P < 0.05)。

我们最好的知识,这是第一个研究证实的存在b . bacteriovorus在每一段的猪消化道。b . bacteriovorus于1962年首先由意外发现Stolp和风格的作品当他们试图从土壤对植物病原菌分离噬菌体(20.]。最初的发现之后,b . bacteriovorus被隔离在不同环境中广泛分布,发现陆生、水生环境(21]。进行了大量研究专注于其毒性,猎物范围、多样性和基因组学14,17]。然而,几乎没有信息分布或描述在猪消化道。在这里,我们的研究结果表明b . bacteriovorus确实存在于猪消化道的每一部分。值得注意的是,动物的胃并不适合细菌的生长由于低pH值(26,27]。哺乳动物的胃里的细菌的总数是通常维持在10³-10年⁴细菌细胞g¹内容(28]。然而,由于qPCR建议的数量b . bacteriovorus猪胃里是103.15 g副本¹内容(图1),占总细菌的比例高的猪的胃。由于这个,我们推测b . bacteriovorus可能有一个很好的适应胃的酸性环境,扮演一个角色在胃生态系统保持平衡。此外,qPCR结果没有显示数值的一个巨大的差别b . bacteriovorus前胃肠道和后胃肠道之间。可能的原因是b . bacteriovorus是兼性需氧细菌,不可能存在于胃肠道后很长一段时间。这个结果也符合Iebba的丰度的研究b . bacteriovorus在人类肠道健康13,29日]。

隔离b . bacteriovorus从猪的肚子

确认的存在b . bacteriovorus在猪消化道随后隔绝五段。孵化的斑成为可见的48 h后37°C,随着时间的推移与规模扩大,达到4.0 - -6.0毫米96 h (表1)。与噬菌体斑块,这些斑块发展更慢和扩展。其中,分离猪胃在最短的时间内形成最大的斑块,展示最伟大plaques-forming倾向(表1)。在此基础上,stomach-derived隔离,隔离S1表示,是后续特征选择(图2一个)。

表1:斑块的特征形成的隔离在猪消化道从五个部分

隔离S1是第一个报道b . bacteriovorus从猪消化道隔离。因为猪胃的特殊环境,它可能比传统的两个潜在的优势b . bacteriovorus(来自土壤和水)用于畜牧业:(i)隔离S1的孵化温度是37°C,这是接近动物胃肠道的温度,而不是传统的28°C株(20.- - - - - -22),(2)隔离S1的极好的适应低pH值提供更广泛的宽容居住环境,而对于传统的菌株(最佳pH值从7.0 - -7.6),一个酸环境可能导致鞭毛脱落,大大降低捕食能力(30.]。因此,隔离S1往往比传统的菌株在维持活力和在动物胃肠道中扮演一定的角色(图2 b)。

图2:a .斑块由stomach-derived隔离;b .透射电子显微照片的隔离S1攻击阶段;c .斑块数量在大肠杆菌和隔离S1沙门氏菌板;d .放大隔离S1的16 s rDNA部分序列;大肠系统树基于16 s rDNA孤立的部分序列S1。

识别孤立S1

电子显微镜观察和分子方法(16 s rDNA序列分析)被用来识别孤立S1b . bacteriovorus。图2 b显示隔离S1显然是椭圆形的表型与一个极护套一端鞭毛。至于体型,隔离S1大约是0.7 - -0.8μm在宽度、长度和0.4 - -0.5μm鞭毛4.2 - -4.3μm的长度。根据电子显微镜观察,隔离S1的形态学特征与典型的形态特征一致b . bacteriovorus,即,a small, vibrioid bacteria with a long, thick-sheathed polar flagellum. This phase was called an attack phase, where the cells are highly motile by the long polar flagellum in order to seek the prey to attack [31日]。形态来说,隔离S1可以确定为b . bacteriovorus。

电子显微镜观察本身没有足够的识别孤立S1, 16 s rDNA序列分析需要最决定步骤确认菌株(9]。孤立的16 s rDNA部分序列S1成功地放大了蛭弧菌属特定的引物(图2 d)。爆炸序列相似性搜索表明,放大显示97%的16 s rDNA部分序列相似性b . bacteriovorusHD 100的基因库数据库。系统发育树,一起孤立S1有密切的关系b . bacteriovorusHD 100 (图2 e)。(约16 s rDNA部分序列。0.8 kb)的隔离S1已经提交给数据库加入没有基因库。KX082773。

对大肠杆菌和隔离S1捕食能力沙门氏菌

大肠杆菌和沙门氏菌,这可能会引起严重的肠胃炎和腹泻动物(32)被用来评估隔离S1的捕食能力。图2 c表明,斑块的数量为114.5±2.0 PFU毫升¹空斑形成单位和200.5±1.5毫升¹为大肠杆菌和沙门氏菌板块分别为37℃,。这表明,隔离S1猎物大肠杆菌和能力沙门氏菌。值得一提的是,有一个显著差异之间的斑块的数量沙门氏菌集团和大肠杆菌组(P < 0.05),这可能意味着孤立S1更可能的猎物沙门氏菌在大肠杆菌。孤立的事实S1猎物两种革兰氏阴性细菌暗示这可能是潜在的一个替代抗生素剂来控制革兰氏阴性细菌感染,尤其是沙门氏菌在畜牧业(图2 d和2 e)[33,34]。

确认

本研究的资助支持的“畜牧和水产养殖复杂生命起源以前的产品”(项目号HM0013)。

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