猪胃肠道中弯曲弧菌的丰度及猪胃源菌株的分离、鉴定及捕食能力

摘要

Bdellovibrio bacteriovorus是一种以其他革兰氏阴性细菌为食的掠食者。因此，它被认为是一种潜在的抗生素替代剂，可以缓解畜牧业中多重耐药(MDR)革兰氏阴性细菌感染的出现。关于猪胃肠道中B. bacteriovorus的详细研究很少报道。本研究主要对猪胃肠道中B. bacteriovorus丰度的检测，以及胃源B. bacteriovorus的分离、鉴定和捕食能力进行研究。在我们的研究中，从猪胃肠道的每个片段中提取总细菌DNA，然后用qPCR进行分析。结果表明，猪胃肠道中确实存在拟杆菌，且盲肠(10e4.32 copies g-1)和十二指肠(10e2.77 copies g-1)的数量差异显著(P<0.05)。同时从猪胃食糜中分离到B. bacteriovorus，通过透射电镜(TEM)和16S rDNA序列分析进一步证实了B. bacteriovorus的存在。以大肠杆菌和沙门氏菌为食材，在37℃条件下对其进行捕食性实验。因此，该分离物有望在畜牧业革兰氏阴性菌感染的控制中发挥一定的作用。

关键字

生态系统;细菌感染;基因组;营养物质

简介

60多年来，抗生素在动物疾病治疗和生长促进方面发挥着至关重要的作用[1］．它们在促进动物生长速度、提高饲料效率和降低动物死亡率方面的作用已被充分证明，在饲料中唯一的亚治疗性水平[2］．尽管抗生素对畜牧业有明显的好处，但也存在一些潜在的问题，可能影响人类和动物的健康。在过去40年里，越来越多的直接和间接证据表明，畜牧业抗生素的使用与动物体内相关耐药基因的增加和传播之间存在相关性[3.，4］．具体而言，抗生素的使用加速了基因组中水平基因转移和耐药基因固定的频率，这被认为是多重耐药(MDR)革兰氏阴性细菌出现的主要原因[5，6］．此外，据报道，畜牧业抗生素的使用总量占中国抗生素生产总量的一半。大量和持续使用抗生素可能会形成耐多药细菌库，这已成为对人类和动物健康的严重威胁。因此，畜牧业迫切需要一种替代抗生素制剂[7，8］．

蛭弧菌属bacteriovorus是一种微小(0.2 ~ 0.5 μm × 0.5 ~ 2.5 μm)的单鞭毛菌，具有很强的运动性革兰氏阴性菌，属于一种叫做蛭弧菌属以及以其他革兰氏阴性杆菌为天敌的生物(balo) [9，10］．作为这个群体中最具特色的成员，b . bacteriovorus可以附着并进入猎物的周围质，通过消耗宿主的营养物质来繁殖，然后溶解细胞释放出后代，这些后代将继续寻找新的猎物进行入侵。大量研究表明，b . bacteriovorus控制广泛的革兰氏阴性细菌在体外而且在活的有机体内．据报道，它也能抑制耐多药细菌感染。此外，最近的出版物已经证明了B. bacteriovorus对革兰氏阳性菌株的抑制作用，如金黄色葡萄球菌，其中b . bacteriovorus可有效抑制金黄色葡萄球菌生物膜的形成，降低其毒力。尽管如此,b . bacteriovorus发现对高等生物，包括动物和人类细胞没有负面影响。因此,b . bacteriovorus已被认为是益生菌或活抗生素在畜牧业中抑制细菌感染的明智人选[11-19］．

b . bacteriovorus普遍存在于土壤、根际、水等陆地和水生环境中。到目前为止，大多数研究与b . bacteriovorus是基于从土壤和水等自然环境中分离出的菌株，而来自动物胃肠道的菌株很少涉及。与传统的(来自水和土壤的)分离株相比，来自动物胃肠道的分离株在动物胃肠道的酸性和热环境中具有生存能力，应该更适合应用于畜牧业。这使得胃肠道来源的分离物在动物甚至人类肠道中抑制病原体感染，特别是革兰氏阴性细菌方面成为一种强有力的候选者。我们的研究旨在发现b . bacteriovorus在猪胃肠道中，重点研究猪胃源性毒株的分离、鉴定和捕食能力。这里介绍的工作强调了猪胃来源的潜在用途b . bacteriovorus作为畜牧业中控制革兰氏阴性细菌感染的一种有前途的替代制剂[20.-25］．

材料与方法

伦理语句

在整个研究过程中，所有手术和动物护理程序都遵循中国法规和动物护理机构批准的协议。

样本采集:在同一农场的4头二花莲猪的胃肠道(胃、十二指肠、回肠、盲肠和结肠)中随机采集食糜。部分样品用于总群落DNA提取，以检测其丰度b . bacteriovorusqPCR检测各肠段;剩下的部分是用来隔离的b . bacteriovorus通过双层技术。样品在运送到实验室的过程中被冷藏。

食糜DNA提取

使用QIAamp快速DNA Stool Mini Kit (QIAGEN, Hilden, Germany)按照制造商说明提取总群落DNA。提取后，用nanodrop分光光度计(Thermo Fisher Scientific, Delaware, USA)在260 nm处定量DNA浓度，并按260/280比例定量。DNA样本保存在20°C。

定量pcr

采用定量PCR (qPCR)方法，采用标准曲线法测定其丰度b . bacteriovorus在我们的样本中。蛭弧菌属-特异性引物和水解探针用于扩增ab . bacteriovorus16S rDNA序列的特定区域。简而言之，所用引物为Bd347F (3 ' -GGAGGCAGCAGTAGGGAATA-5 ')和Bd549R (5 ' - gctaggatccctcgtcttac -3 ')，探针为Bd396P (5 ' fam - ttcatcactcacgcggcgtc - tamra3 ')。qPCR反应混合物由10 μL Premix Ex TaqTM (Probe qPCR)组成。引物用量为1.8 μL (900 nM)，探针用量为0.1 μL (50 nM)，模板用量为4 μL。用ddH调节最终反应量至20 μL₂O.热循环条件为:95°C初始变性步骤(2分钟)，随后95°C变性步骤(15秒)重复50次，60°C退火和延伸步骤(1分钟)。在退火阶段收集数据。每个样本重复三次。为了构建标准曲线，用光谱在260 nm处定量阳性质粒，并在109-103拷贝范围内连续稀释10倍。丰度值表示为Lg(拷贝g^－1)的样本[26-29］．

菌株和分离程序

剩下的来自猪胃肠道的食糜用于b . bacteriovorus隔离。假单胞菌stutzeri取0.5 g样品无菌加入5 mL无菌生理盐水中。漩涡稀释，使其完全均质，并与假单胞菌stutzeri使用双层技术(Stolp和Starr 1963)。具体地说，每种稀释剂500 μL与300 μL的悬液混合假单胞菌stutzeri在0.4%熔融稀释的营养琼脂中，将混合物繁殖到1%稀释的营养琼脂底板上，然后静置平板固化，37℃孵育48-96 h，形成斑块。在48至60小时内可见斑块，认为是潜在斑块b . bacteriovorus经过几天的进一步扩张。纯化时，通过连续培养来纯化单个斑块，直到琼脂板上的溶斑大小均匀。

电子显微镜

检查发作期的形态b . bacteriovorus，取一滴新鲜裂解液，室温下置于显微镜铜栅上2min。然后用镊子轻轻提起网格，通过吸干去除多余的液体。然后用1% (wt vol)反染样品^－1)磷钨酸溶液(pH=6.4)浸泡30分钟，用日立H-7650透射电子显微镜观察。

PCR扩增

为了避免潜在的细菌猎物DNA扩增蛭弧菌属-专用处理剂(处理剂842R;5 ' - cgwcactgaaggggtcaa - 3 ')和细菌特异性引物(引物63F;5 ' -CAGGCCTAACACATGCAAGTC-3 ') PCR扩增胃源分离物(Jurkevitch和Ramati)的16S rDNA部分序列[22］．引物由Invitrogen Bio公司合成。(上海，中国)。PCR (25 μL混合物)采用可编程循环反应器(Biometra, Goettingen, Germany)进行。每个反应混合物含有12.5 μL 2X反应缓冲液，1.25 U的Premix Taq聚合酶(Takara Bio。引物0.5 μL，新鲜裂解液模板1 μL, ddH 10.5 μL₂O. PCR周期包括95°C初始变性步骤(3分钟)、94°C变性步骤(1分钟)、53°C退火步骤(50秒)、72°C延伸步骤(30秒)和72°C最终延伸步骤(10分钟)。PCR产物在2%琼脂糖凝胶上电泳，以检查扩增是否成功。b . bacteriovorus109J为阳性对照，由Field Bio公司提供。(中国南京)

16S rDNA序列的系统发育分析

胃源分离物PCR产物由Invitrogen Bio直接测序。(上海，中国)。获得的16S rDNA部分序列存入Genbank数据库。采用BLAST-N搜索法鉴定与分离株S1亲缘关系最好的种。此外，利用最大复合似然模型的Neighbor-joining方法和Mega6软件对1000个重复进行自举分析，构建了系统发育树[23］．

分离株S1的捕食能力大肠杆菌而且沙门氏菌

分离物S1的捕食能力大肠杆菌而且沙门氏菌采用双层技术对其在猎物草地上形成清晰的溶出光晕的能力进行了评估。本实验室最初从江苏省的仔猪粪便中分离出这两种猎物，将猎物细胞在LB (Luria-Bertani)肉汤(海波公司，青岛，中国)中培养12 h，使其浓度达到106 CFU mL^－1．将0.3 mL新鲜猎物细胞加入0.5 mL新鲜攻击阶段b . bacteriovorus和上述0.4%熔融稀释的营养琼脂5毫升。混合后倒在预热好的底琼脂上。在37°C下孵育48-96 h。如果双层琼脂板上有明显的菌斑，猎物细菌被认为是易感的，否则不易感。每个猎物细菌组有6个重复。

统计分析

本研究采用方差分析(ANOVA)和t检验，采用GraphPad Prism (Windows版本6.01)进行统计分析，P值≤0.05被认为是显著的。

结果与讨论

丰富的b . bacteriovorus在猪胃肠道中

b . bacteriovorus通过qPCR检测其在猪胃肠道中的丰度。引物和探针与之前报道的qPCR相同(Iebba等)。如图1，b . bacteriovorus均清晰地存在于所有5个肠段，即10e3.15个拷贝g^－1胃内容物10e2.77份g^－1十二指肠含量10e3.94份^－1回肠内容物，10e4.32拷贝g^－1盲肠内容物，10e3.82份^－1内容在冒号。值得注意的是，盲肠最高，十二指肠最低(P<0.05)。

据我们所知，这是第一次证实存在b . bacteriovorus在猪胃肠道的每一部分b . bacteriovorus是Stolp和Petzold在1962年偶然发现的，当时他们试图从土壤中分离出用于植物致病菌的噬菌体[20.］．在他们最初被发现后，b . bacteriovorus从不同生境分离出来，广泛分布于陆生及水生环境[21］．研究人员对其毒性、猎物范围、多样性和基因组学进行了大量研究[14，17］．然而，关于其在猪胃肠道中的分布或特征的信息很少。在这里，我们的结果表明b . bacteriovorus确实存在于猪胃肠道的每一部分。值得注意的是，由于pH值较低，动物的胃不足以供细菌生长[26，27］．哺乳动物胃中的细菌总数通常维持在10个^3.-10年⁴细菌细胞g^－1内容(28］．然而，qPCR结果提示b . bacteriovorus在猪胃中为103.15拷贝g^－1内容(图1)，这可能占猪胃细菌总数的较高比例。因此，我们推测b . bacteriovorus可能对胃的酸性环境有良好的适应能力，对维持胃生态系统的平衡有一定的作用。此外，qPCR结果在数值上并没有太大的差异b . bacteriovorus前消化道和后消化道之间。可能的原因是b . bacteriovorus是兼性需氧细菌，不能长期存在于后消化道。这一结果也与伊巴关于丰富的b . bacteriovorus在健康的人体肠道中13，29］．

隔离b . bacteriovorus选自《猪肚子》

对存在的确认b . bacteriovorus从猪胃肠道中分离出5个片段。在37°C孵育48小时后，斑块变得可见，斑块大小随着时间的推移而扩大，在96小时时达到4.0-6.0 mm (表1)．与噬菌体斑块不同，这些斑块发育得更慢，并随着时间的推移而扩大。其中，猪胃分离株在最短时间内形成的斑块最大，表现出最大的斑块形成趋势(表1)．在此基础上，选择胃源性分离物，记为分离物S1进行后续表征(图2一个)．

表1:猪胃肠道5个片段分离株形成斑块的特征

分离体S1是首次报道b . bacteriovorus从猪胃肠道中分离出来。由于猪胃的特殊环境，它可能比传统的猪胃菌株有两个潜在的优势b . bacteriovorus(来源于土壤和水)在畜牧业中的应用:(i)分离株S1的培养温度为37℃，更接近动物胃肠道温度，而传统菌株的培养温度为28℃[20.-22]， (ii)分离菌株S1对较低pH的极好适应性使其对居住环境有更大的耐受能力，而对于传统菌株(最佳pH值为7.0-7.6)，酸性环境会导致鞭毛脱落，并大大降低捕食能力[30.］．因此，分离出的S1菌株在保持活力方面优于传统菌株，并在动物胃肠道中发挥一定的作用(图2 b)．

图2A.胃源性分离物形成的斑块;B.分离物S1发作期透射电镜图;C.菌斑数量由分离的大肠杆菌S1和沙门氏菌板;D.分离物S1 16S rDNA部分序列扩增;E.基于分离S1 16S rDNA部分序列的系统发育树。

分离物S1的鉴定

利用电子显微镜观察和分子方法(16S rDNA序列分析)鉴定分离物S1为b . bacteriovorus．从图2B可以看出，分离株S1的表型明显为椭圆形，一端为单极鞘状鞭毛。分离体S1长0.7 ~ 0.8 μm，宽0.4 ~ 0.5 μm，鞭毛长4.2 ~ 4.3 μm。根据电镜观察，分离株S1的形态特征与典型的形态特征一致b . bacteriovorus即一种小的弧菌，具有长而厚鞘的极性鞭毛。这个阶段被称为攻击阶段，在这个阶段，细胞通过长极鞭毛高度运动，以寻找猎物进行攻击[31］．从形态学上讲，分离出的S1可以被鉴定为b . bacteriovorus．

仅电子显微镜观察不足以鉴定分离的S1, 16S rDNA序列分析是确认菌株的最决定性步骤[9］．分离物S1的16S rDNA部分序列被成功扩增蛭弧菌属特定引物(图2 d)．BLAST相似性搜索结果表明，扩增序列与16S rDNA部分序列的相似性为97%b . bacteriovorusGenbank数据库中的hd100。从系统发育树来看，分离株S1与b . bacteriovorushd100 (图2 e)．16S rDNA部分序列(约。0.8 kb)的分离物S1已提交到Genbank数据库，登录号为。KX082773。

分离物S1对大肠杆菌和大肠杆菌的捕食能力沙门氏菌

大肠杆菌和沙门氏菌，可引致动物患上严重的肠胃炎及腹泻[32]，评价分离物S1的捕食能力。图2 c斑块数量为114.5±2.0 PFU mL^－1200.5±1.5 PFU mL^－1为大肠杆菌而且沙门氏菌板分别在37℃时。这表明分离的S1能够捕食大肠杆菌和大肠杆菌沙门氏菌．值得一提的是，两组间的斑块数量有显著差异沙门氏菌集团和大肠杆菌组(P<0.05)，说明孤立S1更容易捕食沙门氏菌在大肠杆菌．分离出的S1能同时捕食革兰氏阴性菌，这一事实表明，它可能是一种潜在的替代抗生素制剂，特别是控制革兰氏阴性菌感染沙门氏菌，在畜牧业(图2 d而且2 e) [33，34］．

确认

本研究由“畜牧和水产养殖复合益生元产品”项目资助(项目编号:;HM0013)。

参考文献

1. 农业中的抗生素促生长剂:历史和作用模式。家禽科学。2005; 84:634 - 643。
2. 为什么以及如何在养猪生产中使用抗生素?生物科技，2005;13:7-27。
3. Aarestrup FM和Wegener HC。食用动物中抗生素的使用对人类弯曲杆菌和大肠杆菌抗微生物药物耐药性的发展的影响。微生物感染1999;1:639-644。
4. 价格LB等。金黄色葡萄球菌CC398:宿主适应和牲畜甲氧西林耐药的出现。MBio。2012; 3: e00305 - 00311。
5. Leverstein-van Hall等人。在临床环境中多种耐药肠杆菌科中整合子介导的抗微生物耐药性基因的广泛种间转移的证据。中国传染病杂志，2002;
6. Gillings MR和Stokes H.人类正在增加细菌的分解能力吗?生态环境学报。2012;27:346-352
7. Hvistendahl M.中国瞄准了猖獗的抗生素耐药性。科学。2012;336:795 - 795。
8. 马丁内斯杰。自然环境中的抗生素和抗生素抗性基因。科学。2008;321:365 - 367。
9. 斯奈德AR. 16S rDNA序列分析环境蛭弧菌及样生物(BALO)显示广泛的多样性。中国生物医学工程学报，2002;23(2):389 - 394。
10. 蛭弧菌属。在原核生物中。2006; 3:12-30。
11. 嗜菌弧菌的掠食性生活方式。微生物学报。2009;63:523-539。
12. Sockett RE和Lambert C. bdello弧菌作为治疗剂:掠夺性复兴?微生物学杂志，2004;2:669-675。
13. Dwidar M，等。弯曲弧菌具有益生菌和抗生素的双重性质。BMB代表2012;45:71-78。
14. Kadouri DE，等。掠食性细菌:对抗多重耐药革兰氏阴性病原体的潜在盟友。科学通报。2013;8:e63397。
15. Lebba V等人。弯曲杆菌弧菌直接攻击绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌囊性纤维化分离株。前沿微生物，2014;5:280。
16. Monnappa AK，等。拟杆菌弧菌抑制金黄色葡萄球菌生物膜的形成和侵入人上皮细胞。科学通报2014;4:3811。
17. Atterbury RJ，等。口服拟杆菌弧菌对雏鸡健康和沙门氏菌定殖的影响。应用环境微生物学杂志，2011;
18. Shatzkes K，等人。在小鼠模型上探讨呼吸和静脉接种芽孢弧菌和绿脓弧菌的安全性。科学通报2015;5:12899。
19. 伦茨RW和赫斯贝尔RB。试图将蛭弧菌显微注射到动物细胞中。《微生物学报》1978;
20. Stolp H和Starr M. Bdellovibrio bacteriovorus gen. et sp. n.，一种掠食性、体外寄生和溶菌微生物。安东尼·范·列文虎克，1963;29:217-248。
21. Jurkevitch E，等。猎物范围特征，核型，土壤和根际弧菌的多样性。分离于植物致病菌上。应用环境微生物。2015;66: 2365 - 2371。
22. Jurkevitch E和Ramati B.蛭弧菌16S rrna靶向寡核苷酸的设计和使用。FEMS微生物学快报。2000; 184:265 - 271。
23. 邻接法:一种重建系统树的新方法。生物化学学报，1987;4:406-425。
24. 泰勒六世等。海洋蛭弧菌的分离、计数及寄主范围。拱microbiol。1974; 98:101 - 114。
25. Fry J和Staples D.污水处理厂、河水和沉积物中芽孢弧菌的分布。应用环境微生物。1976; 31:469 - 474。
26. Crossman LC，等。一个小的掠夺性核心基因组在分歧的海洋Bacteriovorax marinus SJ和陆地Bdellovibrio bacteriovorus。ISME。2013; 7:148 - 160。
27. 詹森BB。改变肠道微生物发酵产物的类型和数量的可能方法。第8届猪消化生理研讨会论文集:肠道环境对肠道因子的影响，瑞典乌普萨拉，6月19日。
28. Mackie RI，等。新生儿胃肠道发育微生物生态。Am J临床营养学。1999; 69:1035s - 1045。
29. Lebba V等人。在健康受试者的人体肠道中，蛭弧菌的患病率和丰度较高。科学通报，2013;8:e61608。
30. 杰克逊L和怀廷RC。在不同体外寄生条件下:宿主比例、温度或ph对嗜杆菌弧菌减少大肠杆菌K12种群的影响。食品保护杂志1999;55:859-870。
31. Lambert C等人。蛭弧菌:在捕食周期中的生长和发育。微生物学杂志，2006;9:639-644。
32. Page JA等。利用体外模型研究蛭弧菌作为一种新的收获前干预措施控制牛大肠杆菌O157:H7和沙门氏菌的功效。《食品科学》2015;78:1745-1749。
33. Van Essche M, et al.(2009)一种用于Bdellovibrionaceae枚举的定量PCR方法的开发和性能。环境微生物学报，2009;1:28 -233。
34. 李华，等。深圳大亚湾分离的两种海洋类弯曲弧菌的生物学特性及其在牡蛎副溶血性弧菌清除中的应用。食品微生物学杂志，2011;151:36-43。