噻嗪酮通过小说的有氧降解降解中间体的红球菌属RX-3 sp.压力

文摘

噻嗪酮是一种常用的化学吸引害虫满意疗效,但其处理会导致严重的环境问题。在这项研究中,一个细菌菌株RX-3孤立的连续浓缩buprofezin-treated土壤测试噻嗪酮的生物降解。红球菌属的细菌最相似sp.基于形态学、生理生化特征、以及系统发育位置推断从16 s rRNA基因序列。应变RX-3被发现能够利用噻嗪酮为唯一碳源生长在广泛的温度(25-45°C)和pH值(5.0 - -9.0)条件。它可以完全降解60 mg / L的噻嗪酮在80 h,和金属,如媒体2 +,Zn2 +和Cu2 +。此外,六个新发现的代谢物中形成噻嗪酮降解被发现,由气相色谱分析-质谱法(gc - ms),我们提出了一个新颖的降解途径。我们的研究结果表明,红球菌属sp。RX-3可能是潜在的生物修复代理buprofezin-contaminated环境。

关键字

噻嗪酮;降解途径;生物降解;红球菌属sp。

介绍

噻嗪酮是一种新型杀虫剂生长调节剂,扰乱了不成熟的发展形式的干扰几丁质合成(1- - - - - -3]。这种化合物会影响重要的害虫,包括烟粉虱、飞虱、叶蝉、尺度(4]。它是一种稳定的化合物,长半衰期在自然环境中,即在有氧土壤(26 - 220天4),大约36 - 104天淹没场条件下(5]。因此,其残留物可以保存在应用程序网站和牲畜像茶一样,米饭,土豆,柑橘类水果,棉花,和蔬菜,因此很容易产生累积效应,对人体健康是有害的(4]。

噻嗪酮的密集使用在农业、以及存储不当和它的副作用使化合物高度危险(6),它的治疗和处理已成为重要的环境问题。虽然农药可以通过化学和物理过程,退化microbe-mediated新陈代谢仍是主要机制负责其在环境中降解[6,7]。然而,到目前为止,只有三个菌株能够降解噻嗪酮有记载4,5,8),降解通路尚未完全发现(4,5]。在这个报告中,我们描述的隔离和表征红球菌属sp。应变能力的增长使用噻嗪酮作为唯一碳源。微生物降解的特点也buprofezin-degrading途径提出了评估和小说。

材料和方法

培养基和化学品

细菌降解活动的丰富和测试基础盐介质(毫米)5)包含K2HPO4 (1.5 g / L), KH₂阿宝₄NH (0.5 g / L)₄没有₃(1.0 g / L), MgSO₄•7 h₂O (0.2 g / L)和生理盐水(1.0 g / L)。MM是补充与噻嗪酮(60 mg / L;σ-奥尔德里奇)丰富buprofezin-degrading细菌,这称为mm - 1。Luria-Bertani介质(10.0 g / L胰蛋白胨,5.0 g / L酵母提取物,和5.0 g / L氯化钠,pH值7.0)被用于制备buprofezin-degrading应变种子在液体(5]。固化媒体准备1.5% (w / v)琼脂。

buprofezin-degrading细菌富集、筛选和鉴定

总共10 g buprofezin-manufacturing收集土壤样本的工厂,在江苏(中国),然后被添加到100毫升mm - 1中在500毫升锥形烧瓶。接种物在30°C孵化用颤抖的160 rpm。每个星期,5毫升的文化被收获离心分离在4°C 5000 Xg 5分钟之前被转移到一个新的富集培养基。三转移后,浓缩文化假定包含细菌能够降解噻嗪酮进一步稀释和培养在磅含有100 mg / L噻嗪酮的琼脂。殖民地种植在这些板块分离,进一步纯化前被测试的buprofezin-degrading功能描述的方法由陈et al。5]。4的隔离检测呈阳性,只有隔离RX-3被认为是对其他测试和进一步特征由于其高的活动。模型分离是生长在磅盘子48 h 30°C的殖民地,形态学和生化活动Bergey手册后决定细菌学[9]。

的身份RX-3也验证了种系发生16 s rRNA基因扩增和测序。顺便,总基因组DNA提取使用高盐沉淀协议从10毫升的细胞生长在磅媒体和孵化一夜之间在30°C (10]。目标基因放大使用通用引物27 r f (5“-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3”)和1492年(5“-GGCTACCTTGTTACGACTT-3”) (11]。PCR循环包括初始变性步骤10分钟在95°C,紧随其后的是30 30年代变性步骤的循环在94°C, 30年代退火步骤56°C, 30年代伸长72°C和最后一个扩展一步一步在72°C 10分钟使用标准TProfessional thermocycler (Biometra,德国)12]。放大产品验证正确的大小的琼脂糖凝胶(1%)电泳。然后,目标DNA片段与SanPrep纯化PCR净化设备(Sangon生物技术),然后送到Sangon生物技术有限公司有限公司(中国上海)单程Sanger测序也使用相同的PCR引物。相似和相关序列进行比较,从NCBI基因库下载数据库使用BLASTn方法(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)。多重序列比对与默认设置(使用Clustal X 1.8.3执行13]。系统发育分析是进行大型6.0 [14使用木村出现距离模型。系统发育树构建使用邻居加入方法引导支持测试重复1000次。RX-3的16 s rRNA基因序列测序(1411个基点)和沉积在基因库数据库加入KR906529数量。

增长和降解实验

准备测试,细菌菌株RX-3 pre-cultured在10毫升的LB培养基在30°C用颤抖的在160 rpm 24小时直到late-exponential增长。然后,细胞被离心收获在4°C 5000 Xg 5分钟,洗两次毫米和resuspended新鲜毫米(OD600 = 1.0)。对所有实验中,除非另有说明,否则细胞孵化为1% (v / v)比介质和孵化器进一步孵化瓶(160 rpm, 30°C)。所有的治疗进行了一式三份。

筛选细菌隔离的噻嗪酮降解活动是厄伦美厄烧瓶250毫升含有100毫升的mm - 1。然后,10毫升的样品收集瓶每16 h和噻嗪酮与同等容积的提取二氯甲烷(5]。噻嗪酮的浓度是由高效液相色谱法(HPLC)和生物监测通过测量OD600如下所述。调查的影响初始pH值和温度对噻嗪酮生物降解,孵化温度(25°C, 30°C, 35°C, 40°C, 45°C)和初始介质pH值(5.0,6.0,7.0,8.0,9.0)进行了研究。

金属离子对噻嗪酮降解的影响

金属离子对的降解活性的影响分离的细菌也决定通过增加60 mg / L噻嗪酮MM结合不同浓度的金属离子从0.1毫米至10毫米,以下称为MM-2。resuspended细菌文化与不同浓度在10毫升MM-2孵化(0.1毫米,1毫米,10毫米)的金属离子(铜^{2 +}、钙^{2 +},英航^{2 +},李⁺,锌^{2 +})。24小时后,噻嗪酮的提取和含量测定(如前所述15]。

化学分析

生物量浓度的RX-3监控通过测量光学细胞密度在波长600纳米(OD600)使用尤尼克公司4802(中国上海)。然而噻嗪酮的浓度是由高效液相色谱分析后Chen等人描述的过程。5]。总之,噻嗪酮首先与同等体积的二氯甲烷提取其次是脱水无水硫酸钠的加入,然后通过旋转蒸发浓缩。在这之后,残留在同等体积的甲醇溶解。噻嗪酮的浓度测定的高效液相色谱(安捷伦1200)光电二极管阵列探测器。这是配备YWG-C18反相柱(250毫米长度内直径4.6毫米)和2487双λ-Absorbance探测器。流动相在甲醇:水(85:15,v / v), 0.6毫升/分钟的流量。目标化合物被发现在245海里。

表达的代谢物在化验也决定使用前面介绍的方法做了一些调整(4]。这些都是由孵化细胞在10毫升液体mm - 1 5天,提取的gc - ms分析。这次不过,gc - ms是配备电子电离(EI)模式70 eV和mas 30 - 600 Da的范围。分析使用的列有30米长×250μm内径×0.25μm膜厚度。温度曲线包括初始温度为110°C 1分钟,然后增加到240°C在20°C /分钟和3分钟。氦用作载气流量的1.2 mL / min。

结果与讨论

应变隔离和标识

总共四个菌株进一步浓缩后得到,并测试在不同条件下的降解能力。应变RX-3因其相对较高的能力显著降低噻嗪酮,然后被选中作进一步调查。

形态和生化试验表明,应变RX-3有氧,non-motile,革兰氏阳性细菌。殖民地的RX-3磅琼脂是光滑、湿润,黄色,圆形,与普通的边缘。最相似的序列RX-3 16 s rRNA基因被发现红球菌属baikonurensisGTC 1041 t(加入。AB071951)揭示了BLASTn搜索与NCBI基因库相似度为99.77%。系统发育分析也验证了通过聚类序列,引导支持的1000倍。基于信息,包括表型和系统发育特征、隔离RX-3初步认定为是一个假定的红球菌属sp。(图1)。

这个属的成员腐生的和通常存在于土壤和水,许多隔离从事许多有毒有机污染物的生物降解等17个α-methyltestosterone [16],喹啉[17],4-nitroaniline [18],4-nitrophenol [19),雌激素(20.和甲基叔丁基醚21]。红球菌属sp。RX-3迅速退化噻嗪酮,表明压力有很大的潜在应用程序删除噻嗪酮残留在环境和农产品。

噻嗪酮的生物降解RX-3在液体培养

这项研究显示,RX-3可以有效地降低噻嗪酮通过它作为唯一碳源。这是明显不同于其他三个隔离。图2显示,98.01%噻嗪酮的降解在mm - 1由应变RX-3在80 h。生物量也随着时间的增加孵化表明细胞生长和繁殖。效率噻嗪酮降解菌株RX-3与pH值和温度条件下的最优30°C和7.0,分别(日期没有显示)。这表明,噻嗪酮是一种有效的应变RX-3碳源。目前的结果类似于李et al。6)报道称,大约92%的噻嗪酮是由应变退化YL-1后48 h。

金属离子对噻嗪酮生物降解的影响

金属离子的抑制的生物降解行为和经济增长的影响微生物经常被发现在高浓度工业废水(22]。因此,它是一个很好的条件和源隔离候选人的细菌可以执行噻嗪酮的生物法和金属co-contaminated环境(15]。所示图3与铜的增加,降解率增加^{2 +}和英航^{2 +}浓度。有趣的是,噻嗪酮降解低浓度的李⁺和Ca^{2 +},但活动降低了一旦浓度超过1.0毫米。这些建议RX-3可能是生物修复的能力对噻嗪酮和金属co-contaminated环境。

在噻嗪酮代谢物生物降解的识别

的代谢物过程中产生噻嗪酮降解菌株RX-3 gc - ms技术被确认。化合物,已报道的其他物种被发现和确认为噻嗪酮分子量(305)的基础上,保留时间(9.874)和特征碎片离子峰(290、249、216、190、131、115和105;图4,图5一个)。此外,我们的研究结果表明,9个代谢物化合物降解过程中(图4和表1),包括复合B(保留时间的9.526;图5 b)、复合C(保留时间的8.136;图5 c),化合物D(保留时间的7.189;图5 d)、复合E(保留时间的7.059;图5 e)、复合F(保留时间的5.920;图5 f),化合物G:(保留时间的5.295;图5克),化合物H(保留时间的4.660;图5 h),化合物(保留时间为4.313;图5我)和复合J(保留时间的3.409;图5 j)。

表1:总结不同代谢物的噻嗪酮及其相应的化学名称和特征离子被gc - MS和MS / MS

噻嗪酮代谢通路的应变RX-3代谢物鉴定研究,提出路径所示图6。噻嗪酮降解过程中,总共9代谢产生的化合物。除了化合物D, E, G,以前被李et al。4和陈等。5),其它化合物是新发现的退化过程。我们提出三种可能的代谢途径对噻嗪酮降解(Figure6)。杂环的通路,噻嗪酮水解形成开辟了一种新的化合物鉴定化合物B, B通路,噻嗪酮的参与降解的第一步是N-tert-butyl和N-isopropyl形成化合物的连续亏损确认为C, E和f C化合物之前已经报道(5C、F),而化合物被确定是新的。第二步在这个转型路径B被认为由于水解,紧随其后的是一个氧化还原反应形成N - (mercaptomethyl) -N-phenylformamide小说结构。路径C涉及benzenic去除第一声从噻嗪酮生成化合物D,类似于先前的报道(4),后来变成formamidomethyl N-tert-butylmethanimidothioate也被李et al。4]。这个过程是紧随其后的是其转换到一个新的结构formamidomethyl N-isopropylmethanimidothioate。

因此,关于其观察到的相对较高的降解对噻嗪酮的代谢活动和能力,应变RX-3是一个很好的候选人进一步研究机制及其潜在的应用程序将噻嗪酮从受污染的土壤。

结论

一本小说红球菌属sp。应变RX-3使用噻嗪酮作为唯一碳源从土壤噻嗪酮-治疗孤立和确认了。应变RX-3可能降低98.01%噻嗪酮的mm - 1在80 h。9代谢物噻嗪酮降解,和六个新的代谢物被首次报道。噻嗪酮的详细研究降解由单一菌株表明红球菌属sp。应变RX-3可能是一种很有前途的候选人与噻嗪酮的修复环境污染。

确认

这项工作是支持由中国国家自然科学基金(31100083),基础为年轻人才在安徽大学,安徽省教育委员会自然科学基金(KJ2015A049),安徽省级自然科学基金(1508085 mc49),淮北师范大学学者支柱支持计划,建设项目从安徽大学科研创新团队——生态修复和利用采煤沉陷区。

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