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1微生物技术国家重点实验室,山东大学生命科学学院27 Shandanan路,济南,山东250100,p . r .中国
2国家Glycoengineering研究中心、山东大学27 Shandanan路,济南,山东250100,p . r .中国
收到日期:21/09/2015;接受日期:23/05/2016;发表日期:06/06/2016
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几个烷烃分别添加到四个发酵媒体调查的影响烷烃sophorolipids (SLs)生产和表达水平细胞色素P450(P450)基因在Starmerella bombicola CGMCC 1576。生产总SLs从n-tetradecane、正十六烷和n-octadecane分别14.07 g l - 1, 31.73 g l - 1和27.2 g l - 1。更多的内酯酸的SLs n-tetradecane和正十六烷的生产更多的酸性SLs是从n-octadecane产生的。此外,六个P450基因被发现从美国bombicola基因组测序。CYP52-M1基因诱导表达的所有使用正烷烃除了n-decane并不表示没有葡萄糖。CYP52-E1基因诱导表达的一些特定的烷烃在不同C / N比率。在媒体上没有葡萄糖,CYP52-E2基因诱导表达的所有使用正烷烃除了n-octane和CYP52-N1基因被n-octadecane诱导表达。CYP52-N2 CYP-X基因并没有扮演同样重要的角色对烷烃利用率和其他P450基因。不同程度的烷烃利用率可以引导有目的的生产总量、内酯或酸性SLs,和六个P450基因表达在不同层次上由烷烃和扮演不同的角色在烷烃的利用率。
Sophorolipids烷烃、细胞色素P450基因表达,Starmerella bombicola
Sophorolipids (SLs)是一种生物表面活性剂主要由几个种类(酵母(1,2]。不同的SLs有不同的表面和生物活动。一般来说,内酯酸的SLs展览更强生物活性(3]在泡沫形成的酸性SLs有更好的能力和溶解性4]。由于其良好的生物降解性,生物相容性,降低毒性、良好的抗肿瘤和所有生物表面活性剂中产量最高,SLs有很大应用前景在许多行业,如石油、环境保护、化妆品、洗涤剂和医药行业(5]。
细胞色素p450 (p450),属于一个大家庭单氧酶(6),可以氧化脂肪酸和烷烃羟基脂肪酸和羧酸(7,8),被认为是第限速酶在SL合成途径(9]。两个假丝酵母P450基因tropicalis (CYP52A13和CYP52A17)已报告负责利用脂肪酸和烷烃(10]。两个假丝酵母apicola P450基因克隆和命名为CYP52E1 CYP52E2 [11]。在那之后,三个不同的P450酶基因从假丝酵母bombicola被克隆和命名为CYP52M1, CYP52E3和CYP52N112]。sophorolipid-producing酵母,Wickerhamiella domercqiae var. sophorolipid(现在称为Starmerella bombicola)孤立我们的实验室被证明能够生长在一些烷烃和利用烷烃生产sophorolipid,它展示了可能的烷烃利用率和sophorolipid生产之间的关系。因此,它是必要的去发现更多P450基因SL-producing菌株的基因组。同样重要的是调查的影响不同烷烃P450基因的表达水平和sophorolipids的合成。这项工作的目的是探讨烷烃SL生产的影响,P450基因表达和P450基因对烷烃利用率的作用Starmerella bombicola。
的生产和成分分析sophorolipids (SLs)
Starmerella bombicolaCGMCC 1576 (美国bombicola),一个高SL-producing酵母菌株,分离从污水13]。SLs的生产采用蒽酮法测定(14]。分析了SLs HPLC-MS使用Venusil MP-C18, 4.6μm列(250毫米×4.6毫米,Agela技术Inc .)监测与紫外探测器在207海里。总流率是1毫升分钟1和注射量是15μL。的流动相乙腈/水乙腈浓度是编程从40%到90% (v / v)在45分钟。API4000 MS分析质谱计(应用生物系统公司)及其离子源是ESI。
实时荧光定量PCR的测量
信使rna(补充图1)提取使用试剂盒和目标基因的mRNA水平测定用实时荧光定量PCR (RT-qPCR)。补充表1表2和补充是引物用于RT-qPCR和补充表3是RT-qPCR的标准曲线。
Sophorolipid (SL)生产包含不同烷烃在媒体上
表1表明,SLs总产量减少正十六烷的顺序(C16) n-octadecane (C18) n-tetradecane (C14) n-dodecane (C12) n-decane (C10)和n-octane (C8)。有趣的是,产生的总SLs从C18第二生产C16而内酯酸的SLs总比从C18 SLs是最小的。C8、C10和C12没有贡献SLs的生产,而生产总SLs产生C14, C16,使用C18分别14.07 g l1,31.73 g l1和27.2 g l1,远高于没有烷烃(3.72 g l1)。
| G+ | (G+)+ C8 | (G+)+ 10大 | (G+)+ C12 | (G+)+碳 | (G+)+ C16 | (G+)+ C18 | (G+)+办公自动化 | |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 总SLs g L1 |
3.72 ±0.53 |
2.19 ±0.62 |
2.83 ±0.79 |
4.44 ±0.70 |
14.07 ±1.98 |
31.73 ±3.01 |
27.2 ±3.09 |
57.84 ±2.55 |
| 内酯酸的SLs g L1 | 2.92 ±0.54 |
1.73 ±0.67 |
1.95 ±0.93 |
3.45 ±0.92 |
6.43 ±0.99 |
18.77 ±1.84 |
2.25 ±0.63 |
35.74 ±3.29 |
| 这一比率* | 78.5% | 79.4% | 68.9% | 77.7% | 45.7% | 59.2% | 8.3% | 61.8% |
*内酯酸的SLs比总SLs、数据三个测量的均值和标准差表示。
表1。生产sophorolipids (SLs)后168小时的发酵培养媒体(G +)包含不同烷烃或油酸(OA)。发酵媒体(G +)含有80克葡萄糖l1,3 g酵母提取物l1,1 g KH2阿宝4l1,1 g Na2HPO4•12 H2l O1,0.5 g MgSO4•7 h2l O1,30毫升烷烃或OA l1。烷烃包括n-octane (C8) n-decane (C10) n-dodecane (C12) n-tetradecane (C14)、正十六烷(C16)和n-octadecane (C18)。
SLs的成分分析与不同的烷烃在媒体上
图1和补充表4表明,相同峰值的SLs C8, C10, C12和C16出现在35 - 37.2分钟吸收和乳糖酸被推断为Di-acetylated SL C18:0脂肪酸(C18:0 2 ace Lac SL)根据其分子量(MW) 690 (15]。山峰C16和C18略有不同。SLs的高峰发生在31.6 - -32.4分钟,32.4 - -33.8分钟C16被推断为相同的mono-acetylated分子内酯酸的SL (C18:1, 1王牌,Lac SL)根据646 MW (15从C8),明显高于,C10和碳。几乎没有从C18 SLs分子发生在18 - 40分钟。从C18 SL峰值8.8 - -9.3分钟高达,从油酸和SLs没有检测到来自其他烷烃混合物,分子和他们确认为同一SL (C18:1 2 ace酸SL)根据706 MW (15]。
图1:HPLC-MS sophorolipids成分分析(SLs)在发酵生产媒体不同烷烃或油酸(OA)。发酵媒体(G +)含有80克葡萄糖l - 1, 3 G酵母提取物l1,1 g KH2阿宝4l1,1 g Na4HPO4•12 H2l O1,0.5 g MgSO4•7 h2l O1,30毫升烷烃或OA l1。烷烃包括n-octane (C8) n-decane (C10) n-dodecane (C12) n-tetradecane (C14)、正十六烷(C16)和n-octadecane (C18)。王牌:乙酰化。Lac:内酯酸的。酸:酸性。
提名的六个细胞色素P450 (P450)基因
六P450基因被发现Starmerella bombicola基因组测序。据尼尔森基因组注释和分类系统(16),6个P450基因的美国bombicolaCYP52-N2,分别名为CYP52-M1 CYP52-N1 CYP52-E1, CYP52-E2 CYP-X (CYP52-X基因注解为细胞色素P450但不指定P450家庭然后被任命为CYP52-X)。研究六个基因的基因库加入数字如下:CYP52-M1, KM492812;CYP52-N1 KM492813;CYP52-N2 KM492814;CYP52-E1 KM492816;CYP52-E2 KM492817;CYP-X KM492819。
六P450基因的表达水平在媒体上有或没有葡萄糖
所示图2一个,CYP52-M1 CYP52-E1基因高表达。CYP52-M1基因可能是高度表达的所有使用正烷烃n-decane除外。n-decane作为疏水碳源时,CYP52-M1基因的转录水平下降近20 - 40倍。CYP52-E1基因高表达的所有使用正烷烃n-octane除外。n-octane作为疏水碳源时,CYP52-E1基因的转录水平下降约25倍。也高度表达,此外,CYP52-M1基因的转录水平至少15倍多与他人发酵的媒体没有烷烃但葡萄糖或两个葡萄糖和油酸。其他P450基因显示表达相对较低的葡萄糖。
图2:基因表达水平的六个细胞色素P450 (P450)经过72小时的媒体(G)发酵培养+)通过添加不同烷烃或油酸(OA)和b)发酵媒体没有葡萄糖(G- - - - - -),但不同烷烃。发酵媒体没有葡萄糖(G- - - - - -)包含3 g酵母提取物l1,1 g KH2阿宝4l1,1 g Na2HPO4H·122l O1,0.5 g MgSO4h·72l O1,30毫升烷烃或OA l1。数据代表三个独立实验的均值和误差显示平均数标准误差。
所示图2 b,CYP52-E1 CYP52-M1 CYP52-E2和CYP52-N1基因高表达。CYP52-M1基因只有高度表达与葡萄糖在媒体上,并与正烷烃很少在媒体上表达。CYP52-E2基因表现出相对较高的表达水平在媒体上没有葡萄糖但与所有使用正烷烃n-octane除外。尤其是油酸作为碳源时,CYP52-E2的拷贝数增加了近10倍。CYP52-E1和CYP52-N1基因只存在n-octadecane中高度表达。CYP52-N2和CYP-X基因低表达在缺乏葡萄糖。
饥饿处理后六P450基因的表达水平
所示图3一和图3 b,每个P450基因的表达水平在葡萄糖饥饿条件下没有表现出显著差异,碳和氮源饥饿条件下和所有基因的表达水平,除了CYP52-E1基因饥饿治疗后都很低。非常有趣,CYP52-E1基因只有n-decane的存在中高度表达,这种基因的拷贝数增加了至少10倍相比,在其他的发酵条件。
图3:六P450基因的表达水平后48小时的发酵培养媒体随后4小时)葡萄糖饥饿(G)或b)碳和氮源饥饿(CN)——培养和4小时的感应通过添加不同烷烃或油酸(OA)。Gmedia包含3 g酵母提取物l1,1 g KH2阿宝4l1,1 g Na2HPO4•12 H2l O1,0.5 g MgSO4•7 h2l O1。包含1 g KH (CN)——媒体2阿宝4l1,1 g Na2HPO4•12 H2l O1,0.5 g MgSO4•7 h2l O1。烷烃或添加了OA 30毫升的媒体。数据代表三个独立实验的均值和误差显示平均数标准误差。
烷烃被利用在不同程度上Starmerella bombicola。绝大多数sophorolipids (SLs)产生的美国bombicola16或18碳(2,15,17),这可以解释为什么正十六烷和n-octadecane利用最好的美国bombicola。SLs的高效液相色谱分析证实了峰值发生在18分钟酸性SLs和峰值发生在18分钟内酯酸的SLs [2,15,17]。结合我们HPLC-MS数据,产生更多的内酯酸的SLs从n-tetradecane和正十六烷和酸性更强SLs是从n-octadecane产生的。
六个细胞色素P450 (P450)基因美国bombicola表示在不同级别和扮演不同的角色在烷烃的利用率。CYP52-M1基因诱导表达的所有使用正烷烃除了n-decane但并不表示没有葡萄糖。Roelants证明葡萄糖的监管效果在念珠菌bombicola cyp52M1基因的表达和cyp52M1基因显著下调条件低葡萄糖浓度(18]。和假丝酵母CYP52M1酶bombicola很有可能参加sophorolipid形成(12]。CYP52-E1基因诱导表达的所有使用正烷烃除了n-octane (图2一个)诱导表达的n-octadecane没有葡萄糖(图2 b),并明确表达的诱导n-decane饥饿治疗后(图3)。因此,CYP52-E1基因诱导表达的一些特定的烷烃在不同C / N比率。在媒体上没有葡萄糖,CYP52-E2基因诱导表达的所有使用正烷烃除了n-octane和CYP52-N1基因被n-octadecane诱导表达。这两个基因的转录水平是密切相关的正烷烃发酵培养基。所以我们推测CYP52-E2 CYP52-N1扮演了不同的角色在烷烃的利用率Starmerella bombicola1576年CGMCC酵母。CYP52E3和念珠菌bombicola CYP52N1基因被认为参与代谢的烷烃(12]。CYP52-N2 CYP-X基因并没有扮演同样重要的角色对烷烃利用率CYP52-M1, CYP52-E1, CYP52-E2 CYP52-N1基因。
生产总sophorolipids (SLs)从n-tetradecane、正十六烷和n-octadecane分别14.07 g l1,31.73 g l1和27.2 g l1。更多的内酯酸的SLs n-tetradecane和正十六烷的生产更多的酸性SLs是从n-octadecane产生的。这些结果可以指导SLs的有目的的生产。6细胞色素P450 (P450)基因包括CYP52-M1 CYP52-N1, CYP52-N2, CYP52-E1, CYP52-E2 CYP-X被发现Starmerella bombicola基因组测序。这些基因表达在不同层次上由烷烃和扮演不同的角色在烷烃的利用率。但这个途径的执行细节尚不清楚。根据这些结果,我们可以做一些SLs-producer获取基因改造突变体与使用正烷烃的优秀能力。
这项研究是由中国国家自然科学基金(No.30970052和31270089),山东省自然科学基金(ZR2009BZ002)和国家关键技术研发项目(2011 bac02b04)。
