花互花DNA溶液浸泡水稻耐旱系抗氧化特性及相关基因表达谱分析

摘要

干旱是限制水稻稳定生产的主要非生物胁迫之一。以水稻品种IAPAR9(旱稻品种)、H8和H10(耐旱变种系)和6527(普通水稻品种)为研究对象，通过超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化物酶(POD)活性、丙二醛(MDA)含量及其相关基因表达谱对抗旱品种的抗氧化特性进行了研究。结果表明，干旱胁迫显著提高了水稻SOD活性、POD活性和MDA含量，降低了产量及其相关性状(结实率、千粒重和穗粒数)。耐旱水稻(H8、H10和IAPAR9) SOD和POD活性显著高于干旱敏感水稻(6527)。耐旱水稻(H8、H10和IAPAR9)丙二醛含量低于敏感水稻6527。H8的产量显著高于其他品种，耐旱品种的结实率和千粒重显著高于敏感品种6527。干旱胁迫后，有11个与抗氧化进程相关的基因在H8 ~ 6527之间表达谱发生显著变化。这些结果表明，耐旱品种可能通过诱导抗氧化相关基因的表达，进一步提高SOD活性和POD活性，从而抑制过氧化的危害。因此，增强抗旱性可以在干旱胁迫下维持正常的生长发育，并获得最大的光合产物储存。

关键字

外源DNA，胚胎浸泡，抗氧化特性，干旱胁迫，表达谱，水稻。

简介

水稻是世界上重要的粮食作物，成为约二分之一以上人口的主要食物。世界上95%的水稻种植在欠发达国家，主要是在亚洲。中国水稻总种植面积仅次于印度[1，2］．然而，水稻是一种耗水大的作物，而中国存在严重的水资源短缺问题。解决这一矛盾，重要的是提高水稻种质资源的抗旱性。在利用种内优良基因进行水稻育种的基础上，从野生源或远源种引进优良基因变得越来越重要。其中,、是一种非常耐旱的杂草。采用浸种法引种外源DNA，简单易行，不受植物种类限制，为育种人员提供了快速、广泛的变异途径。然后是变型线H₈和H₁₀连续旱地定向选育，直至F₂₃一代又一代。最后用各种抗旱性指标进行评价[3.］．

干旱胁迫是水稻生产和产量稳定的严重限制因素。提高植物抗氧化代谢水平是提高植物抗旱性的一个途径。研究发现，干旱胁迫降低干物质产量和最终产量的主要原因是活性氧(ROS)的产生与抗氧化系统之间的平衡丧失，导致ROS的积累和诱导细胞成分的氧化损伤[4，5］．因此植物也形成了清除氧化剂和ROS信号系统的基础，并产生了多种抗氧化酶，如超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)、过氧化氢酶(CAT) [6，7］．迄今为止，在水稻中发现的一些耐旱基因和干旱胁迫的生理机制也已被了解[8-13］．然而，对于抗旱品种和敏感品种之间与抗氧化特性相关的基因表达谱如何变化，我们知之甚少。研究了不同抗旱稻品种间SOD活性、POD活性、MDA含量及产量及其相关性状₈H₁₀IAPAR9)和敏感6527。此外，还研究了H₈干旱胁迫下6527。水稻耐旱性的研究将提供更多的信息。

材料与方法

实验地点

野外试验于2012年在重庆北碚西南大学榭马实验站(19°51′n, 106°37′e)进行。气象站位于西南大学以南10公里处，海拔350米，属于亚热带季风气候。

实验材料与设计

试验选用4个水稻品种。H₈和H₁₀属于抗旱水稻，由6527胚芽浸泡而成其中,、DNA溶液，6527为普通水稻品种，对干旱敏感，IAPAR9为旱稻品种，抗旱[3.］．

实验设计为分裂图。以对照和干旱胁迫处理为主。亚样地为4个水稻品种，3个重复。用于干旱胁迫处理的植物种植在一个3米高的棚子中，棚子的顶部装有坚硬的有机透明材料，棚子的底部和侧面用水泥制成。对照植物在同一水泥地种植，不设棚。小区为3行，行距26.4 cm，株行距12 cm，每行10株。2012年3月20日播种，4月21日移栽。在干旱胁迫处理中，2012年4月28日放水后，每小区定量灌溉8000 mL，间隔12 d。对照处理供水量充足，直至成熟。

抗氧化指标的测定

在抽穗期干旱胁迫后12 d，每个小区随机抽取10株。去除叶柄的旗叶立即放入冰盒中，-20°C保存，分析抗氧化特性。

根据Bewley法，对SOD粗提物进行了改进。取各0.5 g样品，用研杵在冰冷的砂浆中均质，砂浆中含缓冲液2 mL (50 mmol L^－1磷酸盐缓冲液，pH 7.8, 1% (v/v) PVP) [14］．用磷酸盐缓冲液将体积校正为10 mL，然后在4°C下以10000 rpm离心15 min。SOD活性测定使用南京建成科技有限公司(中国南京)的检测试剂盒。SOD活性以U mg表示^－1普罗特。每个样品重复测量三次。

POD活性测定参照Moerschbacher等的方法进行了修改。每个样品取1 g样品，用研杵在冰冷的砂浆中均质，其中含有10 mL的20 mmol L^－1KH₂阿宝₄［15］．匀浆在4°C下以4000 rpm离心15分钟。0.1 mL上清液与2.9 mL 50 mmol L混合^－1磷酸盐缓冲液(pH 5.5)， 1ml 2% (v/v) H₂O₂50 mmol L, 1 mL^－1愈创木酚，在37°C的水浴中孵育。5min后，用分光光度计(UV-5800PC，上海，中国)测定A470处的吸光度。一个单位的酶活性(U)定义为每分钟0.01的吸光度变化。POD活性表示为U g^－1弗兰克-威廉姆斯。每个样品重复测量三次。

MDA含量按Heath和Packer方法进行了修改。每个样品取1g，用杵在含有2ml 10% (v/v) TCA的冰冷砂浆中均质，然后在8ml 10% (v/v) TCA中均质[16］．匀浆在4°C下以4000 rpm离心10分钟。取2 mL上清液与2 mL 0.6% (v/v) TBA混合，在沸水浴中加热15 min。冷却液在4℃下以4000转/分离心10 min。用分光光度计(UV-5800PC，上海，中国)测定A450、A532和A600处的吸光度。每个样品重复测量三次。丙二醛含量以nmol g表示^－1弗兰克-威廉姆斯。

RNA的提取及基因表达谱的测定

基于H₈其抗旱性显著高于IAPAR9₁₀与IAPAR9几乎相似[3.］．所以只有H₈以其受体6527为材料，分析其表达谱。从每块地随机选取3株₈抽穗期干旱胁迫后12 d, 6527(干旱胁迫与对照)，共36株。将根、茎、叶、穗平衡混合于12个离心管中，贴上标签，立即在液氮中冷冻30min， -80℃保存，提取RNA。RNA提取使用TRIzol试剂盒(TIANGEN, Beijing, China)。基因表达谱由深圳市华大基因研究所(深圳，中国)检测。

产量及其相关性状的测定

在成熟期各小区中线抽取10株，测定株高、单株穗数、穗长、千粒重、每穗粒数、每穗小穗数、结实率。在各小区作物全部收获后，测量各小区产量，然后换算成亩产。

统计分析

使用Microsoft Excel 2003分析原始数据。采用DPS 12.5软件进行方差分析。分析2次以上基因的表达谱，0表示无表达。

结果与讨论

抗氧化特性

干旱胁迫后植物大部分生理指标发生变化，且不同品种表现出差异。由方差分析(表1)， SOD活性、POD活性和MDA含量均受干旱胁迫处理和品种差异的显著影响。不同处理和品种间互作对MDA含量有显著影响，对SOD和POD活性无显著影响。

表1:抗氧化特性方差分析(F值)。

与对照相比，干旱胁迫显著提高了SOD活性、POD活性和MDA含量157.13 U mg^－1prot, 814.02 U g^－1和6.54 nmol g^－1FW，分别(表2)．Liu等人也报道了类似的发现。[17]。此外，抗旱品种与敏感品种在抗氧化特性上存在显著差异(表2)．与6527(干旱敏感型)相比，H₈， IAPAR9和H₁₀显著增加了184.80、80.26和75。80u毫克^－1普罗特。POD活性分别提高1441.11、1278.05和322.24 U g^－1弗兰克-威廉姆斯。尤其对H的SOD和POD有显著影响₈均高于H₁₀和IAPAR9。此外，H₈， iapar9, h₁₀均显著降低10.69、7.11和6.01 nmol g^－1FW与6527相比(表2)．由此可见，抗旱水稻可以通过提高SOD和POD活性来抵抗干旱引起的氧化应激，这与Lu等的研究结果一致。[18］．最后，分析了H₈显著高于6527,MDA的下降幅度显著低于6527。在H时₁₀，仅MDA含量变化幅度与6527存在显著差异(表2而且3.)．这些结果表明H₈抗旱性最强，抗氧化能力最强。

表2:处理和品种对抗氧化特性的影响。

表3:干旱处理对不同品种抗氧化特性的影响范围。

研究表明，干旱胁迫可诱导植物产生大量活性氧，导致脂质过氧化，破坏细胞膜的稳定性，产生MDA [19］．SOD在清除ROS中起重要作用，可以将超氧阴离子还原为过氧化氢和氧，是生物防止ROS损伤的第一道防线[19］．POD参与多种生理代谢，在催化合成多种细胞壁结构成分、控制细胞生长发育、消除过氧化氢等方面起重要作用，是抗氧化酶保护系统应激下的关键酶[20.］．我们的研究结果不仅证实了这一结论，而且发现抗旱品种具有更高的活性氧清除效率和更强的过氧化氢清除能力，并且产生更少的MDA。由此可见，抗旱水稻可以通过提高SOD和POD的活性来抵抗干旱引起的氧化应激，这与消除游离氧离子的损伤，启动抗氧化系统是一致的[17，18］．当然，抗旱品种还有其他抗旱方法，如通过渗透调节物质，如脯氨酸、离子、可溶性糖等提高渗透压[21，22］．他们经常需要合作。

产量与农艺性状

由方差分析(表4)，干旱胁迫对产量、千粒重、每穗粒数和结实率均有显著影响，对株高、单株穗数、穗长和每穗小穗数无显著影响。各品种间产量和各项农艺性状均有显著影响。与对照相比，干旱胁迫使产量、株高、单株穗数、穗长、千粒重、每穗粒数、每穗小穗数和结实率分别降低58.97%、14.20%、33.47%、6.04%、10.66%、40.23%、10.39%和29.29% (表5)．cai等人也报道了类似的发现。[23］．H的产率₈均显著高于其他3个品种。研究了H的单株穗数和每穗粒数₈w显著高于IAPAR9和6527，与H无差异₁₀．耐旱品种千粒重和结实率(H₈H₁₀和IAPAR9)均高于敏感的6527 (表5)．结果表明，抗旱水稻品种在干旱胁迫下具有较高的产量，同时结实率和千粒重是其高产的原因，这与文献报道一致[3.，24］．此外，耐旱水稻品种的产量、千粒重、每穗粒数和结实率的下降幅度(H₈H₁₀和IAPAR9均显著低于干旱敏感水稻6527 (表6)，表明干旱胁迫易影响灌浆进程，且耐旱品种对灌浆进程的影响小于敏感品种。

表4:产量与农艺性状方差分析(F值)。

表5:处理和品种对产量和农艺性状的影响。

表6:干旱处理对不同品种产量及农艺性状的影响

基因表达谱

为了进一步揭示水稻抗旱性的分子机制，研究了6527和H₈的分析表7．11个抗氧化相关基因在6527和H之间存在差异₈在干旱胁迫下。其中，6527位点无表达的一个基因在H中表达上调₈干旱胁迫后。该基因(LOC_Os05g11130.1)位于具有氧化还原酶活性的第5染色体上，与前体的形成有关，其表达谱的变化与SOD和POD活性的升高一致。它应该是启动水稻抗氧化系统的关键基因。3个基因仅在H中表达₈在干旱胁迫和6527下控制和无表达。位于7号染色体上的LOC_Os07g02810.1具有氧化还原酶活性，与非生物刺激反应有关。位于3号染色体上的LOC_Os03g37290.1具有过氧化物酶活性。LOC_Os12g42850.3位于12号染色体上，参与过氧化氢的代谢过程。Ding等研究表明，诱导氧化还原酶基因可通过抗氧化系统提高植物的耐旱性[25］．有3个基因在H中无表达₈其中1个在干旱胁迫后在6527位点表达上调，另外2个在对照组和干旱胁迫下均在6527位点表达。其中loc_os07g51920.1位于3号染色体上，具有肽转运功能，与非生物刺激反应或活性氧代谢有关;LOC_Os07g44430.1位于7号染色体上，具有抗氧化活性，与过氧化物代谢有关;LOC_Os07g48050.1位于7号染色体上，具有抗氧化活性。4个基因均在H₈6527和6527表现不同，6527上调H, H下调₈干旱胁迫后。LOC_Os11g05380.1位于11号染色体上，具有氧化还原酶活性，与铁离子结合和非生物代谢过程有关。LOC_Os07g05940.1位于7号染色体上，与类胡萝卜素双加氧酶阳离子结合，与脱落酸代谢过程的应激反应有关。位于第5染色体上的LOC_Os05g50180.1具有离子结合和氧化还原酶活性。loc_os03g558001位于3号染色体上，具有氧化还原酶活性和铁离子结合(表7)．不难发现，SOD和POD表达上调(下调)的基因有的与SOD和POD表达上调(下调)一致，有的则与SOD和POD表达上调(下调)一致。这些结果表明，SOD和POD的生理活性在氧化和过氧化过程中受到多种基因的调控。一些基因的表达有利于抗旱性，而另一些基因的沉默可能有利于抗旱性。综上所述，这些基因可能是高抗旱性的原因₈．深入研究这些基因对理解抗氧化机制具有重要意义。

表7:H .的微分表达式剖面₈干旱胁迫下的6527。

确认

重庆市国家科学基金重点项目(CSTC2012jjB80005)资助。

结论

11个抗氧化相关基因在H₈源自胚胎浸泡与其中,、在研究中通过基因表达谱找到了DNA及其受体6527。结合抗旱品种和敏感品种抗氧化指标的生理分析，认为抗旱品种可能通过诱导抗氧化相关基因的表达或沉默来提高SOD和POD的活性，以减轻过氧化物造成的损害，从而使一些重要农艺性状相对稳定，防止干旱胁迫下产量下降。

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