龋病活跃和无龋学童唾液流量、缓冲能力及选择性MSKB培养基分离变形链球菌的分析

摘要

背景:龋齿是一种多因素疾病，其重要病因包括变形链球菌和乳酸菌数量、唾液流量、缓冲能力和既往患龋史。饮食类型、口腔卫生习惯、氟化物的使用和其他预防措施等因素也会对其产生影响。虽然已经对影响龋齿的所有变量进行了大量研究，但在龋齿风险评估中具有更好预测能力的模型尚未在印度人口中得到验证。因此，本研究的目的是评估变形链球菌的唾液计数结合唾液流率和缓冲效应的测量是否可用于龋学的诊断和预测。材料和方法:该研究在50名9至12岁的在校儿童中进行，并根据他们的DMFT分为两组，分别为龋活跃和无龋，每组25名受试者。采集唾液样本，在唾液米炎卡那霉素杆菌肽(MSKB)选择培养基上进行唾液流速、缓冲能力和变形链球菌计数分析。结果:龋活跃组和无龋组唾液流量、缓冲能力、唾液中对数变形链球菌CFU计数的定量和定性比较p值均为0.00001，差异有统计学意义(p<0.05)。结论:变形链球菌选择性生长培养基MSKB是变形链球菌生长的优良诊断培养基。唾液流量和缓冲能力等变量可以作为评估龋齿经验和预测龋齿风险的有价值的诊断工具。

关键字

龋齿，乳酸菌，唾液，唾液pH值，变形链球菌MSKB传媒

介绍

龋齿是牙齿钙化组织的一种不可逆的微生物疾病，其特征是牙齿的无机部分脱矿和有机物质破坏，经常导致空化。在口腔疾病，龋齿是最常见的慢性疾病人类的。它影响到所有种族、所有社会经济阶层和任何年龄组的男女。儿童到了上学年龄，由于饮食习惯的改变，包括精制碳水化合物和甜味剂，他们患龋病的几率越来越高[1]。龋齿多因素疾病和重要病因包括吗变形链球菌（变异链球菌)、乳酸菌数量、唾液流速、缓冲能力及过往患龋情况[2]。此外，饮食类型、口腔卫生习惯、使用氟化物和其他预防措施等因素也会对该指数产生影响[3.，4]。与龋齿发展相关的因素在疾病过程中极为相关。微生物生龋齿的容量并不能决定是否存在龋齿。为了促进龋病的发展，必须在宿主体内有合适的底物和生理条件，使这些微生物能够着床和存活。

在印度，儿童占迅速增长的人口的40%。儿童患龋齿的比率由33.7%至90%不等，并正以惊人的速度上升[5]是最常见的人类疾病之一。变异链球菌和乳酸杆菌已被广泛研究，并显示在蛀牙病因中扮演重要角色[6]。变异链球菌跟入会有很大关系，而乳酸菌与龋病的进展有关[7]。作为产酸和酸性微生物，其定殖变异链球菌被认为是导致蛀牙的主要原因[8]。变异链球菌唾液中的水平已被证明是预测龋齿活动的一种方法，因此已经开发了几种基于突变体水平估计龋齿风险的测试。在所有这些试验中，常见的是使用添加了蔗糖和杆菌肽的生长培养基进行选择性回收变异链球菌来自于唾液总量。由唾液琼脂基质、山梨醇、硫酸卡那霉素和杆菌肽组成的新型培养基MSKB已被开发出来，这是一种更具选择性的生长培养基，似乎比传统的MSB培养基更适合用于龋齿诊断试验。新的MSKB培养基对突变体更具选择性，因为它消除了视觉上将非突变体解释为突变体所引起的假阳性结果[9]。

唾液的变量，如流速，缓冲能力和抗菌活性是否被公认具有降低发病率的能力牙科龋齿。虽然已经对影响龋齿的所有变量进行了大量研究，但在龋齿风险评估中具有更好预测能力的模型尚未在印度人群中得到验证[10]。因此，有必要结合诊断测试来针对高危龋齿人群。因此，本研究的目的是评估唾液计数是否变异链球菌结合唾液流量的测量和缓冲效应，可用于口腔病学的诊断和预测。

宗旨及目标

评价和比较唾液腺之间的关系变异链球菌在9-12岁的龋齿活跃和无龋齿学校儿童的计数，唾液流量和缓冲能力，并确定MSKB作为一种选择性介质隔离的有效性变异链球菌．

材料与方法

研究开始前获得机构伦理委员会的许可。这项研究在50名9至12岁的学生中进行。选择9 - 12岁年龄组进行研究的原因如下:

9 - 12岁是世界卫生组织推荐的指数年龄组之一。

现在是对疾病趋势进行国际比较和监测的全球监测时代。

这是在学校进行龋病风险评估和筛查的年龄之一[11]。

由于这是一项比较研究，其中唾液变量与受试者的龋齿经历(龋齿活跃和无龋齿)进行比较，因此龋齿经历组中每组包含相同数量的受试者(n=25)。使用DMFT、def指数对每个儿童的龋病状况进行评分，并根据DMFT、def评分分为两组，活跃龋病为DMFT、def>为0，无龋病为DMFT、def=0。然后这些病例被分为两组;第1组:有龋(n=25)，第2组:无龋(n=25)。在采集唾液样本前，记录所有受试者的知情书面同意。患有严重疾病、张嘴困难、上个月曾服用抗生素和佩戴牙齿矫正器的儿童被排除在研究之外。该研究使用了一种特定的预测试形式，包括两部分。

第一部分包括学龄儿童的年龄、性别和临床口腔检查信息，第二部分包括DMFT、def指数和唾液分析。

唾液样本在上午10点至11点之间采集，以控制昼夜节律的变化。参与实验的儿童被要求在采集唾液样本前至少两小时内不要吃或喝任何东西。儿童被要求在收集唾液前10分钟用清水彻底漱口，以避免食物残渣污染口腔。孩子们被要求吞下先前存在的唾液，以清除口腔中任何残留的未刺激的唾液。为了收集刺激的唾液，儿童被要求咀嚼无菌可咀嚼的石蜡颗粒(0.5x0.5 cm)，并指示唾液在口腔底部收集至少1分钟而不吞咽。然后在无菌注射器的帮助下提取唾液。这一过程持续5分钟，收集刺激的唾液。所有儿童的唾液样本在样本采集和处理期间都用一个编码进行识别。在测量被刺激唾液的流速后，样品在含有巯基乙醇酸肉汤传输介质(Hi介质)的聚苯乙烯管中被携带到实验室，以进一步分析缓冲能力和变异链球菌计数。

受刺激唾液的流速由以下公式确定[12]：

唾液流量以ml/min表示，评分如下:

评分0:>0.7 ml/分钟;得分1:0.3 - 0.7 ml/分钟，得分2:<0.3 ml/分钟。

缓冲容量的估计采用Ericsson [12，13为更小的体积而修改。0.5 ml唾液加入1.5 ml 5 mol /1 HCL中。大力摇晃混合物，然后离心1分钟，静置10分钟，用Hi指示pH纸测量上清液的最终pH值;其主要pH值范围为3.5至6.0和6.5至9.0，并据此进行分类。唾液pH值评分标准如下:

评分0:pH值>6.0，评分1:pH值4.5 - 5.5，评分2:pH值<4.0

为了进行微生物分析，使用搅拌器手动搅拌唾液样品使其均质。取100 μl唾液，用1ml无菌蛋白胨水稀释，得到稀释度为1:10的唾液。将100 μl稀释后的唾液加入1ml无菌蛋白胨水中，稀释比例为1:100。重复此过程，以获得1:1000的稀释。唾液稀释后用于微生物分析。的变异链球菌在唾液米炎卡那霉素杆菌肽(MSKB)琼脂上进行培养，该琼脂是该菌的选择性培养基。

每升MSKB是根据制造商的说明，首先在800毫升去离子水中分别蒸压90克MS碱，在200毫升去离子水中分别蒸压200克山梨醇糖。结合冷却至500℃后，加入1%的土酸钾1 ml、杆菌肽40 U/ml 2.5 ml、硫酸卡那霉素500 μg/ml 2 ml，得到杆菌肽0.1 U/ml和硫酸卡那霉素1 μg/ml。将配制好的培养基倒入无菌一次性培养板中，冷藏至接种[9]。使用接种环(内径2mm)，在严格无菌条件下，将5微升1:1000稀释样品在MSKB琼脂上划线。MSKB琼脂板在370°C下，用蜡烛瓶厌氧培养72小时。经过72小时的潜伏期，菌落形成变异链球菌在培养板上表现为小、粗、凸起和粘附。这样确定的菌落计数使用放大镜和计数变异链球菌用菌落形成单位数/ ml唾液表示。当取5 μl唾液样本进行培养时，从该培养中获得的菌落数量乘以1/5 x 103，并对稀释因子进行校正，以计算出1ml唾液的菌落数量[14]。

利用放大镜计数菌落形成单位数，评分如下[150分:可以忽略不计，1分<104,2分:104 - 105,3分:>105。

采用革兰氏染色法对革兰氏阳性链球菌进行形态学鉴定。的识别变异链球菌Hi链球菌鉴定试剂盒(Himedia REF KB005A)生化检测证实。这是一个标准化的比色鉴定系统，利用12个常规生化测试。试验基于pH值变化和基质利用的原理。孤立的链球菌用灭菌的接种环取变形菌菌落，接种于5 ml脑心输液汤中，370℃孵育4小时，至接种物浊度在620 nm处达到0.1 OD。用校准注射器携带肉汤，接种在HiStrep识别条上。在孵育时，生物体发生代谢变化，这些变化表现为介质中的颜色变化，这种变化要么是自发的，要么是在添加试剂后可见的。

为了验证我们的结果，我们获得了标准菌株变形链球菌MTCC 890(参考编号43392,MTCC，昌迪加尔)。用消毒接种环取菌落，接种于5 ml脑心灌注汤中，370℃孵育4小时。用校准注射器携带培养液，接种在HiStrep识别条(Himedia KB005A)上。

统计分析:收集的数据采用学生t’和卡方检验进行评估。P值<0.05认为有统计学意义(*P<0.05)。

结果

有7例(28%)男孩和18例(72%)女孩龋病活跃;无龋组男生14人(56%)，女生11人(44%)。DMFT和def的学生t检验值分别为9.23和7.69。两个研究组的数据均有统计学意义，p值为0.00001 (p<0.05)。(表1)．

表1。龋活跃组和无龋组DMFT和def评分的性别分布及比较

唾液流量与缓冲能力的定量分析变形链球菌CFU计数:

唾液流量、缓冲能力、log比较差异有统计学意义变形链球菌活动组和无龋组唾液中CFU计数p值为0.00001 (p<0.05)(表2)．

表2。定量分析唾液流量、缓冲能力及测井曲线变形链球菌龋病活跃组和无龋组的CFU计数。

* p < 0.05

唾液流量与缓冲能力的定性分析

无龋组血流率明显高于龋活跃组(p<0.05)。活跃龋组19例(76%)和无龋组25例(100%)的唾液流量为>0.7 ml/min。龋齿活动组有6例(24%)唾液流量为0.3 - 0.7 ml/min，而无龋齿活动组无唾液流量。两组受试者均无低唾液流量<0.3 ml/min。两组数据均有统计学意义，p值为0.00903 (p<0.05)。在龋活跃组和无龋组中，pH>6.0的缓冲能力分别为4人(16%)和24人(96%)。pH为4.5 ~ 5.5时，活跃龋组有11例(44%)，无龋组有1例(4%)。龋病活动组有10例(40%)受试者pH<4.0具有缓冲能力。无龋组无pH 4.0的缓冲能力。两组数据均有统计学意义，p值为0.00001 (p<0.05)。(表3)．

表3。定性分析唾液流量、缓冲能力及测井曲线变形链球菌龋病活跃组和无龋组的CFU计数

微生物分析

龋病活动组的受试者表现出明显的高水平变形链球菌计数与无龋组比较。龋齿活动组无0分，无龋组有2人(8%)为0分。在龋齿活动组和无龋组中，得分为1的分别为3名(11%)和12名(48%)。活跃龋齿组和无龋齿组分别有10名(40%)和9名(30%)受试者得分为2。在龋病活跃组和无龋组，分别有12名(48%)和2名(8%)受试者得分为3。两组数据均有统计学意义，p值为0.0022 (p<0.05)。(表3)变形链球菌革兰氏阳性球菌在革兰氏染色中呈深蓝色或紫色。单个球虫呈球形或椭圆形，直径0.5 ~ 1.0 μm，呈链状排列。(图1)的增长变异链球菌在MSKB培养基上被视为蓝色的，小的，粗糙的，凸起的和粘附的殖民地(图2及3)．

生物化学分析

一、用于生化分析的HiStrep TM鉴定条(Himedia KB005A)结果:

2沃格斯-普罗斯考尔氏测验:阳性反应(粉红色)

3汤青素水解试验:阳性反应(黑色)

IV. PYR:阳性反应(樱桃红)

五、ONPG:消极反应(无色)

精氨酸利用:阳性反应(紫色/深紫色)

7葡萄糖:阴性反应(粉红色/红色)

8乳糖:阴性反应(红色/粉红色)

9阿拉伯糖:阳性反应(黄色)

十、蔗糖:阳性反应(黄色)

西山梨醇:阳性反应(黄色)

十二。甘露醇:阳性反应(黄色)

十三。阳性反应(黄色)

验证

标准菌株的生化检验结果变形链球菌MTCC 890(参考编号43392,MTCC，昌迪加尔)与我们的研究样本的结果相似。

讨论

众所周知，良好的口腔健康是良好的整体健康的一个组成部分。尽管享有良好的口腔健康不仅仅包括拥有健康的牙齿，许多儿童由于活跃和不受控制的龋齿而导致口腔和整体健康状况不佳。龋齿是一种折磨世界上很大一部分人口的疾病。龋齿的病因病机是多因素的。许多宿主、病原体和环境因素在蛀牙的发展中发挥作用[15，16]。由于龋齿在世界所有地区的高患病率，它是一个重大的公共卫生问题。对龋齿风险的评估非常重要，因为这为在暴露人群中实施预防措施提供了机会[17]。人类龋齿风险预测的概念已经存在多年。龋齿风险评估可能涉及预测因素，如特定的因果相关风险因素，也可能涉及与龋齿相关但非因果相关风险因素的预测因素。龋齿风险预测因子可以在微生物群(牙菌斑)、饮食(碳水化合物)和宿主(牙齿)中找到。这三者对于龋齿的发展都是不可或缺的。鉴于唾液对龋齿过程的潜在强大影响，可加入唾液[18]。在所有因素中，唾液是影响蛀牙发展的重要因素，因为牙齿经常接触，并被唾液沐浴[雷竞技网页版16]。因此，唾液的研究已成为牙科和口腔生物学的一个重要领域。

本研究试图评估和比较唾液流量，缓冲能力和之间的关系隔离的变形链球菌以9-12岁龋齿活跃和无龋齿的学龄儿童为研究对象，采用唾液米炎卡那霉素杆菌肽(MSKB)培养基，并确定MSKB作为选择性分离龋齿菌的效果变形链球菌．

在没有外源性刺激的休息状态下，唾液缓慢流动，保持口腔湿润，润滑粘膜。当唾液流不受刺激时，腮腺、下颌下腺、舌下腺和小粘液腺对唾液总量的贡献分别约为25%、60%、7%至8%和7%至8%，但当唾液流受到刺激时，腮腺的贡献至少增加10% [19]。唾液在刺激时增加的保护特性包括唾液清除率、缓冲能力和与牙齿矿物有关的饱和度。当食用可发酵碳水化合物后刺激唾液，通过减少导致脱矿的斑块pH值下降和增加再矿化的潜力，这些益处将最大化[20.]。因此，未受刺激的唾液可用于分析唾液腺状态，而受刺激的唾液可用于研究功能储备[21]。因此在我们的研究中，使用石蜡刺激的整个唾液作为样本。

收集唾液的方法有排水法、吐痰法、抽吸法和拭子法。根据道斯的说法[19]，抽吸法重现性最强;因此，我们的研究采用了这种收集唾液的方法。在人群中，唾液流率的测量被用作筛查方法，以确定低唾液流人群，这通常但并不总是与龋齿敏感性和活性[22]。一般来说，流速越高，缓冲容量越大，清除速度越快，微生物攻击越小[23]。

Tenovuo [22]报道称，唾液流量是最重要的单一参数，同时考虑到可能与龋病活动有关，是一个人的重要阈值限制。低唾液流率与龋齿患病率的关系证实了唾液流率与龋齿的关系[24]。在我们的研究中，活跃龋组和无龋组石蜡刺激唾液流率有统计学差异。无龋组刺激唾液流量明显高于有龋组。我们的研究结果与Mass等人的研究结果相似。[25， Azevedo等。[26]， Gopinath等人。[27， al - zahawi等。[28]， Aminabadi等。[29， Fiyaz等人。[30.和Srinivasulu等人。[31]。相比之下，Preethi等人报道的唾液流率与龋齿经历之间没有显著差异。[13]， Parvinem等。[32和Bretz等人。[33]。

口腔经常暴露在pH值不同于正常唾液pH值(6.5-7.5)的成分中，这些成分可能会对牙齿或粘膜表面造成损害。然而，唾液中的缓冲剂会尽可能快地将pH值恢复到正常范围。在静息唾液中，主要的缓冲剂是无机磷酸盐，而在刺激唾液中，主要的缓冲剂是碳酸/碳酸氢盐体系。在非常低的pH值(4-4.5)下，唾液蛋白也显示出一些缓冲作用[22]。

估计唾液缓冲能力的最常用方法有四种，如Ericsson为较小体积修改的方法、Bratthall和Hager的方法、Ericsson和Bratthall在1989年提出的Dentobuff方法和电测法[22]。Ericson和Bratthall进行的一项研究表明，这四种方法都有很好的相关性。由于简单且技术敏感度较低，我们在研究中使用了Ericsson针对较小体积进行修改的方法来估计唾液缓冲能力。

在种群水平上，唾液流量与缓冲能力呈正相关，但在个体之间存在许多例外。低流速和低或中等缓冲容量明显表明唾液对微生物攻击的抵抗力差。在这些患者中，微生物的清除速度较慢，残留的唾液在口腔表面形成一层薄膜，范围在0.5-1.0毫升之间。由于缓冲容量低，溶解在这一小体积唾液中的可发酵碳水化合物不会迅速中和，但糖的味道通常与可选择的调味剂一起刺激唾液腺在几秒钟内做出反应，唾液流量增加。唾液的量会增加，直到开始吞咽，吞咽清除了口腔中的一些糖。据报道，龋齿患病率与吞咽后剩余唾液流量呈显著正相关，如果缓冲能力差，则酸性攻击将延长。口腔经常暴露在pH值与唾液正常pH值(6.5-7.5)不同的成分中。这些成分可能对牙齿(侵蚀)或粘膜表面造成损害。然而，唾液中的缓冲剂，应尽快将pH值恢复到正常范围[22]。

在我们的研究中，我们观察到在龋齿活动组和无龋齿组中，石蜡刺激唾液的缓冲能力有统计学意义上的差异。无龋受试者与龋活跃度高的受试者相比，表现出显著的高缓冲能力。我们的研究结果与Farsi等人的研究一致。[17]， Malekipour等。[34]， Gudkina等。[35]，沙玛等。[36]， Motamayel FA等。[37， Kuriakose S等。[38， Shetty等人。[39和Bhayat等人。[40]。在所有这些研究中，无龋组的龋齿患病率明显高于龋活跃组。然而，我们的结果与Preethi BP等人的研究结果相反。[13]。其原因可能是其他相关因素，如微生物群、饮食和食物的保留，可能主导了启动龋齿的缓冲能力，龋齿是一种已知的多因素疾病。

变形链球菌表现出假定的龋齿性状，如高产酸潜力和耐酸性。主要兴趣在变形链球菌作为一种龋齿预测因子源于这样一个事实，即人类冠状面和根表面的龋齿传导条件与唾液和/或牙菌斑中该生物水平的升高有关[41]。由于计数的正数值关联变形链球菌随着龋齿及其与碳水化合物摄入的联系，最近的主要焦点已经转移到变形链球菌唾液样本计数。因此,变形链球菌计数不仅可以作为龋齿预测指标，还可以作为碳水化合物摄入量的指标，碳水化合物是另一个龋齿风险因素。

在我们的研究中，变形链球菌用唾液炎卡那霉素杆菌肽琼脂在唾液样本上培养，该琼脂是培养变异链球菌．

我们观察到有统计学意义的差异变形链球菌龋病活跃组和无龋组受试者的计数。龋病活动组的受试者表现出明显的高水平变形链球菌计数与无龋组比较。在龋齿活动组，没有一个被试的唾液可以忽略变异链球菌而在无龋组，有2名(8%)受试者唾液为零变异链球菌计数。我们的结果与Hegde PP等人的研究一致。[5]， Hebbal M等。[6Gamboa F等。[8，冈田等人。[42]， Hegde等人[43]， Simon等。[44]， Miravet等。[45]，葛等。[46， Thaweboon等人。[47]， Leal等。[48]和Pannu等人[49]。然而，Farsi等人进行的研究[17]和Granath等人。[41]的调查结果显示，患龋情况与患龋人数无显著关系变异链球菌．在Granath等人的研究中[41]，作者将结果的原因归结为在DMFT/def类中，较低细菌类的受试者的分布可能偏倚。

本文研制了一种以唾液琼脂为基础、硫酸卡那霉素和杆菌肽组成的新型培养基MSKB，该培养基具有较高的回收率变形链球菌．初步研究表明，传统培养基(MSB、TSY20B和GSTB)在没有显微镜辅助形态学分化的情况下，没有足够的选择性来计数突变体。新的选择性培养基MSKB已经过优化，以减少非突变体的生长，从而消除在龋齿诊断测试中使用的假阳性结果[9，15]。Yen等人注意到了相互矛盾的发现。[50]，发现MSKB和MSB的选择性优于GSTB和TSY20B，但MSB的回收率次之，MSKB、GSTB和TSY20B，表明MSB是最适合用于龋病检测的培养基变形链球菌根据其在差异化、可靠性和回收率方面的特点。进一步比较大样本量与其他变量如饮食，唾液类型，口腔卫生习惯使用不同的培养基生长变形链球菌从龋病患者的唾液样本中，提出了进一步研究的活跃群体。

结论

突变体的选择性生长培养基，MSKB是一种很好的诊断突变体生长的培养基变形链球菌．唾液流量和缓冲能力等变量是评估龋齿经验和预测龋齿风险的有价值的诊断工具。

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