西罗莫司的分析方法综述。

摘要

西罗莫司是一种大环内酯内酯，由固体霉菌，吸湿链霉菌发酵获得。西罗莫司是一种强有力的免疫抑制剂用于防止器官移植排斥反应，尤其在肾移植中有用。西罗莫司于1999年被美国食品和药物用于肾移植，也被称为雷帕霉素®(RAPA)。各种各样的分析方法已报道测定生物液体中的SRL。生物液中西罗莫司的测定方法包括RP-HPLC-UV、LC-ESI-MS/MS、RP-HPLC-PDA等多种色谱方法，也包括IMx分析仪的RRA、MEIA等多种酶学方法。本文还讨论了这些方法在生物样品(人血和狗血)中测定西罗莫司的应用情况。

关键字

西罗莫司(SRL)，环孢素(CsA)

简介

西罗莫司(Sirolimus, SRL)是一种31元三烯大环内酯内酯，含有半iketal, b-二甲酰胺，由发酵产生链霉菌属hygroscopicus．它是一种具有较强体内外免疫抑制活性的新型抗排斥药物抗增殖活动；它在肾移植中特别有用。1它通过抑制T细胞和B细胞对白细胞介素-2 (IL-2)和其他T细胞生长因子受体如环孢素A (CsA)和他克莫司(TAC)的反应来阻止T细胞和B细胞的激活。SRL需要与亲免疫蛋白(膀胱蛋白与免疫抑制药物结合)形成复合物，即FK结合蛋白-12 (FKBP-12)。然而，SRL-FKBP-12复合物不影响钙调神经磷酸酶活性和抑制蛋白激酶，指定雷帕霉素的哺乳动物靶点(mTOR)，它是细胞周期进程中的关键酶。抑制mTOR可阻断G1→S相变的细胞周期进程[2，3.］．

SRL单独有效或与其他免疫抑制剂联合使用，如CsA。SRL的生物活性增强了CsA的免疫抑制作用[4］．SRL于1999年9月中旬被美国食品和药物管理局(FDA)批准用于肾移植，与CsA和类固醇联合使用，也被称为雷帕霉素^®(拉伯)。已上市的LEF配方被列入名单表没有。1［5］．

分析方法的开发和验证对于优化药物的分析至关重要制药行业并保证商业化产品的质量6］．各种各样的分析方法已报道测定生物液体中的SRL。它包括反相-高效液相色谱-紫外光谱(RP-HPLC-UV)，液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)，液相色谱-电子喷雾电离-串联质谱(LC-ESI-MS/MS)，反相-高效液相色谱-光电二极管阵列检测器(RP-HPLC-PDA)，无线电受体测定(RRA)和微粒酶免疫测定(MEIA)，采用串联质谱分析仪(MS/MS)和IMx分析仪。在HPLC方法中，采用不同内标、不同粒径、不同内径、不同流动相组成的反相柱进行定量。本文就生物基质中SRL的测定方法进行综述。

为西罗莫司开发的各种分析方法

生物样本

生物材料用的是人血或狗血。样品制备通常采用固相萃取(SPE)或液-液萃取(LLE)。生物液中SRL的测定方法包括RP-HPLC-UV、LC-MS/MS、LC-ESI-MS/MS、rp - hplc - pda等多种色谱方法，也包括MS/MS分析仪、IMx分析仪的RRA、MEIA等多种酶学方法。

色谱方法

泰勒等．1998年报道了一种HPLC- ESI- MS/MS检测血液中SRL的方法。样品经乙腈预处理:15 m米以32-o-去甲氧基西罗莫司为内标(IS)， C18固相萃取，硫酸锌(70:30,v/v)。在Novapak C上进行了色谱分离₁₈色谱柱(150 × 32.1 mm，粒径4 μm)，在50°C温度下使用甲醇组成的流动相:50 m米醋酸铵缓冲液(pH 5.1) (80:20% v/v)，流速为0.2 ml/min。选用SRL和IS的931.8→864.6 m/z和901.8→834.4 m/z的质量跃迁反应监测，在三联四联仪器上进行检测。方法验证参数列于表没有。2［7］．

基什内尔等．1999年开发并验证了一种半自动HPLC-ESI-MS同时定量血液中SRL和CsA的方法。半自动化样品制备包括甲醇和硫酸锌混合物的人工脱蛋白步骤和C18Nucleosil填充保护柱(30 × 4 mm, 10 μm)上的自动柱切换在线高效液相色谱提取^®以水(pH 7.0)为流动相，流速为0.35 ml/min。色谱，分析Hypersil^®采用ODS柱(250 × 2 mm, 5 μm)为固定相，温度为35℃，甲醇:水(90:10,v/v)为流动相，流速为0.2 ml/min。采用质量分析仪测定SRL中钠加合离子[M+Na]+进行检测。m / z936.6)及CsA (m / z1224.9)，停留时间0.5 s。方法结果参数列于表没有。3.．在-200℃时，SRL和CsA在血液中稳定至少4个月，平均98% [8］．

停止DW等．2000年描述了一种用去甲氧基雷帕霉素作为IS估计人全血样品中SRL水平的RP- HPLC-UV方法。色谱柱为超球C18键合硅胶柱(25 cm × 4.6 mm, 5 μm)，流动相为乙腈:去离子水(65:35,v/v)，加热温度为50℃，流速为1.5 ml/min，检测波长为278 nm。结果参数被征召进来表没有。4．样品在-20℃下保存3个冻融周期，在常温下保存≥2天[9］．

Maleki等．2000年建立了一种以去甲氧基西罗莫司为IS的反相高效液相色谱-紫外法，用于人全血中SRL的治疗性药物监测。在该方法中，用l-氯丁烷萃取制备样品，并在C₁₈色谱柱(4.6 mm x 15 cm, 3 pm)，流动相为甲醇:乙腈:水(68:2:30,v/v/v)，流速为1.0 ml/min，温度为60℃，紫外检测器在278 nm处检测。验证参数列于表没有。5［10］．

均等．2002年建立了以32-o-去甲氧基雷帕霉素为IS的反相高效液相色谱-紫外(RP-HPLC-UV)分析全血SRL的方法。在这里，样品用硫酸锌纯化，然后用丙酮提取，然后固相萃取．在超球C填充柱上进行色谱分离₈(7534.6 mm, 3 mm)，用蒸馏水:甲醇:乙腈(34:30:36,v/v/v)的混合物在50°C下加热，流速为1ml /min，并在278 nm处用紫外检测器检测。方法结果参数列于表没有。6［11］．

钟鸟马等．2004年建立了肾、心、肝移植血液中SRL TDM的RP-HPLC-PDA方法。在这里，SRL和去甲氧基雷帕霉素(IS)样品通过沉淀血基质与硫酸锌和丙酮和1-氯丁烷的单步液-液萃取相结合进行纯化。分离在50°C的C上进行₁₈色谱柱(150 × 2.1mm, 5μm)，流动相为蒸馏水:甲醇:乙腈(26:50:24,v/v/v)，流速为0.25 ml/min，采用278 nm紫外二极管阵列检测器检测。方法验证参数列于表没有。7［12］．

李等．2010年提出了以他克莫司(TAC)为IS测定犬血中SRL的LC-MS/MS方法。在这里，在狗接受3mg /kg剂量的SRL后，对血液样本中SRL的浓度进行了长达36小时的量化。色谱柱为Prodigy Phenyl-3 (2.0mm × 50mm, 5μm)，流动相为乙腈:甲醇:碳酸氢铵(10 m米) (68:17:15, v/v/v)，流速为0.25 ml/min，采用三重四极杆质谱仪进行检测，以优化正离子模式下分析物的多反应监测(MRM)条件。这里，SRL的前体→生成物离子跃迁(m / z931.7→864.5)和IS (m / z821.6→768.5)。方法结果参数列于表没有。8［13］．

马诺等．2011年建立了人全血中SRL的LC/ ESI-MS /MS定量方法。样品制备首先采用硫酸锌蛋白沉淀法进行预处理，然后采用十八烷基硅基硅胶进行萃取以去除水溶性和亲水化合物，然后采用混合固相萃取筒(Hybrid SPE Cartridge)处理去除磷脂。以Ascomycin为IS，在Capcell Pak MG II (150mm×2.0mm i.d, 5μm)上进行分离，柱温50℃，柱温10m米醋酸铵:甲醇(20:80,v/v)为流动相，流速为0.2 mL/min。采用选择性反应监测(SRM)方法，分别在m/z 931.6-864.5和m/z 809.5-756.5过渡段监测SRL和子囊霉素，停留时间为500 ms。方法验证参数列于表没有。9．样品在-200C下至少保存三次冻融循环，至少46天稳定[14，15］ ．

阿尼尔•库马尔等．2012年采用反相高效液相色谱- PDA检测方法，以酮康唑(KTZ)为IS定量SRLin血液样本。用二氯甲烷在氮气气氛下进行萃取，用waters Xterra MS C进行分离₁₈色谱柱(250 × 4.6 mm, 5μm)，流动相为甲醇:水:冰醋酸(90:10:10 .1%，v/v)，流速为1ml /min，采用PDA检测器在278nm处检测。方法验证参数列于表没有。10［16］．

酶的方法

固特异N。等．1996年描述了一种用于全血SRL估计的RRA。为此，SRL用[3H]-二氢FK506以每分钟160,000次(dpm)的速度从干燥的管中重悬，然后直接甲醇萃取，使用15-25 μg含有14或52 kDa蛋白质作为最终稀释剂。将样品置于Sephadex LH-20色谱柱上，用LH-20缓冲液(20 mmol/L Tris (pH 7.2)， 5 mmol/L β-巯基乙醇，0.5 g/L叠氮化钠)平衡床体积1.8 mL, 150 μL洗脱，1.25 mL LH-20缓冲液，分离游离[3H]-二氢FK506与结合物，用闪烁计数器测定结合物，计数效率为59%。非特异性结合使用浓度为1 mg/L的未标记SRL进行估计。验证参数列于表没有。11．在干扰研究中，SRL的RRA未观察到CsA、甲氨蝶呤、地塞米松和泼尼松龙的干扰[17］．

琼斯K等．2000年研究了全血制备样品测量的MEIA和用于SRL估计的HPLC-MS/MS方法。该方法采用蛋白沉淀萃取技术制备样品。特异性是通过将2种西罗莫司代谢物(羟基西罗莫司和4 - l-o-去甲基西罗莫司)添加到无西罗莫司的人全血中来确定的。方法验证参数列于表没有。12．在稳定性研究中，在共3次冻融循环中，SRL没有损失，样品在40C和环境温度(22°C避光)[18］．

威尔逊D等．2006年采用IMx分析仪测定全血中西罗莫司的微粒酶免疫法。在这种方法中，MEIA是利用小鼠单克隆抗体共价偶联到羧基化微粒的一步竞争性测定。在这里，用甲醇沉淀试剂对样品进行预处理，IMx探针/电极组件将预处理样品、微粒和偶联到一次性MEIA反应池的孵育孔中。在此之后，它与碱性磷酸盐反应并形成底物4-甲基伞形基磷酸盐，转化为由IMx光学组件测量的荧光产物。特异性方面，SRL主要由CYP3A4酶系统代谢为羟基化和/或去甲基化形式。方法结果参数列于表没有。13［19］．

结论

本文综述了基于不同检测器的高效液相色谱分离和一些酶促方法的特异性、灵敏度和准确性的血液中SRL的分析技术。分光光度法、荧光分光光度法和色谱法以外高效液相色谱法在药物制剂和生物液中均未报道SRL定量。但在今后稳定性指示方法的开发和验证以及降解方面，还可以考虑一些新的方面动力学研究以及杂质研究。

参考文献

1. Gummert JF, Morris RE, Ikonen T.抗炎和免疫抑制药物。见:Rang HP, Dale MM.药理学一般原理。第六版:丘吉尔·利文斯通出版社;2007.p。243。
2. Harvey RA, Champe PC。Immunosupressants。在:利平科特的药理学插图评论。雷竞技苹果下载第四版，新德里:Wolters Kluwer Pvt. Ltd.出版;2009.p . 492 - 493。
3. Krensky AM, Vincenti F, bennett WM。免疫抑制剂，耐受性原和免疫刺激剂。在:Brunton LL。古德曼和吉尔曼的《治疗学的药理学基础》。第11版:医学出版司;2006.p . 1413 - 1414。
4. Lake DF, Briggs AD, Agporigue ET.免疫药理学。In: Katzung BG。基础和临床药理学。新德里:Tata Mcgraw Hill Education出版社;2009.p . 972 - 973。
5. 印度药物评论(IDR)，药物三联i纲要。UBM medicaindia私人有限公司，班加罗尔。第十九卷:发行号5, 2013。268页。
6. 维恩射频。生物分析原理与实践，第二版，伦敦:泰勒和弗朗西斯;2000.p . 299 - 300
7. Taylor PJ, Johnson AG。高效液相色谱-电喷雾串联质谱法定量分析血液中西罗莫司(雷帕霉素)。中国生物医学工程学报(英文版);2008;18(3):344 - 344。
8. Kirchner GI, Vidal C, Jacobsen W, Franzke A, Hallensleben K, christian U, Sewing K.液相色谱-电喷雾质谱同时在线提取和分析血液中西罗莫司(雷帕霉素)和环孢素。中国生物化学学报(英文版);1999;29(4):319 - 319。
9. 李志强，李志强。高效液相色谱-紫外检测全血中西罗莫司的研究。中国生物医学工程杂志2000;22:B38-B48。
10. Maleki S, Graves S, Becker S, Horwatt R, Hicks D, Stroshane RM, Kincaid H.用高效液相色谱法监测人全血样本中西罗莫司的治疗性监测。2000年;22日,增刊。B:25 - 37。
11. 王晓明，李志强，李志强，等。高效液相色谱法测定全血中西罗莫司浓度的研究。王志强，王志强。2002;24(1):1 - 7。
12. Campanero MA, Cardenas E, Sadaba B, Garcia-Quetglas E, Munoz-Juarez MJ, Gil-Aldea I, Pazo D, Azanza JR, Honorato J.器官移植全血中西罗莫司治疗药物的高效液相色谱-紫外检测。中国生物医学工程学报(英文版);2004;
13. 李建辉，车克辉，赵伟，朴杰，朴海杰，赵艳，黄世杰。液相色谱-串联质谱法测定狗血中西罗莫司的含量及其在药代动力学研究中的应用。中国医药生物医学杂志。2010;53:1042 - 1047。
14. Mano N, Sato M, Nozawa M, Matsumoto Y, Mori M, Yamaguchi H, Goto J, Shimada M.人全血中西罗莫司的精确定量LC/ ESI-MS /MS方法。中国生物医学工程学报(英文版);2011;49(2):344 - 344。
15. Mano N, Nozawa M, Sato M, Mori M, Yamaguchi H, Kanda K, Nogami M, Goto J, Shimada M. LC/ESI- MS/MS对人血中西罗莫司定量分析中离子抑制的识别与消除。中国生物医学工程学报(英文版);2011;29(2):344 - 344。
16. A Anil Kumar, P Srinivas, K Spandana, N. Rama, J VidyaSagar。以酮康唑为内标的高效液相色谱法测定西罗莫司的含量及其应用。国际药学杂志，2012;4(1):70 - 73。
17. Goodyear N, Napoli KL, Murthy JN, Kahan BD, Soldin SJ。西罗莫司放射性受体测定。临床生物化学。1996;29(5):457 - 460。
18. Jones K, Saadat-Lajevardi S, Lee T, Horwatt R, Hicks D, Johnston A, Halt DW。西罗莫司的免疫测定方法。中华物理学报2000;22:B49 - B61。
19. 威尔逊D等人。西罗莫司微粒酶免疫法分析性能的多中心评价。临床生物化学。2006;39:378 - 386。