土壤抗生素耐药性和遗传性状孤立的细菌及其对青霉素和四环素的生存

文摘

现在很明显,土壤中细菌可以对某些抗生素产生了耐药性。在这个角度来看,本研究的主要目标是评估中国茶园的土壤和森林,以前从未被暴露于抗生素,但包含细菌菌株,可以依靠抗生素的能量和营养物质,并研究遗传性状为抗生素耐药性在这些压力。五属于Lysobacter细菌隔离,Variovorax,假单胞菌,Chitinophaga, Bradyrhizobium属被确定。这是观察到高标准的多种抗生素抗性普遍这些细菌质粒固化前后。p4和p5隔离非常耐β-lactams,而t1, t5, t9隔离耐四环素在使用浓度。抗性基因tetC和blaPSE-1相对广泛分布在这些细菌,而整合子没有发现任何孤立的菌株。这五种细菌的抗生素耐药性隔离可能是来自于质粒或染色体。

关键字

抗生素耐药性、土壤细菌、青霉素、四环素、遗传特征

介绍

抗生素的能力杀死细菌广泛的医药产业和世界发生了革命性变化。然而,抗生素的不当使用也导致惊人的传播杭生素耐药细菌的临床以及农业设置。已确定有临床兽医的抗药性细菌数量设置。甚至兽医抗生素已经检测到的分布土壤、地表水和地下水的最近和多药耐药性的发展已被调查1- - - - - -3)通过水平基因转移机制(4]。

抗生素耐药性来源于土壤环境的概念并不新鲜,已经存在了几十年5]。布尔戈斯et al。6)发现革兰氏阴性肠道细菌与奶牛场在新墨西哥州的表层土。森古普塔et al。7孤立的一个土壤样本包含不同的厌氧细菌和发现第16 - 25对抗生素的耐药性。几个土壤细菌拥有,耐药基因不是因为他们一直暴露在抗生素,而是因为他们生活在一个环境中抗生素生产商。和大多数这些基因是本构。例如,Dantas本人交出密码等。8]表明,一些土壤细菌从抗生素可以利用碳基质即使他们以前从来没有接触到这些抗生素。这些细菌的系统发育多样性是众所周知的,然而,目前尚不清楚,这些细菌是如何在环境中广泛分布。土壤细菌发挥关键作用在土壤生态视为抗菌素耐药性基因的潜在储层。刘和流行9]报道超过20000潜在的抗性基因属于交流。400种不同类型的生态环境。通常染色体编码抗生素敏感性和抗菌素耐药性正在成为代码由于环境的改变(突变10,11];然而,这些突变发生的速度大约每108年染色体复制。许多抗菌素耐药性基因存在于质粒或转座子,小块的环状DNA,只有1%的总大小的染色体,可以转移细菌物种之一。在过去的几年里,整合子,一种新的DNA元素,可以整合抗生素抗性基因已被调查和探索(12],它被发现的一部分转座子Tn21家庭或独立发现的几组broad-host-range质粒。

在我们之前的研究中,土壤细菌分离和鉴定的基础上依靠他们的能力青霉素或新霉素之前没有接触合成抗生素,使用的方法描述Dantas本人交出密码等。8]。隔离被发现有高水平的阻力,他们出人意料地显示一个伟大的系统发育多样性和人类athogens[密切相关13]。因此,我们继续这条线的研究通过测量土壤细菌生长的青霉素和四环素的土壤样本中收集的来自中国。青霉素和四环素被选为试验保持认为他们属于结构性类,和他们不仅广泛应用在临床设置畜牧生产部门也会出现在中国。抗生素抗性的遗传性状的孤立细菌也调查来确定土壤环境影响抗生素耐药性的传播。我们的研究和调查结果将提供更深入的洞察中抗性基因的转移和易位机制和细菌之间的社区。

材料和方法

土壤样品

收集表土样品(0-15厘米)从茶园(120º06年41”,30º13 36”)和原始森林(120º07年12”,30º14 20”),没有任何人为干扰,每个位于杭州,中国。根据初步调查认为,这两个网站都曾被暴露于青霉素和四环素。在每个站点,10 - 12使用无菌铲子收集土壤样本。样本混合彻底和复合样本获得通过将这种同质化混合物倒入一个塑料袋。复合样品送到实验室在2 - 6 h和储存在冰4ºC。选择土壤特征(表1)根据分析方法所描述的火花等。14]。

表1。简要描述土壤的细菌被孤立。

分离和鉴定的土壤细菌生长与青霉素和四环素

分离、培养土壤细菌与抗生素使用已经报道的方法(8]。基本培养基是利用单一碳源(SCS);细菌是连续稀释和spread-plated SCS琼脂,补充适当的相应的抗生素。两种抗生素,青霉素G和盐酸四环素,纯度> 99%的人购买桑戈语生物技术;它们的化学结构显示在图S1。细菌培养在SCS琼脂,没有任何抗生素,被选为消极的控制。的系统发育概要文件的细菌测定如前所述,Zhang et al。15]。短暂的16 s rRNA基因序列(核苷酸27 - 1492)放大了PCR和测序。细菌发展史决定基于16 s rRNA基因序列的变异,确定使用爆炸程序。细菌物种的系统发育树构建基于16 s rRNA序列使用neighbor-joining树方法(MEGA5.05)软件。引导分析被用来找出分支秩序的统计学意义,涉及1000棵树的结构重新抽样原始数据。

检测隔离和两个土壤中抗性基因和整合子基因(森林和茶)

十个不同的基因的存在细菌分离和测定土壤利用PCR和实时定量PCR(存在)。引物PCR、存在条件用于这项研究S1和S2表所示。的细菌的DNA用作模板被严酷的使用权力土壤溶解提取DNA隔离设备(莫生物实验室,卡尔斯巴德,CA),遵循制造商的指示。浓度和提取的DNA质量分光光度计测定(nanodrop - 2000)和琼脂糖凝胶电泳,分别。

PCR过程:聚合酶链反应混合物(总量、20μL)是由10μL 2 x容易利用PCR SuperMix (TransGen生物技术),1μL每个引物(10μM), 1μL模板,和7μL无菌重蒸馏的水。PCR是由变性温度为94°C 4分钟;其次是35周期45 s在94°C, 45 s在不同退火温度下,1分钟和72°C;然后最后一个扩展步骤6分钟在72°C。PCR产品通过2%的琼脂糖凝胶电泳分析1 x TAE缓冲区。所有乐队都从琼脂糖凝胶切除,并使用卡塔尔投资局快速凝胶萃取纯化工具包(试剂盒Inc .)、瓦伦西亚、钙、美国),然后由Sangon测序生物技术有限公司(上海,中国)使用BigDye终结者周期sequencing-ready反应装备ABI 3730毛细管测序仪。最近的比赛决定从基因库数据库使用ncbi blast程序。所有反应在这项研究中,进行了PCR检测为每个样本一式三份。标准没有DNA模板PCR混合物作为消极的控制,和积极的菌株携带基因或整合子测序验证了被用作积极控制。

中存在的程序:丰富的参数和16 s rRNA基因(16在土壤使用LightCycler量化^®480的实时PCR系统(罗氏应用科学,CA) qPCR。克隆载体变成了E。coli DH5α, and the transformant colonies were observed and selected by blue-white screening system on Luria-Bertani agar plates, containing 100 g∙mL¹氨苄青霉素,1公司¢ˆ™板¹5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactoside(半乳糖苷)和2.38公司¢ˆ™板¹isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG)。与一对通用引物PCR扩增(M13F和M13R),针对双方的克隆载体,用于确定适当的插入DNA的长度。插入DNA片段测序,Sangon生物科技(上海)有限公司,有限公司qPCR混合物(总量,20μL)由10μL 2 x SYBR qPCR SuperMix (TransGen生物技术),1μL每个引物(10μM), 1μL模板,和7μL无菌重蒸馏的水。热程序包含一个初始变性为30年代在94°C;其次是40周期的5 s在94°C, 15秒在不同退火温度,和72°C 10年代;紧随其后的是最后一个融化曲线阶段温度从60°C到95°C。质粒携带目标基因是连续稀释(10稀释)和用于生成校准曲线(Ct值与日志最初的价值目标基因拷贝数/反应)与每个存在的7分。每次测量校准曲线一起运行。PCR效率不同,是在87.38 - 100.24%的范围,和R2值> 0.993校准曲线。基于校正曲线,确定目标基因的拷贝数使用的Ct值测试样本与未知浓度,当时规范化的体积(mL)的原始样品和质量(ng)提取的DNA。

耐药性分析质粒固化前后的隔离种植在抗生素

十二烷基硫酸钠(SDS)是用于协议根据斯蒂芬et al。17),质粒固化的一些修改。细菌分离培养在水浴45ºC 18 h Luria肉汤(磅)含0.5% SDS与不断摇晃然后再孵化37ºC 18 h在磅消除质粒。选择失去抗生素耐药性的菌株,殖民地被转移到相应的琼脂板补充相应的抗生素在200公司¢ˆ™L¹使用复制品镀方法。殖民地因细胞已经失去了质粒被电泳检测。

阻力分析之前进行细菌分离和质粒后治愈。阻力分析,隔离是由使用液体媒体(富媒体),由溶解有关抗生素浓度200首先¢ˆ™L¹和1000年首先¢ˆ™L¹到冷却但以前热压处理过的仅有汤如前所述13]。测试包括氨基糖甙类抗生素(链霉素、新霉素),β-lactams(阿莫西林、氨苄西林)、大环内酯类(阿奇霉素与红霉素),四环素(氯四环素和土霉素)。

统计分析

数据准备、计算和统计分析使用Microsoft Office Excel和SPSS 16.0对Windows。方差分析(方差分析)是用来确定治疗效果。比较的方法进行使用邓肯的studentized范围检验P < 0.05。16 s rRNA基因序列的5株在这项研究中被存入数据库加入号KF898093-KF898097基因库,和基因核苷酸序列大于200 bp可以访问下加入数字KM594534 KM594536-KM594538, KM594543-KM594546。

结果与讨论

隔离和标识隔离

八个细菌隔离标识,能够使用青霉素或四环素在200公司¢ˆ™L¹作为唯一的碳源。形态的分类根据波拉克等。18]。隔离后,在存储两个隔离是不可行,不能产生一个可行的隔离在一个较高的收益率。其余的实验剩下的五个隔离。五个细菌隔离种植于200年青霉素和四环素首先¢ˆ™L¹。两个隔离(p4和p5)得到了青霉素上生长的森林,而其他三个分离株生长在四环素茶园(t5和t9)和森林(t1)。所有的隔离蓬勃发展和达到高原在30到50 h Luria汤与适当的相应抗生素浓度200 gA¢ˆ™L¹(图1)。五个分离的16 s rRNA基因测序,序列数据是用于开发系统发育关系(图2)。五株的16 s rRNA基因序列存入基因库KF898093-KF898097加入数据库下的数字。基于细菌的系统发育分析显然与这两个土壤属于一组不同的属。两个隔离p4和p5被种植在青霉素,属于Lysobacter enzymogenes和Variovorax脉,分别。该物种Lysobacter enzymogenes属于家庭Xanthomonadaceaewithin的Gammaproteo细菌。的l . enzymogenes应变最近宣布作为植物几种疾病的生物控制剂(19,20.),产生大量的胞外酶,包括多种形式的β-1,3-glucanases,和几丁质酶,有助于生物防除活动(2,15]。压力也显示出诱导系统阻力的能力在某些植物保护他们免受致病性感染(21,22]。Variovorax脉是无处不在的,革兰氏阴性需氧细菌的Variovorax属属于Comamonadaceae家庭。Variovorax脉中发挥着重要作用生物降解在自然界,也促进植物生长23]。

三个分离株(t1、t5和t9)生长在四环素是分为三个不同的属:假单胞菌,Chitinophaga,Bradyrhizobium,分别。隔离t1是最密切相关假单胞菌monteilii (16 s rRNA基因序列相似度99%)。假单胞菌monteilii,革兰氏阴性、杆状和能动的细菌从临床标本,分离是一种罕见的机会病原体或殖民者(24]。检测并分离出支气管送气音在里昂,法国和它的价值60 G + C含量摩尔% (24]。隔离t5最为密切相关Chitinophaga eiseniae,这属于属Chitinophaga在家庭中Chitinophagaceae是一种革兰氏阴性,杆状细菌检测和识别vermicompost收集在马山,韩国(25]。隔离t9最为密切相关Bradyrhizobiumsp。(16 s rRNA基因序列相似度99%),这是使用青霉素作为碳源的能力,并从玉米田被隔离在美国(14]。Bradyrhizobium是属革兰氏阴性细菌与土壤有关,其中很多固氮。虽然数量较小的菌株被分离和鉴定,中国茶种植园和森林土壤比先前的研究在美国进行(14),这些研究是一致的对微生物群落成员的身份。

抗生素抗性基因的多样性和整合子基因在细菌分离和土壤

四环素基因的存在,β-lactam-resistance基因,整合子基因5土壤隔离和两个土壤(森林和茶)是研究基因组DNA, PCR扩增后,存在,也证实了DNA测序。确定为四环素抗生素抗性基因的分布,我们评估tetM, tetO,邰蒂,tetW, tetC。虽然抵抗β-lactams已经由几种机制,研究的重点是β-lactamases,可以水解β-lactam戒指。发现了数以百计的β-lactamases,临床上最重要的主要的衍生品等existingβ-lactamase基因blaPSE-1(AMP)和检测。四环素基因tetC,编码四环素射流泵,β-lactamase基因blaPSE-1(AMP)编码β-lactamase,普遍在隔离,即使这五株属于不同的物种隔离两种土壤类型(表2)。这两个基因负责编码因素导致细菌抵抗一些抗生素,包括青霉素和四环素,并且可以从非致病性细菌致病性细菌,从而可能导致临床上重要的抗生素耐药性(26]。菌株中抗生素抗性基因的传播传染性疾病成为一个经常发生的问题。例如,基因编码PSE的检出率高不仅在被发现假单胞菌绿脓杆菌也有沙门氏菌(27,28]。

表2。pcr试验检测存在/缺乏各种参数在不同的隔离。

发现许多基因对抗生素耐药质粒、转座子,这使他们转移在不同种类的细菌。之间的直接关系被发现在最近的研究中,抗生素耐药性的增加以及收集阻力因素的整合子的形式嵌入在一个或多个基因磁带由特定站点重组(29日,30.]。到目前为止,已经有超过100种不同的类整合子被确定(31日]。然而,一班和二班整合子基因(int1和intII)已被确定为主要来源的抗菌素耐药性基因,被认为作为一个潜在的基因库抗性基因在各种革兰氏阴性,在较小程度上,革兰氏阳性细菌32]。然而,在目前的研究中,这两类整合子基因中没有检测到隔离,表明整合子基因没有广泛传播的土壤细菌菌株不仅对抗生素产生抗药性,而且还可以利用抗生素对能源和营养。缺乏整合子耐药菌株分离从临床环境曾被报道的一项研究中(33]。值得注意的是,一些细菌可能是耐火材料的隔离程序,或有跟踪整合子的副本,我们无法检测。我们的研究结果并不占潜在整合子的存在,低于我们的检测极限。

存在方法作为一种重要的工具环境的量化参数,研究环境因素如何确定参数的命运。从原始森林样本区域没有人为影响包含大量的基因,春节(T) (105 copiesA¢ˆ™g¹),我(105 copiesA¢ˆ™g¹),春节103 (C) (copiesA¢ˆ™g¹)和16 s (1010 copiesA¢ˆ™g¹)所示表3,这表明森林土包含一定程度的参数。然而,这是平常,arg游戏预计将出现在所有自然环境(3]。的阻力水平与整体人口的大小取决于使用标准化的复制数量细菌16 s rRNA基因相对;这些基因的表达在森林样本低于样本收集从茶园的土壤(图3)。茶园影响农业活动,如有机肥料的应用,考虑到30 - 90%的父母抗生素作为动物粪便排泄用于制造有机肥料(34]。在这些基因中,检测和int1土壤样本显示更高的表达式。

表3。绝对目标基因的副本在土壤和标准偏差。

抗生素耐药性质粒固化前后患病率和水平

抗生素耐药性每个5隔离决心反对8的抗生素,属于四个不同的类(β-lactams,氨基糖甙类、大环内酯类和四环素)之前和之后的质粒的养护。所有的抗生素使用的浓度200首先¢ˆ™L¹和1000年首先¢ˆ™L¹和准备使用丰富的碳源(Luria汤)。发现隔离p4抵抗所有的抗生素检测浓度200首先¢ˆ™L¹也显示抵抗大多数的抗生素浓度1000首先¢ˆ™L¹,但在质粒固化(表4)。剩下的隔离,最是耐β-lactams和大环内酯类。p4和p5隔离抵抗β-lactams,然而,t1, t5, t9隔离耐四环素在浓度。这些结果和Dantas本人交出密码的发现等。8),报告说,如果找到细菌分离耐抗生素;也对其他抗生素属于同一个类。从生态的角度来看,我们已经提出了土壤环境中抗生素耐药性可能占上风。越来越多的细菌病原体,耐多药耐药,在临床以及社区传播设置。出现这些严重的感染导致的耐药细菌是全球变得越来越常见35,36]。在我们的研究中,发现了高水平的阻力在森林土土壤中分离,没有人为的历史活动的报道。总体而言,我们的研究强调的重要性分析细菌生长的抗生素,观察高抗生素耐药性的正常菌群,而不是在个人病原物种。

表4。电阻的电阻模式菌株质粒消除之前和之后的治疗。

抗生素耐药性可能水平基因转移的结果也可能是由于在病原体基因组中可能发生的不相关的点突变的速度大约每108年染色体复制。能够很好的证明,负责生产青霉素酶的基因在大多数菌株plasmid-borne。质粒固化实验研究来确定抗性基因是否源于这些细菌的染色体或质粒。菌株的质粒消除了细菌的增长,十二烷基硫酸钠,阴离子表面活性剂。p4的敏感性和t5隔离观察所有八个抗生素在测试浓度消除质粒后使用。这些发现表明,氨基糖苷类、四环素、β-lactams,和大环内酯物,阻力是由plasmidassociated功能。其余的隔离(p5、t1和t9)敏感的氨基糖甙类,大环内酯类、四环素的质粒消除;然而,他们仍然发现耐阿莫西林和氨苄青霉素浓度较低的200公司¢ˆ™L¹,但不是在较高的浓度,1000年公司¢ˆ™L¹。抵抗β-lactams似乎是由染色体相关函数在上面的三个隔离。灰等。37)抽样不同河流的革兰氏阴性细菌在美国,发现超过40%的细菌,对一个以上的抗生素,港口至少有一个质粒,大小从2 kb > 23 kb。我们的研究结果表明,这些细菌的抗生素耐药性可能与质粒或染色体。然而,我们没有执行分析以发现这个假设的真实性。阻力的机理,观察到在我们的工作中,可能会进一步被放大澄清的质粒和染色体序列和比较序列与已知的抗生素resistance-carrying元素。

结论

土壤是丰富的一个非常大的水库和多样的微生物群落。五个细菌隔离可能对青霉素和四环素茁壮成长孤立属于Lysobacter, Variovorax,假单胞菌,Chitinophaga,Bradyrhizobium属。高层多个观察抗生素耐药性作为共同的表型在这些细菌质粒固化前后。抗生素抗性基因也被发现在这些细菌隔离。整合子中没有检测到任何隔离但副本是土壤中检测到,和这五种细菌的抗生素耐药性隔离与质粒或者染色体。土壤中存在耐抗生素菌株和基因可能提供的障碍和未来前景在抗菌药物发现和微生物生态学研究。

确认

作者欣然承认金融支持国家自然科学基金委(41401266),大多数(2015 cb150502)和浙江省科学与研究项目(批准号2016 c32084)。作者还想承认,感谢浙江大学的基础科学研究专项资金(517102 * 172210152),本科生精英培训计划(188190 * 170115101/013/002/001)和江苏现代作物生产的协同创新中心关于他们的财务援助。

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