和评论:生药学和植物化雷竞技苹果下载学》杂志上的研究表明
菜单e-ISSN: 2321 - 6182 p-ISSN: 2347 - 2332
e-ISSN: 2321 - 6182 p-ISSN: 2347 - 2332
丹唐1,Lian-Zhen谢1,2,Xue-Lei鑫1和h·a·爱莎1*
1植物资源的重点实验室和化学干旱地带和国家重点实验室的基础新疆本土药用植物资源利用、新疆物理和化学技术研究所,中国科学院,乌鲁木齐830011年,中华人民共和国
收到日期:12/04/2016;接受日期:10/06/2016;发表日期:17/06/2016
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背景:糖尿病是最常见的一种代谢综合征的特点是高血糖。干尼亚oblonga米勒(蔷薇科)是用于传统维吾尔医学和证明抗氧化剂和抗高血压属性,但抗糖尿病活性c . oblonga轧机。种子提取物(CSE)还没有探索。
摘要目的:CSE的治疗能力和底层CSE的作用机制进行了16种骨骼肌细胞。
方法:CSE评估他们的抑制活性对蛋白酪氨酸磷酸酶1 b(应用PTP1B)在体外。16种成肌细胞分化肌管和对待CSE(0μg /毫升到100μg /毫升)1 h。细胞生存能力评估通过MTT实验和细胞细胞毒性检测乳酸脱氢酶(LDH)释放16种细胞。四个关键蛋白质的磷酸化水平(一种蛋白激酶,IRS-1 GSK-3β和AMPK)参与PI3K / AKT信号通路被免疫印迹检测。
结果:CSE拥有良好anti-PTP1B活动的IC50值3.5μg /毫升。治疗的16种骨骼肌细胞CSE(0μg /毫升到100μg /毫升)并不影响细胞的生存能力。CSE 12.5μg /毫升增加葡萄糖消耗和糖原合成16种肌管。免疫印迹结果表明,CSE增加IRS - 1的磷酸化,AKT GSK-3β蛋白质在当下的胰岛素。
讨论和结论:这些结果表明,CSE促进葡萄糖代谢通过激活PI3K / AKT信号通路在16种细胞。研究报道CSE的治疗效果在体外第一次细胞模型,为糖尿病的预防和治疗提供潜在的候选药物。
糖尿病,维吾尔族传统医学,治疗、葡萄糖消耗、免疫印迹、药物的候选人。
糖尿病(DM),代谢综合征,其中最普遍的特点是持续的高水平的血糖(高血糖)。1型糖尿病被称为胰岛素依赖型糖尿病的特征是缺乏胰岛素的生产(1]。2型糖尿病是由于身体无法有效利用胰岛素,是最常见的糖尿病,与胰岛素抵抗密切相关(2]。因此;新的治疗方法来应对威胁的增加糖尿病的高需求。化疗流行的糖尿病的方法,如磺脲类、biquanides thinzolidinediones,但这些药物选择性地有限,肾脏和肝脏有毒副作用。近年来,已经有增加的影响研究自然植物的化合物对糖尿病的预防和治疗。
干尼亚oblonga米勒(蔷薇科)是一棵小树,它的果实是梨果许多种子。他们是用于生产果汁,果酱,果冻,利用获得有价值的成分化妆品和食品行业3,4]。c . oblonga是维吾尔族的传统医学和抗氧化和antithrombus属性。c . oblonga用于治疗或预防心血管疾病在传统的维吾尔医学(5- - - - - -7]。其果实和种子药用应用治疗消化不良、腹泻、贫血、肝炎、胃溃疡和喉咙痛(8]。c . oblonga乙醇叶提取物明显和剂量依赖性降低血压这表明其抗高血压效果(9]。酚醛树脂和有机酸的组成c . oblonga具有抗氧化和叶被证明抗增殖特性体外系统(10]。c . oblonga叶保护兔子睾丸和精子发生损害引起的高胆固醇血症(11]。一项研究报告酚醛概要和抗增殖的特性c . oblonga树叶和水果对人体肾脏和结肠癌细胞(12]。大部分的化学成分进行研究c . oblonga水果和叶子;然而,糖尿病的效果c . oblonga种子研究甚少。
蛋白质酪氨酸磷酸酶1 b(应用PTP1B)是一种消极的胰岛素信号调节器,而脱去磷酸phosphotyrosine残留的胰岛素受体(IR)或胰岛素受体底物(IRS-1) [13,14]。因此,这是一个潜在的药物治疗2型糖尿病的关键(15]。胰岛素receptor-substrate-1 (IRS-1)是一个对接几受体酪氨酸蛋白激酶(16]。信号蛋白磷酸化后,IRS-1结合,包括磷脂酰肌醇3-kinase (PI3K),调节胰岛素的代谢和生长功能(17]。AKT是一个关键的蛋白质参与PI3K通路,调节下游代谢酶(18]。此外,AKT激活促进糖原生成通过磷酸化和糖原合酶的失活kinase-3β(GSK-3β,调节糖原合酶)19,20.]。
在我们目前的研究中,c . oblonga种子中提取了使用有机溶剂萃取、大孔树脂分离和纯化,并在应用PTP1B被发现具有抑制作用在体外。与这一背景下,以细胞为基础的生物化验进行调查CSE的潜在的治疗效果在体外。CSE被发现在16种肌管增加葡萄糖消耗和糖原的合成。进一步的研究是调查对血糖降低的作用机理。CSE观察磷酸化程度上调节国税局,一种蛋白激酶和GSK-3β16种肌管通过免疫印迹。这些结果表明,通过诱导糖原生成CSE改善葡萄糖代谢。糖原的增加可能是激活的结果insulinstimulated PI3K / AKT信号通路。我们都知道,这种潜在的抗糖尿病的生物活性和作用机理CSE在16种肌管是首次报道。
试剂和化学物质
所有细胞培养补充剂如胎牛血清的边后卫,抗生素,杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM)和试剂盒试剂购自Gibco®生命技术(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)。phospho-AKT特定抗体,phospho-GSK-3β、phospho-AMPK phospho-IRS-1, AKT, GSK-3βAMPK从细胞信号技术(丹弗斯、马、美国)。特定抗体的应用PTP1B购买圣克鲁斯生物技术(美国达拉斯,TX)和二次抗体ScienCSE来自GE保健生活。重组人胰岛素从σ获得化学公司(圣路易斯,密苏里州,美国)。电泳试剂,包括Bis-Tris凝胶,缓冲区,和聚(vinylidenedifluo-ride) (PVDF)膜,得到从英杰公司(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)。c . oblonga种子购买从中国新疆维吾尔药业有限公司有限公司2011年10月。
制备c oblonga种子提取物(CSE)
c . oblonga干种子购自中国的新疆和田地区,由舒尔曼教授从中国新疆维吾尔药业有限公司有限公司2011年10月。c . oblonga种子是由粉和使用石油醚脱脂,然后受到ethanolic提取。约460 g的种子粉与70%乙醇混合(1:10)和旋转蒸馏提取60°C 2.5 h,回流液体re-extracted三次相同的条件下,以确保完整的提取,然后由旋转蒸发器蒸发去除残留的酒精。用大孔吸附树脂(AB-8)吸收和净化,这是筛选了用水和乙醇与不同浓度(10%、30%、50%、70%和95%)。提取相结合和蒸发干燥减少压力。残留冻干并存储在-70°C,后来这是用于在体外和在活的有机体内研究。
传播和维护社会的细胞
社会应激大鼠骨胳肌母细胞得到从类型文化的中国科学院,中国上海。16种成肌细胞保持在杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM)补充10% (v / v)胎牛血清,100单位/毫升青霉素,链霉素100μg /毫升在37°C调湿大气二氧化碳的5%。镀2天后,细胞达到70%到80%融合(第0天)。那时分化诱导代替的生长介质和2%马血清DMEM补充20纳米胰岛素(分化培养基I)。3天后,包含2%的DMEM培养基是改变马血清(分化培养基II)。肌管形成实现后5 - 7天的孵化,和细胞用于后续实验。
评价蛋白质酪氨酸磷酸盐1 b(应用PTP1B)活动
CSE进行评估对应用PTP1B描述他们的抑制活动(21对硝基苯磷酸)(p-NPP)和最后一个3.5毫米的浓度测定混合物(200μL)是作为衬底。CSE的混合物(1.25μg /毫升40μg /毫升),应用PTP1B,基质是孵化30分钟30°C,立即受到96孔酶标分光光度计在405海里。应用PTP1B抑制剂钠原钒酸盐作为积极的控制。
评估细胞的生存能力和细胞毒性
细胞生存能力在96年通过MTT分析化验——组织文化板块如前所述22]。CSE治疗24小时后,培养基从井中删除,MTT试剂的浓度0.5μg DMEM /毫升是添加到每个。4 h孵化后37ºC, MTT试剂在DMEM然后蓝色甲瓒产品是随着在DMSO 20分钟。将染料的吸光度测量的波长570 nm。细胞毒性试验,乳酸脱氢酶(LDH)泄露的数量从受损的细胞培养基使用LDH测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)。吸光度测量的波长450纳米。
葡萄糖消耗和乳酸化验
葡萄糖消耗进行了如前所述[23]。16种骨骼肌细胞培养在96 - 8 h板材组织培养在37°C。然后由血清DMEM培养基代替补充0.25% BSA和处理12.5μg /毫升CSE和/或胰岛素(最终浓度100 nmol / L) 24 h。培养基中的葡萄糖浓度是决定使用葡萄糖氧化酶试验设备(Applygen技术有限公司,北京,中国),葡萄糖消耗的数量被减去计算葡萄糖从控制(空白)。测量乳酸生产、细胞治疗使用相同的培养过程如上所述,使用乳酸和乳酸浓度检测检测设备(南京建成生物工程研究所、中国)
糖原含量和己糖激酶活性测定
糖原含量胰岛素的存在与否是评估在16种细胞生长在6孔板使用肌肉糖原试验设备(南京建成生物工程研究所、中国)。结果被蛋白质浓度来衡量热科学规范化皮尔斯BCA蛋白质化验设备,和糖原含量提出了微克每口井的葡萄糖当量和表达为毫克/ g的细胞。己糖激酶活性检测到己糖激酶试验装备(南京建成生物工程研究所、中国)。
西方墨点法
整个细胞细胞溶解与裂解缓冲(25毫米消息灵通的pH值7.5,150毫米氯化钠,1% igepal ca - 630 [Sigma-Aldrich], MgCl 10毫米2氟化钠1毫米EDTA 25毫米,1毫米Na3签证官4,EDTA-free蛋白酶抑制剂混合[Sigma-Aldrich])。蛋白质浓度测定用皮尔斯®BCA蛋白质分析工具包(热科学)。等量的pre-denatured蛋白质(50μg / lane)通过sds - page分离10%聚丙烯酰胺凝胶和电子转移到PVDF膜。孵化后阻断缓冲区(5% BSA Tris-buffered Tween-20盐水和0.1%)1 h,细胞膜与初级抗体反应(1:1000稀释)反对phospho-AKT, phospho-GSK-3β,phospho-AMPK, phospho-IRS-1, AKT, GSK-3β,AMPK, Glut4和β-actin用颤抖的隔夜4ºC。三次洗后TBST缓冲区,各自的辣根过氧化物酶的膜进一步孵化(合)共轭二次抗体在室温下2小时。免疫活性的乐队与发射极耦合逻辑检测免疫印迹检测试剂(英国通用电气医疗集团)。
数据被表示为±SD的手段。所有实验细胞进行至少一式三份。当多个进行了比较,分析了意义单向方差分析(SPSS 12.0)。* * * P < 0.05和P < 0.01被认为是具有统计学意义。
CSE对应用PTP1B的影响的活动在体外
蛋白酪氨酸磷酸酶1 b(应用PTP1B)的主要负调节胰岛素信号,已经成为一个有吸引力的目标治疗2型糖尿病的药物(24]。我们发现CSE抑制应用PTP1B活动40%和60%浓度的2.5和5μg / mL,分别为(图1)。的在体外试验结果表明,CSE有显著的抑制活性与应用PTP1B IC50值为3.5μg /毫升±0.21μg /毫升而积极控制原钒酸钠(IC50= 2.15±0.47)。建议CSE是一个很好的应用PTP1B抑制剂和潜在的治疗在体外。
图1:CSE提取物对体外应用PTP1B的抑制活性的影响。值意味着±SD三个独立的实验。CSE浓度从1.25μg /毫升40μg /毫升。
CSE对细胞生存能力和细胞毒性的影响
细胞生存能力是评估通过MTT分析和细胞细胞毒性检测到从16种细胞乳酸脱氢酶(LDH)释放。无论是细胞生存能力图2一个)和LDH细胞毒性(图2 b)改变(0μg /毫升25μg /毫升浓度范围。数据似乎略有减少50μg /毫升的浓度和100μg /毫升,但无统计学意义。治疗的16种骨骼肌细胞CSE(0μg /毫升到100μg /毫升)并不影响细胞的生存能力结果显示,CSE浓度在12.5μg /毫升在16种细胞生长无毒。
图2:CSE对细胞活力的影响(A)和细胞毒性(B),细胞生存能力是通过MTT分析化验在96年组织培养板。乳酸脱氢酶(LDH)外泄的受损细胞培养基用LDH试剂盒测量。数据代表三个独立实验的平均数±标准差。
CSE增加了葡萄糖消耗和乳酸生产
调查CSE的代谢活动,我们首先检查他们的监管在大鼠的葡萄糖消耗和乳酸生产16种肌小管细胞。16种肌小管细胞治疗得了增加浓度(0μg /毫升到100μg /毫升)。在缺乏胰岛素,CSE给出一个从0增加与不同浓度的葡萄糖消耗μg /毫升到12。5μg /毫升,但浓度较高(12.5μg /毫升)未能进一步增加葡萄糖消耗(图3一)。葡萄糖与胰岛素增加,消费增加更明显从6.25μg /毫升12.5μg /毫升,这表明CSE insulindependent地采取行动刺激葡萄糖利用率。利用葡萄糖产生ATP有氧在线粒体呼吸或厌氧呼吸(糖酵解)线粒体外。活化的糖酵解导致乳酸的生产。因此,我们对CSE乳酸生产的影响。有轻微改变基底乳酸生产,而insulininduced乳酸产量显著增加μg /毫升(6.25的浓度图3 b)。结果表明,CSE发挥了积极作用在促进葡萄糖消耗和乳酸生产胰岛素依赖型的方式。
积极影响的CSE糖原合成和己糖激酶活性
糖原是葡萄糖的主要存储形式在动物细胞(25]。肌肉和肝脏糖原储备对全身葡萄糖代谢很重要。调查糖原生成,从葡萄糖糖原的形成,我们发现糖原含量16种肌管根据anthrone-sulfuric酸比色法。CSE导致增强的糖原含量6.25μg /毫升和12.5μg /毫升浓度胰岛素刺激后(图4一)。增加骨骼肌糖原含量的CSE进一步证明,他们可能通过促进糖原合成提高葡萄糖利用率。葡萄糖是利用通过有氧呼吸和无氧呼吸产生ATP(糖酵解)16种细胞。糖酵解过程的第一步是葡萄糖的磷酸化己糖激酶(26,27]。CSE有效提高己糖激酶活性基底和胰岛素组(图4 b),这表明他们可能通过AMPK-mediated提高葡萄糖代谢糖酵解。结果显示,CSE可能促进葡萄糖代谢的糖原合成、糖酵解。
图3:CSE葡萄糖消耗的影响(A)和(B), 16种骨骼肌乳酸生产细胞饥饿0.25%牛血清白蛋白(BSA)在一夜之间。采用无血清细胞进一步孵化1 h中包含CSE(0μg /毫升12.5μg /毫升)和/或胰岛素(100海里)。中等的血糖浓度是由葡萄糖氧化酶法。乳酸生产检测用设备。数据代表三个独立实验的平均数±标准差。
图4:CSE对糖原含量的影响(A)和(B)己糖激酶活动。一夜之间,差异化的16种骨骼肌细胞被饿死。16种细胞治疗CSE 6.25μg /毫升和12.5μg /毫升的存在与否胰岛素(100海里)。糖原含量决定根据anthrone-sulfuric酸比色法。己糖激酶活动是由己糖激酶检测设备。结果均值±SD独立实验一式三份。
免疫印迹分析
PI3K-AKT胰岛素信号通路的激活可以促进葡萄糖代谢。蛋白质含量的关键因素在16种肌管AKT通路被免疫印迹检测。我们首先评估IRS-1和一种蛋白激酶磷酸化是否改变。IRS-1和AKT的总蛋白质含量与对照组相比没有显著变化(图5一个)。没有胰岛素,6.25μg /毫升和12.5μg /毫升CSE表现出积极的影响在一种蛋白激酶磷酸化,在国税局被CSE略低于对照组。CSE GSK-3β磷酸化水平的增加6.25μg /毫升浓度。多磷酸化水平的AMPK组远高于对照组在缺乏胰岛素。基于上述结果,磷酸化水平的IRS-1 AKT并没有增强CSE没有胰岛素的协同作用,而磷酸化水平的AMPK和GSK-3β蛋白质通过CSE只有。
美国国税局在胰岛素组,AKT, GSK-3β磷酸化被CSE(显著增强图5 b)。然而,CSE phospho-AMPK表达治疗几乎没有影响。CSE可以提高一种蛋白激酶的磷酸化和GSK-3β,和16种细胞治疗后效果更好的CSE和胰岛素的结合。结果表明,CSE增加国税局的磷酸化,AKT, GSK-3β主要是通过胰岛素敏感PI3K / AKT信号通路。
糖原合成的过程是由国税局的顺序磷酸化激活,AKT GSK-3β。胰岛素促进糖原合成在缺乏GSK3磷酸化在骨骼肌细胞(28,29日]。在这个实验中,phosphor-IRS-1增加,下游蛋白的磷酸化水平的一种蛋白激酶IRS-1也增加。AKT激活后,磷酸化GSK-3β这是一个至关重要的下游分子PI3K / AKT信号也在增加。由此可见,CSE促进葡萄糖代谢糖原合成过程中主要是由于激活刺激PI3K / AKT信号通路。
图5:IRS-1 CSE对磷酸化的影响,一种蛋白激酶,GSK-3βAMPK蛋白质。差异化的16种骨骼肌细胞治疗CSE 6.25μg /毫升和12.5μg /毫升的存在与否胰岛素(100海里)。通过免疫印迹蛋白质含量检测。
2型糖尿病(T2DM)病人的发病率正在增加在世界范围内,它的特点是胰岛素抵抗[30.]。治疗策略的干预2型糖尿病应该改善胰岛素抵抗和葡萄糖代谢中心(31日]。在目前的研究中,CSE被发现对葡萄糖刺激消费有积极影响,乳酸生产和糖原合成在差异化的16种肌管。结果表明,CSE促进葡萄糖代谢和有低血糖症的效果在体外。调查CSE的潜在作用机制,我们研究了蚀变的磷酸化IRS-1, AKT, GSK-3β包括胰岛素信号转导通路。免疫印迹结果表明CSE改善葡萄糖代谢通过激活PI3K / AKT胰岛素信号通路在16种肌管。总之,本研究首次证明了这一点c . oblonga种子CSE的降糖效果,阐述了行动的机制使用骨骼肌胰岛素抵抗模型结果显示c . oblonga种子作为一个有前途的代理糖尿病预防和/或治疗,肯定会鼓励未来的研究对糖尿病增加我们的知识这种植物的潜力。
这项研究受到了国际科技合作项目的新疆维吾尔自治区(20136014),美国国家科学基金会项目(没有。U1203203)和国家自然科学基金项目(31360078)。