从火葬昆虫rogenhoferi (Mayr, 1879)巢材料分离株的抗真菌活性(膜翅目:娘蜂科)

摘要

从树栖蚂蚁火葬蚁巢材料中分离出拮抗微生物，对其进行了研究抗真菌活动针对三个选定的entomo致病源真菌。从火葬炉绿僵菌(Crematogaster rogenhoferi)的巢材中提取了7种左右的行动菌，分别对绿僵菌(Metarhizium anisopliae)、球孢白僵菌(Beauveria bassiana)和Lecanicillium lecanii的潜在生长进行了抑菌试验。结果表明，这些菌株对所选真菌具有一定的抗真菌作用。在研究过程中，发现分离株对测试真菌的生长有有效的抑制作用

简介

蚂蚁作为群居昆虫生活在群体中，通常受到个体成员联合防御机制的良好保护。对于蚂蚁来说，巢穴通常是有限的资源[1］．火葬蚁是马卡兰加植物特有的[2，3.]、松树[4]还有金合欢[5］．巢穴分布在各种各样的地方，包括有或没有覆盖物的土壤中，岩石的裂缝中，以及树干和树枝上。树冠上蚂蚁的数量之多令人惊讶，因为蚂蚁的窝可以移动，它们原本是典型的地面节肢动物，专门在土壤中筑巢或在枯木中使用自然洞穴[6，7］．

蚂蚁建造不同类型的巢穴结构，包括用有机材料建造的地上土丘或一组地下室。这些结构可能在隔离菌落抵御极端温度的能力上有所不同。形成丘巢的物种也需要有机材料因此，预计它们的分布将与树木和灌木的分布密切匹配[8］．

真菌生长蚂蚁的巢结构不仅对蚂蚁很重要，而且对它们的真菌品种也很重要环境条件(9，10］．此外，巢友的存在被认为可以提高存活率和病原体抗性[11，12]因为群体规模的增加可能会促进所有的梳理[13，14］．

使蚂蚁能够独立于现有的洞穴建造巢穴的策略的发展，是迈向永久征服冠层的最重要的进化步骤之一[15］．在火腹蚁的巢内经常发现不确定的真菌。由于这些真菌只在最内部发育良好的部分被发现，它们似乎不太可能像其他箱房蚁种那样稳定巢穴。赫胥黎进一步提出，蚂蚁可能以一种真菌的孢子为食，这种真菌寄生在Myrmecodia spp的块茎中。

本研究的目的是评估分离的放线菌和三种昆虫病原真菌的功效，绿僵菌属anisopliae，白僵菌而且Lecanicillium lecanii。

材料与方法

收藏的网站

嵌套材料种蚂蚁rogenhoferi于2014年5 - 6月在梅加拉亚邦Jaintia Hills的Sohmynting村的社区森林中采集。巢材采集于无菌容器中，带到实验室进行调查。

隔离

取小片窝盒，用10%次氯酸钠浸泡3-5分钟，用2 - 3列无菌水清洗，然后放在SDA板表面。这些平板在室温(28-30°C)下孵育，并定期观察。真菌菌丝的生长发展中然后从巢盘中无菌转移到新鲜SDA中。产孢后鉴定真菌，纯培养物在4°C的SDA平板上保存。

分离株的形态鉴定

分离的真菌菌株在SDA平板上26℃培养7天，观察菌落形态。根据Wipornpan等人建立的方法，利用分生孢子的大小和形状、菌丝分离和色素沉着等显微形态学特征来鉴定真菌分离株。[16］．

放线菌抗真菌活性的筛选

抗真菌活性测定-孔扩散法

用无菌棉签将试验真菌培养物接种到新鲜制备的SDA板(真菌菌株)中。将醋酸乙酯提取物蒸发得到的纯化提取物溶解在1ml、0.2 ml磷酸盐缓冲液中。用软木钻孔机在接种板上钻孔(直径约5mm)，每孔装100 μl培养上清。含有真菌菌株的培养皿在室温下孵育5-7天。孵育后，测量抑制区，并以毫米直径表示[17］．

抗真菌活性测定双平板法

在SDA平板中心点接种试验真菌，在平板外围点接种拮抗菌株。每个平板在28°C下孵育72-96小时，稍微改变位置。测定了每个菌株周围真菌的抑制区。

结果

分离株的分离与形态鉴定

革兰氏染色后显微镜观察(1000倍放大)显示该菌株为革兰氏染色阳性杆状微生物[18］．其他形态特征，如菌落特征、菌丝面积类型、气质颜色、营养菌丝生长、反面色素、破碎模式和孢子形成[19) (图1）.

从燕窝材料中分离出7种真菌种蚂蚁rogenhoferi；这些都是枝顶孢属spp.，莫蒂菌属，毛霉菌spp。，木霉属spp。，曲霉菌，青霉属，和Absidia属。枝顶孢属spp。，木霉属spp。，曲霉菌。，毛霉菌spp而且酵母spp。也有某些酵母菌和一些非产孢真菌栖息在巢材中(图2）.

分离株抗真菌活性测定

抗真菌活性测定-孔扩散法

所有7株分离株(放线菌)均对3种昆虫病原进行了筛选绿僵菌属anisopliae，白僵菌而且Lecanicillium lecanii分别。其中45%表现出抗真菌活性。分离株对病原菌的抑菌活性较好。菌株的培养上清液也表现出良好的抑菌活性(表1而且图3）.

表1:放线菌分离株对三种选定昆虫病原的抑菌活性——井扩散法。

(ii)双平板法测定抗真菌活性

分离的放线菌与试验菌一起生长，证实了其抗真菌活性绿僵菌属anisopliae，白僵菌而且Lecanicillium lecanii分别。所有分离株均表现出抗真菌活性，对测试生物有效(表2；图4而且5）.

表2:分离放线菌对三种选定昆虫病原的抗真菌活性。双板测定法

讨论

这是首次从树栖筑巢蚁的巢材中分离出多种放线菌。分离株以革兰氏阳性拮抗为主;然而，目前还不清楚这种活动是由一个还是多个活动引起的抗菌化合物。链霉菌可产生多种抗生素[20.]，有些菌株可产生多种抗微生物药物[21］．从收集到的数据来看，结果表明活性菌株对所选的三种病原菌具有抗真菌活性。这可能是由于它们的细胞外代谢物改变了其渗透性，或由于抑制了孢子萌发，或由于局部分离菌产生的抗生素扩散到介质中，从而影响了真菌的生长。由于这种复杂性，需要对我们在多种培养条件下产生的分离物的提取物进行进一步研究，以了解我们测定中显示的生物活性背后的机制。

我们分离出的大多数菌株都属于链霉菌属，与调查巢相关昆虫材料的类似研究一致。这包括那些与切叶蚁有关的研究[22-25]、钻木甲虫[26-28]、蜂蜜和无刺蜜蜂[29，30.]，独居的蜜蜂[31，32]、掘地胡蜂[33]、抹泥黄蜂[34-36]、白蚁[37，38］．此外，Ruddick和Williams [39]，表明链霉菌的孢子与许多节肢动物的角质层有关。

虽然人们对树栖蚂蚁筑巢如何控制巢穴卫生知之甚少[40，41]， Hoggard等人[42发现筑巢黄蜂会产生活跃的表皮抗菌化合物。这可能排除了共生产生这种化合物的需要。我们的数据表明，与其他关于其他昆虫巢穴基质放线菌的研究相一致，表明节肢动物巢穴材料是可培养的、异源放线菌的栖息地，包括链霉菌和其他稀有属[22，29，32，37，43]，而不考虑潜在的共生关系。为了确定本研究中分离的放线菌是否产生了新的化学物质，有必要对我们研究中所见的抗菌活性进行进一步的研究。通过进一步研究与这些树栖蚂蚁相关的微生物群落的多样性，我们将能够更好地了解这些树栖蚂蚁是如何保持巢穴卫生的，以及哪些微生物会影响它们的适应性。这种生长抑制作用表明放线菌活性菌株可以作为生物真菌制剂进行研究。但本研究中该菌株的活性成分有待进一步研究抗生素生产。

结论

从树栖蚁箱巢中分离出的放线菌种蚂蚁rogenhoferi很有可能产生有价值的次级代谢产物，如抗生素。尽管市场上有很多抗真菌抗生素，但控制真菌疾病的问题仍然没有得到解决，这是因为病原体的耐药性。因此，为了克服这些问题，有必要从树栖蚁窝等新的栖息地中寻找新的化合物。

致谢

作者感谢印度西隆东北山大学动物学系主任兼主管S. R. Hajong博士提供实验室设施。作者的悲哀，他们特别感谢H. Kayang教授和他的学生，植物系帮助培养和鉴定分离的真菌。DST(塞尔维亚)，新德里的财政支持是高度赞赏的。

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