研究与评论:微生物学与雷竞技苹果下载生物技术杂志
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收到日期:15/12/2016;接受日期:25/12/2016;发表日期:28/12/2016
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目前，对乳酸菌产生的抗菌物质已做了一些研究工作，但其抗菌机制尚未完全了解。本研究旨在探讨乳酸菌对酵母菌的抑制机理。两种乳酸菌研究了ALAC-3和ALAC-4抗酵母能力较强。采取白色念珠菌以活性物质粗提物为指示菌株，通过测定活性物质粗提物对酵母生长曲线、膜透性、蛋白表达及与DNA相互作用的影响来解释抑菌机理。结果表明，两种菌株产生的抑制物质对酵母生长有影响，缩短了对数生长期，降低了生物量。经抑制物质处理后，酵母培养基中的电导率、可溶性蛋白含量和可溶性总糖含量均有所增加。这表明酵母细胞膜的完整性发生了改变，这些物质全部从酵母细胞中渗出。通过SDS-PAGE检测对酵母蛋白表达的影响。经抑制物质处理后，酵母部分蛋白表达带出现缺失或减少。紫外光谱技术表明，抗酵母物质通过静电结合和槽结合作用于酵母DNA。
乳酸菌;禁止的物质;酵母;抑制机制
食品安全这与公共卫生近年来，这一领域受到越来越多的关注。新型食源性疾病的出现疾病食源性腐败和致病菌引起的疾病爆发是食物安全面临的主要挑战之一[1，2]。在过程中食品加工，人们采用各种技术措施，防止微生物的正常生命活动，使食品更容易保存较长时间。其中使用起来非常方便，而且有效的方法是在食品中添加防腐剂，所以添加食品防腐剂一般都采用[3.]。随着生物技术的发展和创新，人们对天然食品防腐剂进行了研究，天然食品防腐剂是以植物、动物和微生物代谢产物为原料，通过提取、发酵或利用各种酶生产而成的天然食品防腐剂。由于其无毒、无害、安全而逐渐得到人们的重视，反之亦然是中国防腐剂未来发展的重要趋势。4]。
酵母菌污染与食品健康关系:细菌,酵母霉菌在食品变质过程中起着重要作用。一般情况下，细菌往往具有酵母和霉菌的优势，但酵母属(属酿酒)，又称糖酵母，可耐高浓度糖，制作糖浆、蜂蜜和蜜饯等食品发酵酸败。在大多数情况下，酵母对人体有益。但酵母的大量存在不仅会造成食品风味恶化，甚至会促进致病菌的生长。酵母对各种防腐剂、电离辐射照射、冷冻等有很强的抵抗力。它可能成为食物变质的主要细菌。目前，对乳酸菌产生的抗菌物质进行了一些研究工作，但对其抑菌机理的研究较少。我们的目的是研究抗菌物质对酵母生长曲线的影响，以及抗菌物质对细胞膜通透性、蛋白表达及与DNA相互作用的影响，最终阐明抗菌物质对酵母的抑制机制。
微生物及化学品
乳酸菌:从传统菌株中筛选出两株ALAC-3和ALAC-4发酵食品在37℃的MRS液体培养基中培养24 h，在4℃的MRS固体培养基中接种。
细菌指标:白色念珠菌，标准菌株，编号32819，来自中国工业微生物菌种保存管理中心，在4℃倾斜的YEPD固体培养基中培养，在30℃YEPD液体培养基中培养36 h。研究中使用的所有其他化学品都是分析级的
抗菌物质粗提物的制备
的乳酸菌膨胀至MRS液体培养基(37°C, 24 h)，悬浮液以4000 g离心10 min，上清浓缩至25次。然后在浓缩溶液中加入适量饱和硫酸铵溶液，4℃放置过夜。样品离心(4°C, 8000 gx, 20分钟)，丢弃上清液。采用无菌蒸馏水将沉淀配置为不同质量浓度的粗提物，质量浓度分别为0.05 g/mL、0.5 g/mL、2 g/mL、4 g/mL。储存在4°C。
生长曲线的研究
将0.1 mL酵母液和0.1 mL活性物质粗提物(4 g/mL)加入5 mL YEPD液体培养基中。将0.1 mL酵母溶液和等量无菌水加入5mL YEPD液体培养基中作为空白对照。在30℃下孵育0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36 h，用紫外分光光度法测定600 nm处的吸收值。每项试验重复三次[5]。
细胞膜通透性
以酵母的电导率、可溶性蛋白含量和可溶性总糖含量来表征细胞膜通透性的变化[6]。将酵母溶液加入生理盐水中，充分混合后加入不同浓度的活性物质粗提物。加入等量无菌水作为空白对照，在一定时间内测定电导率。每项试验重复三次。
细胞膜的完整性是通过测量蛋白质释放到细胞悬液来评估的。根据Lv等人使用的方法[7]，从悬浮液(100 mL)酵母中收集酵母细胞，以4000 g离心15分钟。细胞洗涤三次，重新悬浮于PBS (0.1 M, pH7.4)中。将100 mL洗净的悬浮液摇碎，在活性物质的不同浓度粗提物存在下，在30°C下孵育4小时。悬浮液4000g离心5 min，收集上清液，PBS稀释，用紫外分光光度计测定595 nm处的吸收。
将酵母溶液加入生理盐水中，充分混合后加入不同浓度的活性物质粗提物。然后分别在30°C下处理2、6、10、24 h。4000 g离心10 min，收集上清液。将蒽酮试剂加入上清液中，在沸水中加热7 min，暗处静置10 min，用紫外分光光度计测定620 nm处的吸收，葡萄糖标准曲线中可见可溶性总糖含量。每项试验重复三次。
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酵母溶液和活性物质粗提物4 mg/mL加入到50 mL YEPD液体培养基中。将0.1 mL酵母溶液和等量无菌水加入5 mL YEPD液体培养基中作为空白对照。在30°C下分别处理2、6、10、24 h。所有样品在6000 g下离心10 min，然后丢弃上清液。细胞球经生理盐水冲洗后重悬。SDS-PAGE分析前，超声波破坏酵母细胞悬液30 min, 6000 g离心10 min。弃掉上清液，加入无菌水加入沉淀物，混合均匀。将缓冲液按1:3的体积比加入样品。将混合物煮沸5分钟，然后放在冰上冷却。每个样品取20 μL进行SDS-PAGE分析。电泳后用考马斯亮蓝R-250染色，脱色得到分离的蛋白条带。
与酵母DNA相互作用
将酵母接种到YEPD液体培养基中(30℃，36 h)， 4000 xg离心15 min，收集沉淀。采用玻璃珠法提取酵母基因组DNA。DNA浓度为398.0ng/μl。通过检测吸光度比A260 /A280在1.8-2.0范围内检测DNA的纯度，表明DNA充分不含蛋白质[8,9]。DNA与不同浓度的活性物质粗提物在Tris-HCl缓冲液(0.1 M, pH 7.4)中相互作用。紫外分光光度计在220-320 nm范围内测量紫外- vis吸收光谱，紫外分光光度计配备1.0 cm路径长度的常规石英电池。
活性物质粗提物对酵母生长曲线的影响
显示两株菌株的time-kill数据图1．空白对照为酵母在30℃下的正常生长曲线。添加抑制物质后，相同生长时间的OD值均低于对照。同时，对数生长期缩短，生物量减少。结果表明，酵母的生长受到抑制物质的影响。ALAC-4产生的抗菌物质对酵母生长的影响大于ALAC-3。
图1:活性物质粗提物对酵母生长曲线的影响。
活性物质对膜透性的影响
通过测定酵母肉汤的电导率来表达酵母肉汤的渗透性变化细菌细胞膜。结果(图2及3)表明，酵母悬浮液的电导率低于对照抗菌含量为0.05 g/mL。原因可能是抗菌物质并没有破坏细胞膜，而是通过静电成键与细胞膜外表面结合，导致带电离子减少，进而降低了介质的导电性。当抗菌物质浓度为2 g/mL和4 g/mL时，电导率均高于对照组。在前几分钟内，随着抗菌物质水平的增加，电导率迅速增加。在此之后，增长趋于放缓。结果表明，抗菌物质可增加细胞膜的通透性细胞的泄漏．此外，以ALAC-4为抑制物质处理的酵母悬浮液电导率高于ALAC-3。
图2:ALAC-3生产抗菌物质对酵母电导率的影响。
图3:ALAC-3生产抗菌物质对酵母悬浮液电导率的影响。
信息发布细胞可以揭示成分的完整性细胞膜．研究发现，可溶性蛋白在与抗菌物质接触后明显释放到细胞悬液中，且含量增加(雷竞技网页版图4）.酵母悬液中可溶性蛋白含量高于对照。
图4:抗菌物质生产对酵母悬液可溶性蛋白的影响。
在两种细菌的情况下，当酵母与相同浓度的抗菌物质反应时，变化是一致的。可溶性蛋白含量从2 h到6 h显著降低，说明抗菌物质可能抑制了酵母蛋白的合成速度。从6 h到10 h，可溶性蛋白含量明显增加，10 h后进入稳定状态。在此期间，酵母细胞膜通透性被破坏，培养基中可溶性蛋白含量增加。同时发现总可溶性糖含量的变化(图5）.与对照相比，添加抗真菌物质后可溶性糖含量增加。
图5:总可溶性糖含量的变化。
结果表明，抗菌物质暴露后，酵母细胞膜的完整性被破坏，扫描电镜和透射电镜可以观察到(数据未显示)，因此可溶性蛋白和细胞内碳水化合物被释放到细胞悬液中。这可能是抑制物质导致酵母细胞死亡的证据之一。
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蛋白质在动物的生命活动中起着重要的作用微生物细胞．经处理的酵母蛋白电泳条带与对照组有显著差异。添加活性物质后，酵母蛋白条带发生了变化。随着处理时间的延长，条带变弱，有的甚至消失，如A、B、C条带图6， A, B, C, I在图7．所有波段图7比前一个要暗淡。这表明，活性物质对酵母蛋白的表达有显著的影响，既可以破坏酵母蛋白的表达，也可以抑制酵母蛋白的合成，从而导致酵母蛋白的死亡。Zeng, X报道了类似的结果[10]。
图6:ALAC-3抗菌物质生产对酵母M: Marker#26614蛋白表达的影响1: ALAC-3生产的活性物质粗提物;2:酵母悬浮液;3-6:将活性物质粗提物加入酵母中，分别发酵4、8、12、24 h。
图7:ALAC-4抗菌物质生产对酵母M: Marker#26614蛋白表达的影响1: ALAC-4生产的活性物质粗提物;2:酵母悬浮液;3-6:将活性物质粗提物加入酵母中，分别发酵4、8、12、24 h。
DNA与抗酵母物质相互作用的紫外吸收光谱
对于与DNA结合的制剂来说，插层结合、凹槽结合和静电结合是三种主要的结合方式[11，12]。抑制物质与DNA的结合已通过吸收光谱中的低色和高色来表征[13]。当抑制物质插入核酸碱基对之间时，在吸收最大值处观察到红移和低色度[14]。吸收光谱表明，ALAC-3和ALAC-4在269 nm处均有吸收峰，且随着抗酵母物质用量的增加，吸收峰明显降低，且无带移现象(图8和图9）.所以这种结合方式不是插层式结合。有研究人员利用DNA的紫外吸收光谱研究了小分子与DNA的结合方式。一般来说，静电结合可以中和DNA中带负电荷的磷酸基。结果，DNA收缩，出现低色效应[15]。这说明抗酵母物质与酵母DNA的结合方式可能是静电结合。
图8:ALAC-3产生的不同浓度抗酵母物质与DNA相互作用的紫外吸收光谱。含量(抗酵母物质)/(X10 .3g.mL1) (a-d):0,0.003,0.006,0.009。
图9:不同浓度ALAC-4抗酵母物质与DNA相互作用的紫外吸收光谱。含量(抗酵母物质)/(X10 .3g.mL1) (a-d):0,0.003, 0.006,0.009。
在相同浓度的抗酵母物质作用下，吸收峰随作用时间的延长而增加(图10及11）.吸收光谱的应用可以为dna结合提供有用的信息。在吸收光谱中，由于DNA双螺旋结构的损伤，在269 nm处观察到高显色现象，添加抗酵母物质后没有任何带移。其原因可能是抗酵母菌物质通过沟槽结合与酵母DNA结合，使DNA的空间构象变松，出现显色现象。结果表明，抗酵母物质与酵母DNA的结合影响了双螺旋结构。
图10:不同时间ALAC-3抗酵母物质与DNA相互作用的紫外吸收光谱。A-d: 3 h、6 h、12 h、24 h。
图11:不同时间ALAC-4抗酵母物质与DNA相互作用的紫外吸收光谱。A-d: 3 h,6 h,12 h, 24 h。
本研究对乳酸菌产生的抗酵母物质的抑制机制进行了研究。结果表明，抗酵母物质对酵母生长曲线有一定的影响。酵母的对数生长期缩短，生物量降低。经抑制物质处理后，酵母培养基的电导率、可溶性蛋白含量和可溶性总糖含量均有所提高。这表明酵母细胞膜的完整性受到破坏，导致酵母细胞内的电解质、可溶性蛋白和可溶性总糖外溢。其中ALAC-4的活性物质对酵母细胞膜的通透性影响较大。酵母中蛋白的表达也受抑制物质的影响。酵母部分蛋白表达量减少或缺失。采用紫外光谱技术研究了抗酵母物质与酵母DNA的相互作用。在酵母DNA中加入抗菌物质后，其紫外吸收值明显降低，并出现低色现象。 With the extension of treatment time, the ultraviolet absorption value was increased and hyperchromism were observed. The results showed that antiyeast substance interacted with yeast DNA through the electrostatic binding and groove binding.
国家自然科学基金资助(31260390)。
