Antifungul机制对酵母的乳酸菌产生的活性物质

文摘

目前,一些研究工作已经完成在乳酸菌产生的抗菌物质,但其抗菌作用机制尚不完全清楚。本研究的目的是探讨乳酸菌在酵母的抑制机制。两个菌株的乳酸菌ALAC-3和ALAC-4 antiyeast能力强的研究进行了研究。采取白色念珠菌指标压力,抑制机制是解释为确定原油的影响提取活性物质在生长曲线、膜透性、蛋白质与DNA表达和互动的酵母。结果表明,抑制的物质所产生的两种影响酵母的生长,对数生长期缩短,生物量下降。电导率、可溶性蛋白质含量和可溶性总糖含量的文化媒体酵母被发现在治疗后继续增加通过抑制物质。它表明酵母细胞膜的完整性是改变,这些蜘蛛从酵母细胞。对酵母的蛋白质表达的影响也是通过sds - page检测。一些蛋白质表达的酵母在治疗后出现不足或减少通过抑制物质。紫外光谱分析表明,antiyeast物质在酵母DNA通过静电绑定和槽绑定。

关键字

乳酸菌;禁止的物质;酵母;抑制机制

介绍

食品安全是非常相关的公共卫生还有近年来在这一领域越来越多的关注。新食源性的出现疾病引起的食源性暴发腐败和病原菌是食品安全的一个主要挑战1,2]。过程中食品加工,人们使用各种技术措施来防止微生物的正常生命活动,所以食物可以更容易保持很长一段时间。使用,这是非常方便和有效的方法是添加防腐剂在食品,所以添加食品防腐剂通常使用(3]。随着生物技术的发展和创新,人们已经研究了天然食品防腐剂,这是由使用的植物,动物和微生物代谢产物为原料,通过提取、发酵或使用各种酶生产的天然食品防腐剂。由于其无毒、无害、安全并逐渐得到人们的关注,反之亦然是中国未来发展的一个重要趋势的防腐剂4]。

酵母真菌污染和食物健康关系:细菌,酵母和模具在食物变质过程发挥重要作用。在正常情况下,细菌往往利用酵母和霉菌,但酵母属(属酿酒),也称为糖酵母,它可以抵抗高浓度的糖,糖浆,蜂蜜和蜜饯水果和其他食物发酵酸败。在大多数情况下,酵母对人体有好处。但大量酵母的存在不仅能导致食品风味和恶化,甚至促进病原菌的生长。酵母有很强的抵抗各种防腐剂、电离辐射、冻结等。它可能成为占主导地位的细菌在食物变质。目前,一些研究工作已经完成在乳酸菌产生的抗菌物质,但很少有研究其抗菌机理。我们的目的是研究抗菌物质对酵母菌的生长曲线的影响,及其对细胞膜通透性的影响,蛋白质表达和DNA的相互作用,最后阐明其机制,抑制酵母。

材料和方法

微生物和化学物质

乳酸菌:两株ALAC-3和ALAC-4从传统的筛选发酵食品在内蒙古和维护在固体培养基夫人穿刺4℃接种物被24小时准备文化在夫人的液体培养基中37°C。

细菌指标:白色念珠菌标准菌株,号码是32819,中国工业微生物菌种保藏管理中心和维护在4℃偏YEPD固体培养基,接种物是由36 h文化YEPD液体介质在30°C。所有其他化学物质用于研究均为分析纯

制备粗提取物的抗菌物质

的乳酸菌夫人被扩大到液体介质(37°C, 24小时),暂停在4000 g离心10分钟和上层清液集中25倍。然后适当数量的饱和硫酸铵溶液添加到浓溶液和放在4℃过夜。样品是离心机(4°C, 8000 gx, 20分钟),并丢弃的上层清液。降水的粗提取液配置不同质量浓度用无菌蒸馏水,质量浓度为0.05 g / mL, 0.5 g / mL, 2 g / mL,分别4 g / mL。它是储存在4°C。

生长曲线的研究

0.1毫升酵母溶液和0.1毫升粗提物的活性物质(4 g / mL)加入5毫升YEPD液体介质。添加0.1毫升酵母溶液和同等数量的无菌水成YEPD 5毫升的液体培养基中空白的控制。他们在30℃培养0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36 h,吸收值在600海里被使用紫外分光光度法测量。每个测试进行了一式三份(5]。

细胞膜的渗透性

电导率、可溶性蛋白质含量和可溶性总糖含量酵母进行表达膜透性的变化(6]。酵母的解决方案是添加到生理盐水,在完全混合和不同浓度的粗提物的活性物质也被添加到它。添加等量的无菌水空白控制,电导率是衡量一段时间。每个测试进行了一式三份。

细胞膜的完整性评估通过测量的蛋白质释放到细胞悬液。根据Lv等所使用的方法。7),从悬架(100毫升)的酵母酵母细胞离心收集的15分钟在4000 g。细胞被洗了三次,re-suspended在PBS(0.1米,pH7.4)。100毫升洗悬挂是群和孵化30°C 4 h的变量浓度的粗提物的活性物质。然后,悬挂在4000 g离心5分钟。之后,收集上清液,用PBS稀释,吸收在595海里被使用紫外分光光度计测量。

酵母的解决方案是添加到生理盐水,在完全混合和不同浓度的粗提物的活性物质也被添加到它。然后混合处理2 6 10,24小时分别为30°C。在4000克,离心机后10分钟和上层的收集。蒽酮试剂添加到上层清液,在沸水中加热7分钟,站在黑暗的10分钟后,在吸收620海里被使用紫外分光光度计测量,发现可溶性总糖含量的葡萄糖标准曲线。每个测试进行了一式三份。

sds - page

酵母溶液和4毫克/毫升粗提物的活性物质被添加到50毫升YEPD液体介质。添加0.1毫升酵母溶液和同等数量的无菌水成YEPD 5毫升的液体培养基中空白的控制。混合物治疗2、6、10、24小时分别为30°C。所有样品都在6000 g离心10分钟,然后是浮在表面的被丢弃。细胞颗粒在生理盐水冲洗和resuspended。sds - page分析之前,酵母细胞悬液被超声波中断30分钟和离心10分钟。6000克放弃了上层清液,无菌水被添加到沉淀和混合均匀。缓冲区被添加到样品的体积比1:3。混合煮5分钟,在冰上冷却。然后,20μL sds - page分析每个样本收集。经过电泳,凝胶与考马斯亮蓝r - 250染色,然后使脱色获得分离蛋白带。

与DNA的酵母

酵母接种到YEPD液体介质(30℃,36 h)酵母的解决方案是离心机在4000 xg 15分钟。之后,收集沉淀。玻璃珠的酵母基因组DNA提取方法。DNA是398.0 ng /μl的浓度。DNA的纯度检查通过监测的吸光度比值A260 / A280范围1.8 - -2.0,表明DNA是充分自由的蛋白质(8、9)。原油中提取的DNA和不同浓度的活性物质相互作用在Tris-HCl缓冲区(0.1米,pH值7.4)。紫外可见吸收光谱在220 - 320纳米的范围是衡量使用紫外分光光度计配备传统石英电池路径长度1.0厘米。

结果与讨论

粗提物的活性物质对酵母菌的生长曲线

两个菌株的time-kill数据显示在图1。空白的控制是正常的酵母生长曲线在30℃。后的抑制物质,相同的OD值增长时间低于对照组。同时,对数生长期缩短,生物量下降。结果表明,酵母的生长抑制物质的影响。和ALAC-4产生的抗菌物质对酵母生长的影响大于ALAC-3。

活性物质在膜透性的影响

酵母肉汤的电导率检测表达的渗透率变化细菌细胞膜。结果(图2和图3)表明,酵母菌悬液的电导率低于控制时的浓度抗菌物质为0.05 g / mL。原因可能是抗菌药物并没有破坏细胞膜,但细胞膜结合的外表面通过静电结合,含铅离子的减少,减少介质的导电性。电导率高于控制抗菌物质的浓度在2 g / mL和4 g / mL。电导率增加在应对迅速提高水平的抗菌物质在最初的几分钟。之后,经济增长往往会慢下来。结果表明,抗菌物质可以增加细胞膜的通透性细胞的泄漏。此外,酵母悬架被抑制物质来自ALAC-4显示电导率高于ALAC-3。

信息的发布细胞选民可以披露的完整性细胞膜。很明显在研究中可溶性蛋白被释放到细胞悬液和水平提高与抗菌物质接触后(雷竞技网页版图4)。可溶性蛋白的含量酵母悬浮高于控制。

在两株细菌,酵母的变化是一致的反应同样浓度的抗菌物质。可溶性蛋白的含量显著减少从2 h - 6 h,这意味着抗菌物质可以抑制酵母蛋白质合成的速度。然后是可溶性蛋白质含量增加明显从6 h 10 h。随后10 h后稳定状态。在此期间,酵母细胞膜的渗透性被毁,媒体的可溶性蛋白质含量增加。与此同时总可溶性糖含量的变化被发现(图5)。可溶性糖含量增加与控制后的抗真菌物质。

结果表明,酵母细胞膜的完整性已被摧毁后接触抗菌物质,可通过扫描电子显微镜和透射电子显微镜观察(数据没有显示),所以,可溶性蛋白质和细胞内碳水化合物释放到细胞悬液。这可能是一个证据,因此铅抑制物质对酵母细胞的死亡。

sds - page

蛋白质在生命活动中起着重要的作用微生物细胞。酵母蛋白电泳的治疗有显著不同的控制。添加活性物质后,酵母的蛋白质乐队出现改变。延长治疗时间,乐队是微弱的,,有的甚至消失,如乐队A, B, C图6乐队,A, B, C,我在图7。所有的乐队图7比上一个微弱。它暗示对酵母蛋白表达活性物质有显著的影响通过破坏或抑制其合成,然后导致他们的死亡。曾,X报道相似的结果(10]。

紫外吸收光谱的DNA和Antiyeast物质之间的相互作用

为代理绑定到DNA,夹层,槽绑定和静电绑定是三个主要的绑定模式(11,12]。抑制物质的结合DNA一直通过减色性和hyperchromism特征吸收光谱(13]。当抑制物质是核酸碱基对之间插入,在吸收红移和减色性观察到最大(14]。吸收光谱表明,ALAC-3和ALAC-4吸收峰在269 nm,和吸收峰明显减少,没有任何乐队转移antiyeast物质的数量增加(数字8和9)。绑定模式不是intercalative绑定。一些研究者研究小分子与DNA之间的绑定模式使用紫外吸收光谱的DNA。一般而言,静电绑定可以中和负面指控磷酸基的DNA。因此,DNA合同和减色效应出现(15]。这表明antiyeast物质酵母DNA的绑定模式可能是静电绑定。

而且可以提高单体的吸收峰扩展的交互使用相同浓度antiyeast物质反应时间(图10和11)。吸收光谱的应用可以提供有用的信息在dna结合蛋白。吸收光谱,hyperchromism来源于损害DNA双螺旋结构,观察hyperchromism没有任何乐队在269 nm的antiyeast物质。原因可能是antiyeast物质是由槽绑定,绑定到酵母DNA和DNA的空间构象变得松散,所以hyperchromism被观察到。它表明,双螺旋结构受到antiyeast物质和酵母DNA之间的绑定。

结论

在这个研究中,antiyeast物质由乳酸菌产生的抑制机制进行了研究。结果表明,antiyeast物质对酵母菌的生长曲线的影响。酵母的对数生长期缩短,生物量下降。电导率、可溶性蛋白质含量和可溶性总糖含量酵母培养基增加治疗后通过抑制物质。它表明酵母细胞膜的完整性受损,所以电解质、可溶性蛋白质和可溶性总糖酵母细胞从岩缝。和活性物质来自ALAC-4对酵母细胞膜渗透性的影响更大。在酵母蛋白表达也受到抑制物质。一些酵母的蛋白质的表达量减少或缺乏。antiyeast物质之间的相互作用和酵母DNA通过紫外光谱技术进行了研究。紫外吸收值显著降低,减色性抗菌物质添加到酵母DNA后观察。 With the extension of treatment time, the ultraviolet absorption value was increased and hyperchromism were observed. The results showed that antiyeast substance interacted with yeast DNA through the electrostatic binding and groove binding.

确认

这项工作是财政支持的国家自然科学基金(31260390)。

引用

1. Arques杰,et al。失活的革兰氏阴性细菌在冷藏牛奶reuterin结合乳酸链球菌肽或乳过氧化物酶体系。欧元食品Res抛光工艺。2008;227:77 - 82。
2. 两和罗德里y体外抗菌活性的精油特有牛至属植物minutiflorum耐环丙沙星弯曲杆菌spp。食品化学。2007;107:602 - 606。
3. 李王,等。中国食品防腐剂的应用和发展趋势。J食品安全食品质量。2011;2:83 - 87。
4. 三力Shi,等。应用现状和未来的发展趋势在中国的食品防腐剂。食物Res Dev。2008; 29:157 - 161。
5. 勇马和丫你。产油酵母生长曲线测定的分光光度法在高浓度的文化。北方园艺。2013;8:116 - 118。
6. 刁WR, et al .化学成分、抗菌活性和精油的作用机制从茴香种子(可磨)。食品来讲。2014;35:109 - 116。
7. Lv F, et al .体外抗菌效果和选定的植物精油的作用机制组合对四个与食品相关的微生物。食物Res Int。2011; 44:3057 - 3064。
8. Shahabadi N, et al。DNA相互作用的研究铂(II)复杂,竞购(2)(NN) (NN = 4, 7-dimethyl-1 10-phenanthroline),使用不同的仪器方法。Spectrochim学报一摩尔Biomol Spectrosc。2009; 72:757 - 761。
9. 通c . et al .有毒的互动调查与小牛胸腺DNA131典型的增塑剂。J启发。2011;2133年。
10. 曾X, et al。研究消毒机制电解铝氧化水对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。J食品科学。2010;75:253 - 260。
11. Erkkila KE, et al .识别和反应的metallointercalators DNA。化学1999;牧师99:2777 - 2796。
12. 史Y, et al。DNA之间的相互作用和美国科学家研究了光谱分析和原子力显微镜。《生物高分子。2011;12:797 - 803。
13. 吴霍奇金淋巴瘤,et al .光谱研究lucigenin绑定的,bisacridiniumderivative,双螺旋。DNA肛门Bioanal化学2002;373:163 - 168。
14. 李跳频,等。合成、表征及生物活性镧(III)包含2-methylene-1复合物,10-phenanthroline单位由脂肪族二元胺架桥。学生物化学J Inorg。2006; 100:36-43。
15. Lv F, et al . 2011。体外抗菌效果和选定的植物精油的作用机制组合对四个与食品相关的微生物。食物Res国米。2011;44:3057 - 3064。