从藤茶(葡萄藤)中提取的富含二氢杨梅素的抗氧化性能gydF4y2Ba

摘要gydF4y2Ba

防止鱼油氧化变质是食品工业面临的重大挑战。天然抗氧化剂被广泛地添加到食品中，以防止氧化和延长保质期。葡萄茶(Ampelopsis grossedentata)提取物已被证明在植物油中具有抗氧化活性，但在鱼油中的功效尚不清楚。我们的研究目的是测试葡萄茶提取物(VTE)的抗氧化活性，并将其与生育酚稳定menhaden油中的其他天然抗氧化剂(迷迭香提取物- RME，绿茶提取物- GTE，葡萄籽提取物- GSE，棕榈酸抗血酸酯- AP和柠檬酸- CA)进行比较。α、γ和δ生育酚的基线水平分别为0.18mg/g、0.37mg/g和0.14mg/g。经一次氧化产物和二次氧化产物测定，VTE延缓了鲱鱼油在40°C下储存8天的氧化。VTE和RME的混合及其与AP和CA的联合使用比单独使用VTE更有效地提高了含生育酚的鳕鱼油的稳定性。结果表明，VTE是一种有效的天然抗氧化剂，特别是与RME联合使用时。gydF4y2Ba

关键字gydF4y2Ba

天然抗氧化剂，鲱鱼油，氧化，葡萄茶。gydF4y2Ba

缩写gydF4y2Ba

葡萄茶提取物(VTE);迷迭香提取物(RME);绿茶提取物;葡萄籽提取物(GSE);抗坏血酸棕榈酸酯;柠檬酸;长链-3多不饱和脂肪酸(LC n-3 PUFAs);20:5n-3 (EPA);22:6n-3 (DHA);鱼油(FO); Fatty acid methyl esters (FAMEs); Equivalent chain lengths (ECL); Menhaden oil (MO); Butylatedhydroxyanisole (BHA); Dihydromyricetin (DHM); Quercetin (QC); Mixed tocopherols (MT); Anisidine Value (AV).

简介gydF4y2Ba

长链ω -3多不饱和脂肪酸(LC n-3 PUFAs) 20:5n-3 (EPA)和22:6n-3 (DHA)与促进健康有关，包括预防心血管疾病、提高免疫力、发展脑功能、改善记忆力和视力、减少抑郁症和炎症疾病以及预防癌症[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba］．海鱼产品，包括鱼油(FO)，是EPA和DHA的主要膳食来源，自20世纪70年代末以来，人们对这些脂肪酸产生了极大的兴趣，当时它们被证明具有保护心脏的作用[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba］．研究的重点是鱼油补充剂和添加鱼油的改良食品，包括鸡蛋、乳制品、零食、婴儿配方奶粉和果汁，以生产增强健康的营养/功能性食品[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba］．然而，鱼油含有高度不饱和脂肪酸，具有4,5和6双键，这使得它们在光、氧、过渡金属或酶的存在下极易氧化。氧化会大大缩短鱼油补充剂和鱼油富集食品的保质期。营养物质也会流失，氢过氧化物分解后可能会形成有毒化合物[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

防止食品氧化变质一直是食品工业面临的重大挑战。天然抗氧化剂被广泛地加入到食品和油中，以防止氧化，提高稳定性和保质期。使用这些天然抗氧化剂是由于消费者对清洁食品标签的偏好。草药和其他香料，特别是迷迭香提取物，已成为提高稳定性和延长保质期的流行添加剂，因为它们被证明具有延缓氧化的能力[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

抗氧化剂可以根据其作用方式进行分类。初级抗氧化剂提供氢并清除烷氧基和前氧自由基，形成反应性较差(更稳定)的抗氧化自由基;这打破了传播周期。次级抗氧化剂，如金属螯合剂、单线态氧猝灭剂、氧清除剂和抗氧化再生剂，可防止挥发性和有毒化合物的形成，并将氢过氧化物转化为更稳定的自由基和非自由基产物[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

蛇葡萄属grossedentatagydF4y2Ba是一种生长在中国南部山区的野生藤蔓植物。它已被用作药物数百年，含有高浓度的黄烷醇，二氢杨梅素，也被称为蛇葡萄素[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba］．猪油和大豆油已被证明具有抗氧化活性[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba］．最近的实验表明，二氢杨梅素对骨骼肌胰岛素抵抗和内皮细胞对过氧化氢诱导的氧化应激的保护有积极作用[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

生育酚通常作为天然抗氧化剂添加到食物中[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba］．然而，与抗氧化剂的组合相比，使用单一抗氧化剂对FO的效果较差[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba］．生育酚与FO中的其他抗氧化剂一起加入时，可具有协同抗氧化性能[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba］．由于生育酚具有良好的协同抗氧化性能，当初级抗氧化剂和二级抗氧化剂与生育酚配制时，观察到鱼油的抗氧化效果更好[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

本研究的目的是研究蔓茶提取物在鲱鱼油中的活性，并与其他天然抗氧化剂的活性进行比较，以开发控制鲱鱼油氧化的最佳配方。具体目标是:1)通过提取和高效液相色谱法测定鲱鱼油中基线生育酚的组成和含量，2)测定单独添加到混合生育酚的鲱鱼油中的天然化合物(绿茶、葡萄籽、葡萄树茶、迷迭香提取物、棕榈酸抗坏血酸和柠檬酸)的抗氧化活性，3)评价混合生育酚的鲱鱼油和混合葡萄树茶和迷迭香提取物的氧化稳定性，4)评价含有混合生育酚和棕榈酸抗坏血酸、柠檬酸、藤茶和迷迭香提取物混合物的menhaden油的氧化稳定性。在40°C储存8天后，通过测量一次氧化产物和二次氧化产物来确定氧化程度。gydF4y2Ba

材料与方法gydF4y2Ba

脂肪酸分析gydF4y2Ba

HPLC级异辛烷和甲苯购自Fisher Scientific (St. Louis, MO)。bf3 -甲醇(12%)购自Supelco (Bellefonte, PA)。三氯胂酸甲酯从Crescent化学公司(Islandia, NY)获得。氢氧化钠和氯化钠是从费舍尔科学公司购买的。Menhaden油(OmegaPuregydF4y2Ba^®gydF4y2Ba)，含有天然混合生育酚(Covi-oxgydF4y2Ba^®gydF4y2BaT-50)是由Omega Protein (Reedville, VA)捐赠的。gydF4y2Ba

采用AOCS官方方法Ce 1b-89测定鲱鱼油的脂肪酸组成[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba］．采用Zebron ZB-WAX加毛细管柱(60 m x 0.25 mm i.d, 0.25 μm膜厚，Phenomenex, Torrance CA)，以1:77的分离比，人工将样品(1 μl)注入Shimadzu QP5050 GCMS(日本京都)。采用超纯氦作为载气，线性流速为30 cm/sec(柱流量为1.3ml/min)。烤箱温度程序从135°C开始，以1°C/min的速度增加到235°C，并在235°C保持20分钟。总运行时间为120分钟。注入器温度为250℃，GCMS接口温度为230℃。脂肪酸甲酯(FAMEs)通过MS片段化模式和Wiley 2002文库进行鉴定，并通过计算Ackman描述的等效链长(ECL)和ECL数据与公布值进行比较来确认鉴定[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24gydF4y2Ba］．EPA和DHA的含量以每克鲱鱼油的毫克计算。还计算了FAMEs的面积百分比。实验是重复进行的。gydF4y2Ba

Menhaden油(Mo)基线生育酚分析gydF4y2Ba

含有Covi-ox天然混合生育酚的MOgydF4y2Ba^®gydF4y2BaT-50是由Omega Protein (Reedville, VA)捐赠的。HPLC级正己烷和异丙醇来自Fisher Scientific。聚山梨酯20 (Tween 20)、丁基羟基茴香醚(BHA)、dl- α-生育酚、dl-γ-生育酚、dl-δ-生育酚和无水硫酸镁从Sigma Aldrich (St. Louis, MO)获得。加入丁基羟基茴香醚(BHA, 50ppm, Fisher Scientific)，溶解于正己烷中，制备正己烷/BHA溶液。gydF4y2Ba

采用正相高效液相色谱法测定MO中的α-， γ-和δ-生育酚含量，该法最初用于人造黄油和减脂产品中的维生素E [gydF4y2Ba25gydF4y2Ba，gydF4y2Ba26gydF4y2Ba］．使用外部标准程序(0-0.1 mg/ml曲线)对三种生育酚进行定量。在含有正己烷和BHA (0.05 mg/ml)的25 ml容量瓶中制备生育酚标准溶液。gydF4y2Ba

提取的样品和标准溶液用于测定MO中的生育酚含量。使用安捷伦1200无限系列高效液相色谱法(安捷伦科技，里士满，弗吉尼亚州)，二极管阵列和荧光检测器串联。环境温度下使用machery - nagel二氧化硅(25 cm x 0.46 cm i.d)正相柱。自动采样器保持在4°C并避光。流动相为正己烷和异丙醇(99.1:0.9 v/v)，流速为1.0ml/ min，进样量为20 μl，荧光计激发波长为290 nm，发射波长为330 nm。总运行时间为20分钟。保留时间和紫外吸收光谱用于识别样品中的α、γ和δ生育酚含量。gydF4y2Ba

将MO (5.0 g)称入125 Erlenmeyer烧瓶中，加入40 ml己烷/BHA溶液溶解MO。在烧瓶外包裹铝箔，以避免提取过程中暴露在光线下。用正己烷和BHA溶液冲洗烧瓶内的剩余油渣。在烧瓶中加入吐温20(3滴)和无水硫酸镁(3克)，用氮气冲洗并盖紧。将油溶液充分混合，放入冰箱3°C冷藏2小时。两小时后，溶液通过whatmanno过滤。将一张滤纸放入100ml的容量瓶中。用10ml的己烷/BHA溶液冲洗烧瓶中剩余的残留溶液，并将100ml的容量瓶带入体积。摘录一式两份。gydF4y2Ba

抗氧化剂提取及分析gydF4y2Ba

三份复制葡萄茶样本来自中国张家界的零售茶叶商店。二氢霉菌素(DHM)购自ChromaDex公司(Irvine, CA)。日本绿茶(Bancha)和葡萄籽提取物(Nature’s Plus Herbal, Melville, NY)从当地天然食品店购买。乙醇(95.5% aq)从Ricca化学公司(Arlington, TX)获得。醋酸、乙腈和甲醇由Fisher Scientific提供。没食子酸和2 N Folin-Ciocalteau试剂由Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)获得。gydF4y2Ba

天然抗氧化剂:制备gydF4y2Ba

抗坏血酸棕榈酸酯是从Spectrum Chemical公司(Gardena, CA)获得的。槲皮素脱水(97%)购自Alfa Aesar (Heysham, England)。柠檬酸，无水，从阿彻丹尼尔斯米德兰公司(迪凯特，IL)获得。迷迭香提取物油(Herbalox调味料，Type HT-25, NS)从Kalsec (Kalamazoo, MI)获得。以葡萄茶为原料制备葡萄茶提取物。混合生育酚标准品来自Sigma Aldrich。淀粉指示剂(1%)由Ricca化学公司(Arlington, TX)提供。乙酸、氯仿、HPLC级异辛烷、0.1 N硫代硫酸钠和对茴香胺购自Sigma Aldrich(圣路易斯，密苏里州)。活性炭购自Bio-Rad实验室(Richmond, CA)。gydF4y2Ba

制备葡萄茶提取物、绿茶提取物和葡萄籽提取物，研究天然抗氧化剂对鲱鱼油脂质氧化的抑制作用。使用福林-苯酚法和Spanos等人描述的没食子酸标准溶液评估每个粗提物样品的总酚值，[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba］．葡萄茶提取物样品的酚含量与商业二氢杨梅素(DHM)进行了比较。采用高效液相色谱法测定葡萄茶提取物样品中DHM含量[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba］．葡萄和绿茶提取物的提取和冻干遵循Ye等人描述的方法，[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba］．使用Gokogluet等人描述的提取程序对商业葡萄籽提取物进行纯化，[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

葡萄茶(10克)使用200毫升74% (v/v)乙醇水溶液，在65°C以100 rpm的速度在水浴中摇晃30分钟(360轨道摇床，精密科学，芝加哥，伊利诺伊州)。用胃袋将提取物过滤到1000毫升的圆底烧瓶中。为了蒸发提取物中的乙醇，在60°C下操作Buchi Rotavapor R-3000 (Buchi Laboratory Equipment, Flawil, Switzerland)，直到瓶中剩下少量乙醇。将圆底烧瓶中的提取物转移到结晶盘(70mm x 50mm)中，向圆底烧瓶中加入50 ml蒸馏水，冲洗剩余的提取物。这与结晶盘中的第一个提取物相结合。结晶盘中的萃取物用保底膜覆盖以防止污染，萃取物在- 50°C完全冷冻，然后在Labconco Freezone18冷冻干燥机(Labconco, Kansas City, MO)中以- 50°C冷冻干燥约72小时，在结晶盘顶部铺上粗棉布。冷冻干燥的提取物在分析天平上称重，并保存在- 50°C。制备了三份葡萄茶提取物。按照藤茶的提取程序，用200毫升70%的乙醇水提取日本板茶绿茶(10克)[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

将商业葡萄籽提取物(10克)完全溶解在200毫升20% (v/v)的乙醇水溶液中，在精密科学360轨道摇床(Precision Scientific Inc.， Chicago, IL)中，在40°C, 160 rpm的温度下摇晃4小时。这些摘录是通过whatmanno过滤的。4张纸转移到1000毫升圆底烧瓶中。过滤后的葡萄籽提取物在60°C下浓缩，直到使用Buchi Rotavapor R-3000 (Buchi Laboratory Equipment, Flawil, Switzerland)除去大部分乙醇。将浓缩的提取物转移到结晶盘中(70毫米x 50毫米)，加入50毫升蒸馏水，在圆底烧瓶中清洗残留的提取物。结晶盘中的提取物在-50°C冷冻，然后在-50°C冷冻干燥72小时，用粗棉布覆盖在Labconco Freezone 18冷冻干燥机(Labconco，堪萨斯城，密苏里州)。用分析天平称干燥的提取物，并在-50°C冷冻直到使用。葡萄籽提取物分为三份。gydF4y2Ba

高效液相色谱法测定葡萄茶提取物中DHM含量gydF4y2Ba

葡萄茶提取物中的DHM使用安捷伦1260无限系列HPLC(安捷伦科技，里士满，弗吉尼亚州)定量。采用Agilent Porshell 120 EC-C18色谱柱，粒度为2.7 μm (5 cm × 0.46 cm)。流动相为溶剂(A) 90%蒸馏水，含0.1% v/v乙酸;溶剂(B) 10% v/v乙腈，含0.1%乙酸(v/v)。流速为0.5 mL/min;注射量为5.0 μL。检测波长为290 nm，吸光度为190 ~ 400 nm。流动相梯度在0-4分钟内以90% A和10% B运行，在4-8分钟内线性增加到70% A和30% B，运行时间为8分钟。随后运行初始溶剂条件10分钟以使色谱柱再生。在甲醇(1 mg/ml)中制备三个重复的提取样品，并注射到HPLC中。通过与标准品的保留时间和紫外吸收光谱比较，确定了DHM峰。 The DHM content in the extract was determined by using an external standard procedure (0-1 mg/ml DHM in methanol).

总酚含量gydF4y2Ba

以没食子酸(0 ~ 0.5 mg/ml)为酚标，采用福林- ciocalteu试剂测定葡萄茶提取物、绿茶提取物、葡萄籽提取物和DHM中的总酚含量[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba］．反应混合物中各含有100 μL萃取液(0.5 mg/ml)或没食子酸标准溶液、900 μL蒸馏水和2.5 ml 0.2 N福林-乔卡托试剂，并在Fisher Vortex Genie2混合器上混合(Fisher Scientific, Pittsburgh, PA)。在每个试管中加入饱和碳酸钠(2毫升)，在漩涡上混合。在室温下静置两小时后，使用岛津UV-2550 UV-VIS分光光度计(岛津科学仪器公司，哥伦比亚，MD)在765 nm处测量吸光度。每种提取物的估计总酚值记录为每克提取物的没食子酸当量毫克。实验一式三份。gydF4y2Ba

鲱鱼油的天然抗氧化活性gydF4y2Ba

每种抗氧化处理以三种不同浓度制备MO样品，重复三次。我们首先关注于评估每种抗氧化剂在MO样品中的功效，因为一些抗氧化剂在高浓度时会起到过氧化物的作用。制备27个处理样品，一式三份，保存在螺旋盖玻璃瓶中，置于培养箱(Blue M, Blue Island, IL)中，温度为40℃，保存8天。分别于第0、2、4、6、8天从培养箱中随机抽取各处理的3个重复样品，评估过氧化值、顶空氧含量(一次氧化产物)和二次氧化产物的茴香胺值。gydF4y2Ba

Menhaden油(MO)的单一抗氧化活性gydF4y2Ba

在10ml teflon内衬的螺旋盖试管中分别制备了三种不同浓度的棕榈酸ascobyl (AP) (200ppm AP, 500ppm AP, 1000ppm AP)和柠檬酸(50ppm CA, 100ppm CA和150ppm CA)。用甲醇帮助溶解不同浓度的AP和CA抗氧化处理。用氮气流去除甲醇后，向用氮气冲洗并盖紧的试管中加入MO (3 g)。采用涡流搅拌1分钟分散MO中的AP和CA。然后将每个含有不同浓度AP或CA的试管置于Fisher FS20超声浴(Fisher Scientific, Pittsburgh, PA)中3分钟，以协助AP和CA的分散。这些漩涡和超声过程重复三次，直到AP或CA完全分散。将试管中的AP或CA与MO的混合物转移到250 ml Erlenmeyer烧瓶中，添加额外量的MO，制备200 ppm AP, 500 ppm AP, 1000 ppm AP, 50 ppm CA, 100 ppm CA和150 ppm CA的MO样品。gydF4y2Ba

将MO (3g)添加到每种抗氧化处理的试管中，并用氮气冲洗。每个提取物和QC处理与MO在试管中旋涡混合1分钟，置于超声浴中3分钟。涡和声波降解法浴的过程反复进行,直到提取和QC混合与莫莫。提取和QC在试管被转移到250毫升厄伦美厄烧瓶,和额外的莫准备200 ppm QC,添加了500 ppm QC, 1000 ppm QC, 500 ppm GTE, 1000 ppm GTE, 2000 ppm GTE, 200 ppm GSE, 500 ppm GSE, 1000 ppm GSE, 200 ppm静脉血栓栓塞,500 ppm静脉血栓栓塞,1000 ppm每个瓶静脉血栓栓塞。烧瓶用氮气冲洗并盖紧。gydF4y2Ba

由于混合生育酚(MT)和迷迭香提取物(RME)在MO中的溶解度良好，在Erlenmeyer烧瓶中直接加入不同浓度的混合生育酚(MT)和迷迭香提取物(RME)，制备200 ppm MT、500 ppm MT、1000 ppm MT、500 ppm RME、1000 ppm RME和2000 ppm RME的MO样品。采用MT和RME对MO样品进行氮气冲洗。gydF4y2Ba

每个含有不同抗氧化剂处理的MO的烧瓶被放置在超声波浴中5分钟，然后在搅拌板上搅拌10分钟。每个样品6g转移到玻璃小瓶中，一式三份，盖紧盖子，随机分布在40°C无光照的培养箱中，最多保存8天。gydF4y2Ba

蔓茶提取物(VTE)和迷迭香提取物(RME)与鲱鱼油(MO)混合物的制备gydF4y2Ba

在单项抗氧化活性评价中，与其他抗氧化剂和对照相比，200 ppm、500 ppm和1000 ppm VTE对鱼虾油的脂质氧化表现出较好的抗氧化抑制活性。为了研究联合效应，在MO中，1000 ppm或2000 ppm RME与200 ppm VTE或500 ppm VTE联合使用。准备了9个处理:不含任何抗氧化剂的对照、200 ppm VTE、500 ppm VTE、1000 ppm RME、200 ppm或500 ppm VTE和1000 ppm RME的混合物，以及200 ppm或500 ppm VTE和2000 ppm RME的混合物。每个样品(6 g)装入玻璃瓶并盖紧;9个处理设为3个重复。随机分配，在40°C的黑暗培养箱中保存8天。gydF4y2Ba

棕榈酸抗坏血酸酯(AP)和柠檬酸(CA)、迷迭香提取物(RME)和藤蔓茶提取物(VTE)在鲑鱼油(MO)中的混合物的制备gydF4y2Ba

所有样品均含有AP (200ppm)和CA (100ppm)。制备了两级RME(1000或2000 ppm)和两级VTE (500 ppm或1000 ppm)的MO样品。所有MO样品(6克)转移到玻璃小瓶并盖紧。将3个重复的样品随机分布在40°C的黑暗培养箱中，最多保存8天。gydF4y2Ba

过氧化值测定gydF4y2Ba

过氧化值由美国石油化学家学会程序测定[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

头部空间氧含量gydF4y2Ba

使用OxySense 4000B (OxySense, Dallas, TX)评估MO样品的顶空氧含量。荧光O2xyDotsgydF4y2Ba^®gydF4y2Ba通过使用硅基半透明粘合剂(RTV 108, Momentive Performance Materials, Albany, NY)连接到玻璃瓶内部。OxySense 4000B通过使用含1%亚硫酸钠的0%氧气标准和含1毫升蒸馏水的21%氧气标准进行校准。每种处理的样品(5克)被添加到已经有荧光O2xyDots的小瓶中gydF4y2Ba^®gydF4y2Ba在里面的墙上。管子被紧紧地盖住，并分布在培养箱中，在40°C下储存8天。每隔两天(0、2、4、6、8天)从培养箱中取出样品，以测量顶空氧含量。每个处理的顶空氧数据直接记录在仪器的excel工作表中。gydF4y2Ba

茴香胺值(AV)测定gydF4y2Ba

AV主要测量醛类，尤其是不饱和醛类。对茴香胺在使用前按以下步骤进行再结晶。将对茴香胺(20克)溶解在500毫升蒸馏水(75°C)中，放入装有搅拌棒、亚硫酸钠(1克)和活性炭(10克)的1L烧杯中，搅拌5分钟。解决方案是通过什么人过滤出来的。一张滤纸，两次。过滤后的溶液放入4°C的冰箱中保存过夜。白色结晶的对茴香胺用真空过滤过滤，用10ml冷蒸馏水洗涤。结晶后的对茴香胺完全干燥后，转移到玻璃瓶中，在4°C的冰箱中避光保存[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

每个0.5 - 0.8 g MO样品在50 ml离心管中称量。加入异辛烷(25 ml)溶解和稀释每个MO样品。用异辛烷试剂调零分光光度计。使用岛津UV-2550 UV-VIS分光光度计(岛津科学仪器公司，哥伦比亚，MD)在350 nm处测量每个MO样品(Ab)的吸光度。用醋酸配制对茴香胺溶液(2.5 g/L) 1 ml，加入样品(5ml)和异辛烷[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba］．管子被盖紧并旋转。室温静置10 min后，以异辛烷空白和对茴香胺混合物为参照物，在350nm处测定吸光度(As)。各样品的p-茴香胺值由公式确定:p-AV = 25 * (1.2 As - Ab)/m，其中As为反应溶液的吸光度，Ab为稀释的鲱鱼油样品的吸光度，m为鲱鱼油样品的重量(g) [gydF4y2Ba29gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

对0、2、4、6、8 d样品总酚含量(mg GAE/g)、过氧化值(meq/kg)、顶空氧含量(%)和茴香胺值进行单因素方差分析。在JMP (Version 9.0.0, 2010 JMP, Cary, NC)中，提取样品中总酚含量的平均值之间采用Tukey 's检验，差异显著(p<0.05);在SAS (Version 9.1.3, 2003, SAS, Cary, NC)中，过氧化值、顶空氧含量和茴胺值之间采用Tukey 's检验，差异显著(p<0.05)。顶空含氧量实验为重复测量实验，并按重复测量进行分析。gydF4y2Ba

结果与讨论gydF4y2Ba

脂肪酸分析gydF4y2Ba

用内标三羧酸甲酯(C23:0)测定MO中脂肪酸的浓度，面积%。峰值大于1%的区域分别为14:0、16:0、16:1n-7、18:0、18:n1-9、18:2n-6、18:3n-3、20:4n-6、20:5n-3、22:6n-3。Moffat等报道了海洋油中含有8种主要脂肪酸:十四酸(14:0，肉豆松酸)、十六酸(16:0，棕榈酸)、顺-9-十六烯酸(16:1n-7，棕榈油酸)、顺-9-十八烯酸(18:1n-9，油酸)、顺-9-二十碳七烯酸(20:1n-11)、顺-5,8,11,14,17-二十碳五烯酸(20:5n- 3, EPA)和顺-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸(22:6n-3, DHA) [gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba］．基于内部标准的脂肪酸重量百分比显示出与OmegaPure相似的脂肪酸分布gydF4y2Ba^®gydF4y2BaE参考数据和Moffat等，[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba］．在大多数鱼油中，EPA的含量通常高于DHA，但鲭鱼油例外，其DHA含量高于EPA [gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba31gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

海鱼脂肪酸中EPA和DHA的典型总重量百分比约为12%和34%，这取决于鱼的种类、季节、性别和地理位置[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba］．EPA和DHA的含量分别为73.4mg/g和66.8mg/g。EPA+DHA(%)的面积百分比为24.6%，在OmegaPure的范围内(23-27%)gydF4y2Ba^®gydF4y2BaE参考数据以及Moffatet等，[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba］．EPA和DHA是重要的pufa，可预防心血管疾病和其他健康问题[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

葡萄茶提取物的提取与分析gydF4y2Ba

通过提取和冷冻干燥程序(n=3)得到葡萄茶提取物(3.78 g)、绿茶提取物(3.24 g)和葡萄籽提取物(4.20 g)。葡萄茶中DHM含量为26.2% w/w(干基)。腾茶提取物中DHM的w/w含量为69.3%(平均n=3)。这与Ye等报道的DHM含量(64.7% w/w, mean n=3)相似，[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

天然抗氧化剂的总酚含量(TPC)gydF4y2Ba

由于总酚含量有助于整体抗氧化能力，因此使用福林酚法测定每种提取物的总酚含量[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba］．酚类物质含量均值(n=3)为:葡萄茶提取物(310 mg GAE/g)、商品DHM (370 mg GAE/g)、绿茶提取物(180 mg GAE/g)和葡萄籽提取物(380 mg GAE/g)。葡萄籽提取物的TPC最高。经Tukey 's检验，各样品TPC差异有统计学意义(p<0.05)。gydF4y2Ba

葡萄籽、葡萄皮和葡萄果肉含有不同的多酚成分，这取决于提取方法和使用的溶剂。使用乙醇作为萃取溶剂可导致较高的TPC [gydF4y2Ba33gydF4y2Ba］．二氢杨梅素(DHM)是葡萄茶中的主要生物活性化合物，据报道具有良好的抗氧化能力[gydF4y2Ba34gydF4y2Ba］．Ye等人报道的总酚含量(324 mg GAE/g)与我们的发现(310 mg GAE/g)一致[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

绿茶提取物的总酚含量最低，为180 mg /g。绿茶提取物的酚浓度高于Khojhar等人得出的65.8-106.2 mg GAE/ g范围，[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba］．他们指出，这取决于提取/分馏方法和生长区域。gydF4y2Ba

鲱鱼油中维生素E的基线分析gydF4y2Ba

Ye等人的正烷萃取和直接高效液相色谱分析是一种简单有效的测定鲱鱼油中生育酚含量的方法，因为该方法避免了皂化过程，皂化过程往往导致回收率低[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba］．来自OmegaPure的鲱鱼油gydF4y2Ba^®gydF4y2Ba含有Covi-oxgydF4y2Ba^®gydF4y2BaT-50，是从食用植物油中提取的天然混合生育酚。在科宁公司提供的鲱鱼油中加入约1000ppm的混合生育酚，以防止在加工、处理和保质期期间氧化[gydF4y2Ba36gydF4y2Ba］．大豆油中的典型混合生育酚由14%的α-生育酚，2%的ß-生育酚，60%的γ-生育酚和24%的δ-生育酚组成，来自Covi-oxgydF4y2Ba^®gydF4y2BaT-50参考资料[gydF4y2Ba36gydF4y2Ba］．使用外部标准程序，在重复样品中发现α -生育酚、γ -生育酚和δ -生育酚的平均含量分别为0.18 mg/g、0.37 mg/g和0.14 mg/g。用于生育酚分析的直接提取和高效液相色谱分析简单而快速，但确实需要使用荧光计[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba］．与紫外检测相比，荧光检测用于生育酚分析具有更高的灵敏度和特异性[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

单一抗氧化剂对鲱鱼油氧化头隙氧含量的抗氧化活性gydF4y2Ba

通过测量顶空氧含量来评估顶空氧损失。MO样品的氧含量随着样品中的氧化作用从顶空去除而降低。分别于第0天、第2天、第4天、第6天和第8天测定各MO样品的顶空氧含量。在第0天，样品的顶空氧含量为~ 20%。对照，AP (200,500,1000ppm)， CA (50,100,150ppm)， GSE (200,500,1000ppm)， GTE (500,1000,2000ppm)， MT (200,500,1000ppm)， QC (200,500,1000ppm)和RME(500和1000ppm)在40°C储存8天后急剧下降。虽然200 ppm、500 ppm和1000 ppm的GSE和VTE, 500、1000、2000 ppm的GTE和RME在40℃保存4天的氧含量在16.3% ~ 18.1%之间，200 ppm、500 ppm和1000 ppm的VTE和2000 ppm的RME分别为17.4%、16.7%、16.8%和15.9%，但其他处理在40℃保存6天后的氧含量均低于11%。在40℃贮藏8天后，200 ppm、500 ppm、1000 ppm VTE和2000 ppm RME的MO样品氧含量分别为11.8%、13.2%、14.4%和10.4%，氧含量高于其他处理。1000 ppm VTE样品的氧含量最高，其次是500 ppm VTE, 200 ppm VTE和2000 ppm RME。VTE处理抑制了MO中一次氧产物的生成和顶空氧的损失，这些结果与DHM和200 ppm VTE对大豆油在60°储存15天氧化的抗氧化抑制作用一致[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

茴香值(AV)gydF4y2Ba

对MO样品的醛水平进行了非挥发性二次氧化产物的评估。AP浓度为200ppm、500ppm和1000ppm, QC浓度为200ppm、500ppm和1000ppm的样品的AV值高于对照。在200ppm、500ppm和1000ppm AP和200ppm、500ppm和1000ppm QC样品中，顶空氧含量较低。这表明它们不能有效抑制初级氧化产物，可能在MO中起促氧化剂的作用[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba］．VTE、GSE、GTE和MT在第8天的AV均低于对照组。对脂质系统中抗氧化剂的有效性进行一次和二次氧化产物的测量是很重要的[gydF4y2Ba37gydF4y2Ba］．在某些情况下，AV测量的二次氧化产物可能较低，而一次氧化产物增加。例如，在生育酚的存在下，过氧化值可能很高，因为生育酚将氢提供给过氧自由基，形成稳定的过氧化物，而在生育酚的过程中，可能以较低的速率形成二次氧化产物[gydF4y2Ba37gydF4y2Ba］．从一次氧化产物和二次氧化产物的测量结果来看，在40°C储存8天，200 ppm、500 ppm和1000 ppm VTE显著提高了氧化稳定性，并延迟了MO的氧化，因为VTE处理比对照和其他抗氧化处理具有更高的氧含量和更低的AV。gydF4y2Ba

混合抗氧化剂对鲱鱼油过氧化值氧化的抗氧化活性gydF4y2Ba

含VTE的处理在40°C贮藏8天内抑制MO的氧化降解(gydF4y2Ba表1gydF4y2Ba)．VTE和RME混合的结果比VTE或RME单独的过氧化值低得多。在8天内，对照和1000 ppm RME的过氧化值急剧增加，超过35 meq/kg，而500 ppm VTE和2000 ppm RME处理样品的组合(10.7 meq/kg)在40°C储存8天内的所有样品中过氧化值最低。200 ppm VTE和2000 ppm RME对初级氧化产物形成的保护效果略差。添加相同浓度RME的200 ppm和500 ppm VTE样品的过氧化值差异不显著，但添加不同浓度RME (1000 ppm或2000 ppm) VTE和RME样品的混合样品的一次氧化产物形成率差异显著(p<0.05)。由此可见，RME与VTE联合使用可能会提供加性抗氧化抑制作用，更有效地协助延缓MO的氧化降解。gydF4y2Ba

表1:gydF4y2Ba在40°C下储存0-8天的鲱鱼油中VTE和RME混合物的过氧化值(meq/kg)。各测试日的过氧化值(meq/kg)以均值±标准差表示，不同上标字母表示Tukey的均值分离(p<0.05)差异显著。gydF4y2Ba

头部空间氧含量gydF4y2Ba

以顶空氧含量(gydF4y2Ba表2gydF4y2Ba)测试结果与过氧化值(gydF4y2Ba表1gydF4y2Ba)．40℃贮藏8 d，顶空氧含量差异显著(p<0.05) (gydF4y2Ba表2gydF4y2Ba)．500ppm VTE和2000ppm RME的混合物(14.5%)含氧量最高，其次是500ppm VTE和1000ppm RME的混合物(14.2%)。含VTE处理的氧含量远高于对照组或单独RME。联合VTE和RME在MO样本中观察到的氧水平高于单独VTE。RME有助于抗氧化，因为添加RME增加了VTE的有效性。gydF4y2Ba

表2:gydF4y2Ba在40°C下储存0-8天的鲱鱼油中VTE和RME混合物的顶空氧含量(%)各测试日顶空氧含量(%)以均数±标准差表示，不同上标字母表示Tukey的平均分离(p<0.05)差异显著。gydF4y2Ba

茴香值(AV)gydF4y2Ba

用对茴香胺法测定了引起变质食品风味和气味的醛类等二次氧化产物。样品的AVs与过氧化值和顶空氧含量评估一致。500 ppm VTE和2000 ppm RME的混合物在40°C储存8天时产生的AV最低(11.2)。500ppm VTE和RME (1000ppm或2000ppm)联合使用明显优于单独VTE。1000和2000 ppm的RME样品在混合物配方中提高了稳定性。然而，单独施用1000 ppm RME的AV(24.6)高于对照(21.2)。一旦在MO中稳定的RME开始降解，氧化降解的速度就会增加，因为RME的有效性丧失了。AV的结果与过氧化值和顶空氧含量一致，因为在MO中最有效的抗氧化剂配方是500 ppm VTE和2000 ppm RME的混合物，其中AV最低(11.2)(gydF4y2Ba表3gydF4y2Ba)，过氧化值最低(10.7 meq/kg)，顶空氧含量最高(14.5%)。gydF4y2Ba

表3:gydF4y2Ba在40°C下储存0-8天的鲱鱼油中VTE和RME混合物的茴香胺值各测试日茴茴胺值以均数±标准差表示，不同上标字母表示Tukey平均分离有显著性差异(p<0.05)。gydF4y2Ba

抗坏血酸棕榈酸酯(AP)和柠檬酸(CA)与葡萄茶(VTE)和迷迭香提取物(RME)的混合物gydF4y2Ba

过氧化值gydF4y2Ba

在40°C贮藏的第0天、第2天、第4天、第6天和第8天测定各处理和对照的过氧化值(gydF4y2Ba表4gydF4y2Ba)．对照(35 meq/kg)和200 ppm AP + 100 ppm CA (35.3 meq/kg)的过氧化值在样品中最高。与之前的过氧化值结果一样，含有VTE的治疗具有最低的过氧化值。200 ppm AP + 100 ppm CA + 2000 ppm RME和1000 ppm或500 ppm的混合物有VTE抑制初级氧化产物的形成。gydF4y2Ba

表4:gydF4y2BaAP、CA、VTE和RME混合物在40°C下储存0-8天的过氧化值(meq/kg)各测试日的过氧化值(meq/kg)以均值±标准差表示，不同上标字母表示Tukey的均值分离(p<0.05)差异显著。gydF4y2Ba

头部空间氧gydF4y2Ba

在40°C下，分别测定样品在贮藏0天、2天、4天、6天和8天的氧含量(gydF4y2Ba表5gydF4y2Ba)．样品氧值较低的原因是氧化，氢过氧化物的发展，更多的氧被油样品吸收。对照和200 ppm AP+ 100 ppm CA处理MO的氧含量显著降低，而200 ppm AP+ 100 ppm CA + 2000 ppm RME+ 1000 ppm VTE或500 ppm VTE的混合物在40°C储存8天后氧含量最高。顶空氧含量评价与过氧化值测定结果相似。含1000ppm VTE的处理能有效抑制初级氧化产物的形成。AP+CA+RME比单独VTE更有效地降低MO的延迟氧化。gydF4y2Ba

表5:gydF4y2BaAP、CA、VTE和RME混合物在40℃下储存0-8天的鲱鱼油顶空氧含量(%)各测试日头部空间氧含量(%)以均数±标准差表示，不同上标字母表示差异显著(p<0.05)。gydF4y2Ba

茴香胺值可用于指示氢过氧化物分解后产生不良气味的二次氧化产物[gydF4y2Ba38gydF4y2Ba］．对照和200 ppm AP + 100 ppm CA的AV值稳定上升，在40°C储存8天后，样品的茴香胺值最高。然而，在40°C下，200 ppm AP+ 100 ppm CA + 2000 ppm RME + 1000ppm VTE或500 ppm VTE的混合物在8天内的AV明显低于对照和200 ppm AP+ 100 ppm CA。200ppm AP, 100ppm CA, VTE(500和1000ppm)和RME (1000ppm和2000ppm)的组合抑制氧化，并提高了含有混合生育酚的MO在40°C储存8天的稳定性(gydF4y2Ba表6gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

表6:gydF4y2BaAP、CA、VTE和RME混合物在40℃下储存0-8天的茴香值各测试日茴胺含量以均数±标准差表示，不同上标字母表示差异显著(p<0.05)。gydF4y2Ba

混合生育酚(γ-或δ生育酚和低浓度α-生育酚)、AP、RME和CA的混合物有效地提高了富含PUFAs的散装鱼油在室温下的稳定性[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba］．由于AP有助于生育酚的再生，添加AP可提高鱼油的稳定性[gydF4y2Ba39gydF4y2Ba，gydF4y2Ba40gydF4y2Ba］．AP可防止α-生育酚在储存过程中的降解[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba］．然而，如果鱼油中含有过渡金属，则抗坏血酸或AP可转变为促氧化剂[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba］．添加CA作为金属螯合剂有助于增加含有生育酚、RME和AP的鱼油配方的稳定性，通过减少初级氧化产物，与RME、α-生育酚和AP混合的葵花籽油也延缓了氧化变质[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21gydF4y2Ba］．虽然AP和CA可能有助于延缓MO混合配方的氧化降解，但在我们的研究中，AP和CA的加入并没有提高MO配方的稳定性。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

与对照相比，200 ppm、500 ppm和1000 ppm葡萄茶提取物(VTE)处理在40°C储存8天有效地延缓了MO的氧化。VTE和RME组合更有效地提高了含有混合生育酚的MO在40℃储存8天的稳定性。在40°C贮藏期间，500 ppm VTE和2000 ppm RME的混合对MO的脂质氧化最有效。通过过氧化值、顶空氧和茴香胺值测定，RME在混合配方中具有添加性抗氧化作用，因为VTE和RME的组合比VTE本身更能抑制氧化。结果表明，VTE是一种有效的天然抗氧化剂，特别是与RME和生育酚联合使用。gydF4y2Ba

确认gydF4y2Ba

这项工作的资金由弗吉尼亚州里德维尔的欧米茄蛋白质公司、弗吉尼亚州农业实验站和美国农业部国家食品和农业研究所的孵化计划提供。gydF4y2Ba

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