Croton megalobotrys Anti-plasmodial和自由基清除活性

文摘

根、茎和叶巴豆megalobotrys提取和测试anti-plasmodial活动。在体内筛选试验对p .鼠(ANKA)感染NMRI白化病老鼠,统计上显著的抑制效应产生的干树皮提取物(74.5%;p < 0.05)在早期感染和86.9%的剩余的抑制作用。在一个既定的感染,平均存活时间(MST)达到了16.2天虽然parasitaemia并未完全消除。令人印象深刻的观察anti-plasmodial活动在体外测试IC50值为1.74±票价µg /毫升和3.78±1.03µg /毫升己烷分数的干树皮提取物分别对D6和W2的恶性疟原虫。干树皮提取物的氯仿分数产生了肉桂酸衍生物(E) -tetratriacontyl - 3 - (4-hydroxy-3-methoxyphenyl) 2-propenate,而氯仿的第四semi-purified分数分数(AA-CC4)定性DPPH实验显示活动的负荷剂量0.05µg,从而展示彻底清除类似的活动抗坏血酸。

关键字

巴豆megalobotrys;茎皮中提取;获得分离,抗疟;Anti-plasmodial;DPPH自由基清除。

介绍

药用植物用于治疗各种疾病。她们是现代医学的来源和解决发展中国家的主要来源。即使一些知识的传统使用的植物在非洲失去了由于缺乏文档(1),由当地人口继续积极实验法对药用植物(2]。新出现的疾病等艾滋病毒/艾滋病和疟疾等别人的复兴和发展的阻力都鼓励使用药用植物。科研有时进行支持或反驳的药用价值的植物用于传统医学。一些药用植物博茨瓦纳已经评估了他们的抗菌3,4,抗疟5,6和自由基清除7)活动。他们中的大多数,从药用植物收集供应商,已被证明包含有用的化合物与已知的生物活性(8]。

在目前工作的叶子,茎和根中提取的c . megalobotrys(大戟科)评估抗疟活性在活的有机体内对p .鼠在老鼠身上。粗糙的干树皮提取物(AA-CCR),超过70%的寄生虫产生抑制,液液萃取被分割的正己烷(AA-CHE)、氯仿(AA-CCE)、正丁醇(AA-CBE)和残余水(AA-CWE)分数。这些分数,粗提取液,和六个semi-purified分数(AA-CC1 AA-CC6)从氯仿部分进行评估在体外对两株恶性疟原虫。本质是确定提取的效果chloroquine-sensitive和氯喹耐药性菌株的方法恶性疟原虫以及部分可能包含的抗疟活性。自由基清除活性的提取物也被确定。

材料和方法

植物材料

巴豆megalobotrys、树叶和树根(优惠券代码:A2003/3)收集来自博茨瓦纳Ngami地区必须在2003年7月。茎皮(优惠券代码:A2003/4)收集从Mapoka,东北区,博茨瓦纳2003年6月。他们验证标本的生物科学系,博茨瓦纳大学。

通用方法

1 d [¹H (300 MHz),¹³C(75.4兆赫),部门)和2 d(舒适、HMQC、HMBC)光谱上获得力量皇冠DPX 300和引用的残留溶剂信号。低分辨率的质谱得到Finnigan垫LCQ^十乐器。紫外和可见光谱(紫外)被日本岛津公司uv - 2101电脑上紫外可见扫描分光光度计。红外(IR)光谱测量在帕金斯Elmer系统2000傅立叶变换红外分光光度计使用KBr丸。斯图尔特熔点记录使用科学熔点测定仪。分析薄层色谱是运行在现成的0.25毫米厚层默克硅胶60 F_{254 + 366}涂层铝箔。地点在紫外线色谱发现通过观察(254或366海里)和/或喷洒vanillin-sulphuric酸喷。制备薄层色谱运行在0.5毫米厚层默克硅胶60高频_{254 + 366}包含卡索₄(粘合剂)涂在玻璃板20×20厘米。正常色谱法进行了使用不同大小的60列挤满了默克硅胶,粒径0.0400 -0.0630毫米和交联葡聚糖LH-20。

提取和分离

空气干燥,叶粉(15克)和根(17.9 g)c . megalobotrys在甲醇提取索氏提取法(9]屈服在溶剂蒸发,粗叶(CML, 1.6 g)和粗根(CMR, 1.8 g)分别提取。茎皮刮掉了干木,在空气和粉干。干和粉材料(622.4 g)在正己烷提取/氯仿/甲醇/水(1:14:4:1)。去除的溶剂提取了一个棕色的粗提取液(AA-CCR, 54.6 g),其中部分(50.0 g)溶解在最少的水和顺序进行液-液分区与己烷,氯仿和丁醇产量正己烷(AA-CHE, 0.9 g)、氯仿(AA-CCE, 4.5 g),正丁醇(AA-CBE, 11.6 g)和残余水(AA-CWE, 10.6 g)分数。自正己烷分数很小,没有进一步的分离工作可以做。氯仿分数被分为两个部分。第一部分(1.5 g)在1.5克硅胶吸附在硅胶柱和加载(150克)和筛选了CHCl包装₃/层(宣告)收益率(E) -tetratriacontyl-3 - (4-hydroxy - 3-methoxyphenyl) 2-propenoate(10毫克)。第二部分(3.0 g)受到真空液相色谱和筛选了己烷100%,十六进制/ CHCl₃(1:1),CHCl₃(100%)、CHCl₃CHCl /甲醇(宣告)₃/甲醇(1:1)和甲醇(100%)给六个分数;AA-CC-1、AA-CC-2 AA-CC-3、AA-CC-4 AA-CC-5 AA-CC-6。这些分数是保持的anti-plasmodial和DPPH自由基清除活性测试。

在活的有机体内anti-plasmodial活动

干叶(CML, 1.6 g),根(CMR, 1.8 g)和茎皮(AA-CCR, 3.0 g)原油提取的c . megalobotrys进行评估anti-plasmodial活动NMRI白白化小鼠感染1 x 10吗⁷p .鼠(ANKA)寄生的红细胞。提取的影响评估早期感染和感染Abosi中描述和Raseroka5建立。提取的剩余效应也是评估使用存储库或预防性试验。

评估存储库活动或预防性试验

这个方法是一个修改的彼得斯(10),用于评估任何可能的存储库提取的活动。25 NMRI老鼠重达18±2 g,安置在5组在塑料笼子在室温(20°C)并保持在恒定的实验条件被用于实验。他们不断的狗饲料和水供应和允许自由流动。每组的老鼠被不同植物提取连续三天。剂量为1.2毫克/公斤/天乙嘧啶、预防性药物,给一个标准的对照组。无菌蒸馏水是服用安慰剂。1 x 10的接种体大小⁷p .鼠寄生红细胞从捐赠者获得鼠标之前感染p .鼠寄生虫然后进入每一个鼠标在治疗的第四天。七十二小时后,尾血涂片,染色的染色和百分比parasitaemia评估。意味着抑制parasitaemia百分比计算使用公式(11]:

地点:

=意味着抑制parasitaemia百分比

b =意味着% parasitaemia在安慰剂组

c =意味着% parasitaemia提取测试组。

在体外anti-plasmodial活动

anti-plasmodial活动测试是基于Desjardin的方法。等(12]。仍然(W₂)和chloroquinesensitive (D₆)隔离恶性疟原虫持续保持文化的标准方法(13,14被用于生物测定。

测试,两倍稀释的测试样本准备好64倍浓度范围。每个稀释被添加到每个25μL整除的96 -平底微量细胞培养板。200μL整除的培养基被寄生红细胞0.9%添加到所有的试验井。寄生和non-parasitized红细胞和溶剂控制被包含在所有测试。盘子被孵化在3%的气体混合物的37°C O₂,6%的公司₂和91% N2和脉冲25μL培养基含有0.5μCi (G³24小时孵化后H]次黄嘌呤。这是进一步培养18个小时,收获到玻璃纤维过滤器(Packard Filtermate收割机unifilter - 96),用蒸馏水彻底洗,液体闪烁测量放射性。原始数据生成代表寄生虫数量和直接导入到数据分析软件(Oracle),结果集成电路₅₀值。

自由基清除活性

初步筛选方法

12毫克的2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl自由基(DPPH)溶解在50毫升的甲醇(0.24μg /毫升),放置在一个喷雾瓶里。茎皮的粗提取物和获得的分数c . megalobotrys被发现在TLC板并适当地开发。这些都是在重复完成。薄层色谱板被干用吹风机和可视化用紫外线波长254纳米。干盘子之一是喷洒的DPPH试剂和其他vanillin-sulphuric酸喷。的抑制区出现黄斑在紫色背景由于紫色的消失DPPH自由基清除属性表示。的DPPH喷板比较vanillin-sulphuric酸喷板定位可能的化合物具有自由基清除属性的位置。

半定量方法

原油提取和树皮从干细胞获得分数c . megalobotrys被发现在TLC板数量从100年0.05μgμg干和喷洒DPPH试剂。抗坏血酸测试以同样的方式,它作为一个标准。黄色的带紫色背景由于DPPH紫颜色的消失是一个活动的迹象,这是标准的价格相比。最低抑制负荷剂量最少的样本应用于TLC导致抑制。

结果

孤立的化合物从氯仿分数(AA-CCE)的干树皮:

氯仿分数(AA-CCE)c . megalobotrys受到了硅胶色谱买得起白色无定形粉末。其EI-MS光谱显示分子离子峰在m / z 670 [m]⁺符合一个分子式C₄₄H_78年O₄。红外光谱显示吸收乐队在3500年,1700年、1670年和1260厘米¹建议的存在自由-哦,- C = O - C = C -和。。的¹H NMR谱(表1),¹H -¹H的光谱显示芳香ABX质子自旋系统的存在信号(δ_H6.92 (¹H d J = 8.1),δ_H7.09 (¹H, dd, J = 8.2, 1.8赫兹)和δ_H7.05 (¹H d J = 1.8赫兹)],烯反式耦合的质子信号(δ_H7.62 (¹H d J &δ= 15.9赫兹)_H6.30 (¹H d J = 15.9赫兹)和信号由于质子在长链碳原子(δ_H4.20 (2 h t J = 6.7 Hz),δ_H1.71 (2 h, m),δ_H1.27 (42 h, m)和δ_H0.89 (3 h t J = 6.9 Hz)]。甲氧基组的存在明显的尖锐的单线态信号在δ_H3.94(δ_C56.3)。的¹³C NMR谱(表1(δ)显示9个芳香碳信号_C167.7,148.2,147.1,144.9,127.4,123.4,116.1,115.0和109.7)。部门和HMQC光谱表明,五个碳原子是质子化了的(δ_C144.9,127.4,123.4,116.1,115.0,109.7),表明苯propanoid骨架。δ的烯质子产生共鸣_H7.62(δ_C145.0)显示HMBC相关共轭羰基(δ_C167.7),烯碳(δ_C116.1)和芳香族碳(颈- 1(δ_C127.4),其他(δ_C123.4),c - 2(δ_C109.7)]推导碳的分配在δ产生共鸣_C116.1 & 145.0分别为颈- 1”和c - 2”。含甲氧基的质子(δ_H3.94)显示HMBC相关性在δ碳产生共鸣_C147.1表示对芳环的附件。基于HMQC、HMBC谱数据分析质子在δ_H4.21、1.71和0.89被分配到颈- 1”(δ_C65.0),c - 2”(δ_C29.1)和一个终端C-28”(δ_C分别为14.4)的长链。质谱碎片离子由麦克拉佛特重排造成成了碎片在m / z 194(阿魏酸)亏损476 (ch质量单位₂= CH (CH₂)_31日CH₃]。这种化合物是因此确定为(E) - tetratriacontyl-3 2-propenoate (4-hydroxy-3-methoxyphenyl)

在活的有机体内anti-plasmodial活动

的结果在活的有机体内anti-plasmodial提取所示的活动表2。在建立感染;标准培养液的parasitaemia由1 x 10⁷在所有组随时间逐渐增加。减少寄生虫数根治疗组,茎皮和叶提取物相比安慰剂。干树皮提取物表现出强anti-plasmodial活动最高剂量使用证明的平均生存时间为16.2±1.3天了每天500毫克/公斤指示剂量依赖效应。它也表现出良好的意思是疟原虫抑制早期感染(74.5%)和存储库状态在同一浓度(86.9%)。

在体外anti-plasmodial活动

从体外anti-plasmodial活动获得的结果的评估c . megalobotrys茎皮中提取chloroquine-sensitive和氯喹耐药性菌株的方法恶性疟原虫所示表3。这个结果显示很好的anti-plasmodial粗提物的活动。分区的粗提取液的正己烷,氯仿、正丁醇和水,可以评估化合物的性质导致anti-plasmodial活动。正己烷分数代表一个集成电路产生的极性基团的化合物₅₀1.74±0.47μg /毫升和3.78±1.03μg /毫升为D₆和W₂分别隔离。IC产生的氯仿分数₅₀8.34±1.66μg /毫升的D₆隔离和10.28±3.68μg /毫升W₂隔离。正丁醇分数和水提物活性最高浓度(50μg /毫升)测试。

自由基清除活性c . megalobotrys

初步测试表明,AA-CC1和AA-CC2没有彻底清除特性而其他分数证明自由基清除活性(表4)。半定量测定表明,该活动是剂量依赖根据dis colourazation更广泛的区域观察到更高的浓度。不活跃的分数没有变色DPPH。抗坏血酸和分数AA-CC4显示活动所使用的最低浓度。因此,AAVC4 DPPH自由基清除活性最高,能够使脱色DPPHμg 0.05的加载。

所有值的平均数±标准差四个独立实验在不同的日子里进行。CCR:c . megalobotrys粗提取液,切:c . megalobotrys己烷分数,CCE:c . megalobotrys氯仿分数,CWE: c . megalobotrys水分数,CBE:c . megalobotrys正丁醇分数。AA-CC1-6 = 6 semi-purified分数从氯仿分数。切断点粗提物活动的集成电路₅₀= 49.9μg /毫升。

讨论

巴豆属物种分布在热带地区,一般用作牲畜饲料。他们中的许多人被用于传统医学(15)治疗各种疾病(16- - - - - -18),包括疟疾(19]。巴豆megalobotrys是六巴豆属物种在博茨瓦纳20.]。根,种子和干树皮用于传统医学治疗腹痛、浮肿、疟疾和诱导堕胎在人类21,22]。茎皮和种子在早期拓荒者在疟疾流行地区的治疗以及预防发烧(23]在干树皮导致瘫痪在鱼24]。种子的油是一种非常有效的泻药,有毒的老鼠(25),结合萝藦,针对轮和磁带蠕虫26]。虽然对其生物活性,结果表明,它具有anti-plasmodial和可能的抗疟活动在体外和在活的有机体内。c . guatemalensis [27]和c . pseudochellus [28)表现出抗疟活性因此支持这一发现。的粗提物的c . megalobotrys给出了一个集成电路₅₀3.12±1.68μg /毫升的D₆隔离和5.34±1.78μg /毫升W₂。这个活动可以归因于活动中观察到的正己烷部分生产集成电路₅₀1.74±0.47μg /毫升的D₆隔离和3.78±1.03μg /毫升W₂隔离。氯仿数目的四分子分数(AACC4)也表现出良好的自由基清除活性。这些发现可能表明,成功使用c . megalobotrys作为传统医学的治疗疟疾可能不仅是由于其schizontocidal活动。其清除自由基的能力生成的疟疾感染(29日)可以在维持低水平产生影响的parasitaemia症状更少。

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