抗血小板的活动Polyozellin体外和体内

文摘

目的:血管血栓形成和血栓栓塞遮挡各周围性血管疾病是主要的并发症。代理的抑制血小板功能被认为是治疗壁血栓的关键工具。因此,它成为主流药物治疗血管疾病的广泛。Polyozellin (POZ),一个可食用的蘑菇Polyozellus多路复用的一个主要的组成部分,据报道,抗氧化,抗血管生成,抗癌,抗炎作用。然而,抗血小板效应POZ尚未研究。方法:在我们的研究中,抗血小板的活动POZ测定凝血酶-或胶原诱导血小板聚集在体外,二磷酸腺苷(ADP)全身体内血小板聚集,和体内血栓形成。结果:POZ不仅有效地抑制血小板聚集人类血小板体外使用新鲜的孤立,而且体内凝血酶和胶原诱导的血小板聚集。按照抗血小板活动体外,POZ增强体内抗血栓作用,肺栓塞模型和动脉血栓形成模型。结论:这些结果表明,POZ具有抗血小板的活动和可能有助于开发候选药物或功能性食品治疗心血管疾病没有副作用。

关键字

Polyozellin、凝血酶、胶原蛋白、凝血、抗血小板、抗凝、聚合。

介绍

血小板是血液细胞参与人类的主要止血机制。血小板需要执行他们的功能被激活,这激活内皮损伤后可以开始生产,使皮下结构血流量(1]。血小板的相互作用相互这意味着聚合产生血小板血栓的最终目的,构成的主要止血塞(1]。此外,血小板聚集在血栓性疾病的病理生理学中起着至关重要的作用,因此,抗血小板药物应用临床脑缺血的危险的患者,不稳定性心绞痛、急性心肌梗死(1,2]。因此,它已经认识到,血小板和血管之间的交互在血栓形成的发展有重要的作用和心血管疾病2]。控制在动脉血栓形成和血小板聚集是至关重要的可能导致威胁生命的疾病,如心脏病、不稳定心绞痛和再保险闭塞血管成形术后(3]。因此,对血小板聚集的抑制可能是一个潜在的战略这些心血管疾病的治疗和预防。

Polyozellus多路复用(Thelephoraceae)是一种可食用的黑色蘑菇和生长在韩国和日本4]。尤其是在韩国,这是初秋的收获和用作食品漂白后开水。在先前的研究中,选民的p .多路复用已经被分离出来并kynapsin-12等确定其化学结构,-13年,-28年,thelephoric酸,polyozellin (POZ) [5- - - - - -7]。和生物活动同时进行,例如,kynapcin-12, -13年和-28年显示抑制影响prolyl endopeptidasep [6,7]。Thelephoric酸抑制人类细胞色素P450家庭成员的活动和时间的方式在体外(8]。POZ显示抗癌作用的增强小鼠肝癌细胞系Hepa1c1c7醌还原酶、谷胱甘肽S-transferase活动,谷胱甘肽含量9),同时也抑制了脂多糖(LPS)全身激活核factor-κB (NF-κB)和c-Jun n端激酶(物)在小鼠巨噬细胞细胞系生264.7 [10]。此外,肿瘤坏死因子(TNF) -α-mediated interleukin-8(引发)和矩阵metalloproteinase-7 (MMP-7)生产中减少人体肠道上皮细胞系HT-29 POZ [11]。

然而,仍然有罕见的调查报告对抗凝血剂和抗血小板POZ活动。因为最近的研究表明POZ可以作为抗氧化剂(5)和抗炎剂(10,11),因此POZ有望揭示抗凝和抗血小板效应。在这项研究中,我们调查了POZ对血小板聚集和血栓形成的影响在体外和在活的有机体内系统。

材料和方法

试剂

凝血酶、胶原蛋白、肾上腺素、二磷酸腺苷(ADP)从σ(圣路易斯,密苏里州)。

植物材料、隔离和标识

Polyozellus多路复用(PM)收集。Odaesan,铁原,韩国在2001年9月,被教授Kyung-Sik歌庆北国立大学。凭证标本(npm - pm - 2001)沉积在天然产物实验室医学、庆北国立大学。点(1.0公斤)的干子实体与甲醇回流两次3 h。提取过滤,浓缩干燥的旋转蒸发器(EYELA、东京、日本)。Methanolic提取(204.0 g)悬浮在蒸馏水和苯等有机溶剂,先后分区CHCl₃和层。层可溶性分数(2.1 g)是用100毫升的层,和残渣(1.2 g)悬浮在500毫升的甲醇。然后暂停在3000 g离心5分钟。沉淀被丢弃和上层的集中。的合成渣进一步纯化Senshu Pak ODS高效液相色谱法(HPLC)。用甲醇洗脱:H₂O = 65:10含有1%醋酸提供化合物1(512.0毫克),深绿色粉末。孤立的化合物的化学结构是由其核磁共振光谱的比较数据与文献[4]。

化合物1 Polyozellin

¹核磁共振(400 MHz, DMSO -d₆+ CHCl₃- - - - - -d):δ9.20 (2 h、br,酚醛哦),8.70 (2 h、br,酚醛哦),7.20 (h - 2 h, s)和第7),7.20 (2 h, s, H-4和H-10), 2.53 (6 h, s, ch₃)。¹³理化性质(100 MHz, DMSO -d₆+ CHCl₃- - - - - -d):δ168.0 (C = O), 151.0 (C-4a和C-10a), 146.4(颈和C-9), 142.8 (C - 2和8),137.6 (C-5a和C-11a), 130.8(其他和技术),116.9 (C-6a和C-12a), 113.5 (C-6b和C-12b), 106.1(颈- 1,即),98.8 (C - 4和C-10)(图1)。

高效液相色谱法分析确定POZ纯度

确定孤立POZ的纯度,我们进行了高效液相色谱法(HPLC)分析。高效液相色谱仪器配备了pu - 2080 +智能高效液相色谱泵和md - 2010 +多波长检测器从JASCO(日本东京)波长254纳米。此外,一个YMC-Trait C18柱(Ø4.6×250毫米,5μm YMC美国,阿伦敦,PA,美国)作为固定相。流动相是由水(溶剂)和乙腈(溶剂B;默克密理博,达姆施塔特,德国)含1%醋酸(霍阿克;默克密理博)。洗脱液梯度,溶剂B举行5分钟为5%,从5%上升到100%在40分钟,保持在100% 5分钟,5分钟下降到5%,并再次举行15分钟5%。流量为1.0毫升/分钟,和5μg POZ注入列。纯度(≥97%)根据峰面积计算(图1 b)。

动物和畜牧业

雄性C57BL / 6小鼠(6 - 7周大,大约27 g(体重)从东方生物有限公司购买(国军、韩国)被用于这项研究后12天的驯化。动物被安置5 /聚碳酸酯笼控制温度(20 - 25°C)和湿度(40 - 45%)和十二12小时光/暗周期。在适应环境,动物们提供饮食正常啮齿动物颗粒和水的广告被随意。所有的动物治疗按照实验动物保健和使用指南庆北国立大学(IRB没有出具。克伦民族联盟2012 - 13)。

细胞培养

主要HUVECs得到从Cambrex生物科学(查尔斯城,IA)和维护(如前所述)(12- - - - - -20.]。所有实验都使用HUVECs执行通道3 - 5。

体外凝血时间

小鼠禁食过夜和POZ(1.8, 44岁,8.8或17.5μg /鼠标)在Tris-buffered盐水(TBS)是由静脉注射(注射)。一个小时后管理、0.1毫升的动脉血液样本被撤回到3.8% Na-citrate (1/10, v / v)体外激活局部血栓形成质时间(aPTT)、凝血酶原时间(PT)的决心。aPTT、PT测定使用Thrombotimer (Behnk Elektronik、Norderstedt、德国),根据制造商的指示。总之,100μL柠檬酸盐老鼠等离子体孵化为3分钟37°C紧随其后的100毫升aPTT化验试剂。孵化后1分钟在37°C, 100μL CaCl 20毫米₂补充说,凝血时间记录。PT测定100μL柠檬酸盐鼠标等离子的孵化为3分钟37°C。然后,200μL PT测定试剂pre-incubated 10分钟37°C,添加和凝固时间被记录。

PT结果表示在秒和国际标准化比率(INR), aPTT结果表示在秒。浓度双凝血时间计算方程的每一行。

印度卢比= (PT / PT控制样本)^{三军情报局}

ISI =内部敏感指数

血小板聚集试验在体外

从人类志愿者血液收集静脉穿刺,卷入一个塑料注射器含有3.8%柠檬酸三钠的溶液(1/9,柠檬酸/血,v / v)。健康男性志愿者没有采取任何药物在采血前至少7天。富血小板血浆(PRP)在室温下由离心(RT) 15分钟在150×g。PRP调整到一个3×10的浓度⁸血小板/毫升血细胞计数器细胞计数和洗TBS的CaCl 1毫米₂。洗涤血小板在TBS POZ浓度表示的孵化3分钟,然后由0.1 U /毫升凝血酶刺激(σ)在0.9%的盐水5分钟或5μg /毫升胶原蛋白为15分钟37°C。血小板聚集记录使用一个集合度计(Chronolog Havertown, PA)。研究协议(KNUH 2012-01-010)批准了庆北国立大学医院的机构审查委员会(韩国大邱)。

隔离小鼠血小板

富含血小板血浆(PRP)从同源的供体小鼠获得了双重离心(200 g创建血小板/等离子体阶段,颗粒血小板500克)。富含血小板血浆被调整至1 x 10的浓度⁹血小板与使用血细胞计数器/毫升细胞计数。小鼠血小板从PRP洗一次消息灵通的缓冲区(5毫米玫瑰,136毫米氯化钠,氯化钾2.7毫米,0.42毫米不₂阿宝₄2毫米MgCl₂,5.6毫米葡萄糖,BSA的0.1% (w / v), pH值7.45)在1毫米CaCl的存在₂。

ADP-induced血小板聚集试验体外

与POZ小鼠接种(1.8,44岁,8.8或17.5μg /鼠标)在TBS输液注射或口服消费后禁食过夜。24小时后,PRP (10⁹血小板/毫升)240年卷μL孵化在37°C 1.5分钟在连续搅拌的凝集计1000转10μL ADP和刺激。光传导的变化记录刺激后7分钟。聚合的程度被表示为一个百分比的最大的透光率,获得与悬浮缓冲(洗血小板聚集)。

细胞毒性评估

POZ在血小板的细胞毒性评估乳酸脱氢酶(LDH)漏的血小板。在37°C与POZ孵化后3分钟,能整除的收集和离心机RT 12000×g 2分钟。五十μL上层清液加入1毫升Tris-EDTA-NADH缓冲区(56毫米三(羟甲基)氨基甲烷,EDTA 5.6毫米,0.17毫米β-NADH, pH值7.4),和孵化37°C。10分钟后,100μL 14毫米丙酮酸是pre-incubated在37°C是补充道。吸光度在340 nm的减少导致了NADH NAD +转换的测量评估LDH整除的活动。LDH泄漏的程度被表示为%的总酶活性细胞溶解Triton x - 100的0.3%。

细胞生存能力分析

确定HUVECs的可行性,3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyltetrazolium溴化(MTT,σ)使用。细胞生长在96孔板的密度5×103个细胞/。24小时孵化后,细胞被洗用新鲜培养基治疗POZ 48 h。POZ-treated细胞被清洗和孵化100μL 1毫克/毫升MTT 4 h。蓝色的水晶甲瓒在150年由活细胞随着μL TBS之前吸光度的测量使用标540海里(Tecan、Grodig、奥地利)。

动脉血栓形成的动物模型

的FeCl₃全身血栓形成小鼠模型建立了如前所述[21]。POZ(1.8, 44岁,8.8或17.5μg /鼠标)在TBS由静脉输液注入overnight-fasted老鼠,并使用3%异氟烷(久远的小鼠麻醉^®,Choongwae制药,首尔,韩国)其次是注入0.1毫升的0.1%罗丹明6 g(σ),静脉注射。睾丸动脉(直径200μm)仔细地暴露和棉线(直径0.2毫米)和0.25 FeCl饱和₃应用于外膜表面为5分钟。棉线被用生理盐水冲洗伤口。血栓形成的大小与hematoxylin-eosin睾丸动脉随后监控(他)染色。显微图像数字化与光敏颜色电荷耦合器件相机(l - 600;徕卡)。这些发现得分根据以下类别:0,没有血栓;1、小血栓(50×75μm);2、中型血栓(100×150μm);3、大血栓(200×300μm)。从FeCl₃全身的血管内皮损伤睾丸动脉的阻塞大量血栓之间的时间间隔测量血管损伤的起始和稳定的发生阻塞。

引起的急性血栓形成胶原蛋白和肾上腺素的结合

禁食后的老鼠在一夜之间,他们被分成10个/组小鼠和管理POZ(1.8, 44岁,8.8或17.5μg /鼠标)在TBS输液注射。一个小时后,混合物与500年由μg /公斤胶原蛋白和50μg /公斤肾上腺素对急性血栓形成是静脉注射的老鼠尾巴。每个老鼠都仔细观察15分钟来确定鼠标瘫痪,死亡或恢复急性血栓性的挑战。进行统计分析,五分离实验。

统计分析

数据表示为均值±SEM从至少三个独立的实验。两组之间的统计学意义是通过学生的学习任务决定的。p< 0.05被认为是统计学意义。

结果

POZ对血小板聚集的影响在体外和在活的有机体内

我们观察到POZ对凝血酶的影响——或者collagen-mediated血小板聚集。POZ显著抑制小鼠血小板聚集由0.1 U /毫升凝血酶或5μg /毫升胶原蛋白浓度的方式(图2)。结果表明:半最大抑制浓度(IC₅₀)的POZ PRPμMμM 18.4和19.7,分别根据抑制曲线。

此外,我们还通过5μM ADP诱导的血小板聚集体外,因为有之前的文献对ADP诱导的血小板聚集在活的有机体内(22]。图2 b表明POZ的抑制效应(在10和20μM)体外ADP引起的血小板聚集。和口头的抑制性影响管理POZ都不如POZ注入。此外,POZ还抑制凝血酶和胶原诱导血小板聚集在活的有机体内(数据没有显示)。这是知道老鼠的平均循环血容量72毫升/公斤在以前的报告23),因此,注射的POZ如1.8,4.4,8.8,和17.5μg /鼠标产生的最大浓度2、5、10、20μM,分别在外周血的平均体重和血容量的老鼠27 g和2毫升,分别。

随后,分析了LDH泄漏血小板是否POZ关于血小板的细胞毒性。LDH泄漏引起POZ治疗没有被观察到,而50μM洋地黄皂苷是控制相比显著增加(图3)。这些数据表明POZ不影响血小板的完整性。此外,HUVECs可行性并不受POZ治疗24小时,从5到100年μM浓度(图3 b)。

POZ动脉血栓形成和肺栓塞的影响模型

的FeCl₃全身的颈动脉血栓形成大鼠模型建立了(21探讨抗血小板效应)和使用。图4显示了时间的结果血栓形成和血栓POZ影响的大小。当控制老鼠通过FeCl诱导内皮损伤₃,大型血栓的增长发生在8.5±1.1分钟,而抗血小板IIb GP / iii a抑制剂,tirofiban,显著放缓至62.4±5.4分钟。POZ血栓增长放缓下来(图4)和减少了大小10,FeCl后60分钟₃介导血栓形成(图4 b)表明由FeCl POZ可以抑制血栓形成₃在活的有机体内。

肺血栓形成模型,静脉输液注射胶原蛋白和肾上腺素的混合物包括老鼠造成大量肺栓塞导致急性麻痹和突然死亡(88±5%的死亡率)。POZ-administered小鼠死亡率下降相比mixture-injected老鼠(图4 c)。此外,POZ的抗凝血效果也观察到在aPTT、PT延长存在剂量依赖的相关性,当体外凝血时间测定(表1)。在这个试验,小鼠血液样本1小时后被撤销政府POZ因为POZ aPTT、PT的高原抑制性效应观察后1小时(数据未显示)。

表1:体外polyozellin的凝固时间^一个。

讨论

在这项研究中,POZ轴承两双苯邻二酚和乙酰半个有效地抑制血小板聚集在体外和在活的有机体内。在以前的研究中,怀特等人研究了槲皮素抑制作用及其结构相关类黄酮collagen-stimulated人类血小板血小板功能。他们建议化学结构要求归因于强有力的抑制,尤其是B环苯邻二酚基(24]。此外,有报告显示乙酰基的作用在抑制血小板功能的影响的比较阿司匹林和三柳胆镁(水杨酸non-acetylated)对人类血小板(25]。因此,两个官能团POZ如儿茶酚-和乙酰半个理应在血小板抑制作用有重要的作用,但是,目前还不清楚。

指出POZ受到政府的影响的不同抑制性影响路线(静脉输液注射或填喂法消费)如果相同数量的POZ作为所示图2 b,等效接触不同的路线是不同的,因此,生物利用度或生物等效性的复合管理填喂法消费和输液注射影响药代动力学参数由ADME(吸收、分布、代谢和排泄26,27]。

1)吸收;POZ进入血液中,它必须采取通常通过粘膜表面像消化道(肠道吸收),之后才被目标细胞。

2)分布POZ需要携带其效应。从那里,POZ可能分配到血管,肌肉和器官,通常不同的区段。进入体循环后,通过血管内注射或吸收从各种细胞外的任何网站,POZ受到众多分布过程往往会降低血浆浓度。

3)代谢和排泄不强饲法之间的不同的消费和输液注射一次POZ达到进入血液。因此,通过静脉注射POZ体内填喂法相比具有更好的抑制活动消费。

整体而言,这些结果表明,POZ可以作为有效的血小板聚集抑制剂衰减血栓形成和心血管疾病的风险,进一步的研究是需要确定哪些官能团的化学结构POZ揭示这一活动至关重要。

总之,我们评估的抗血小板效应POZ来源于天然产物,p .多路复用,新鲜的孤立的人类血小板血栓形成小鼠模型。基于细胞毒性和细胞生存能力分析,确定了抗血小板效应引起POZ并非由于其细胞毒性。我们希望POZ和p .多路复用可能有助于开发候选药物或功能性食品各种血管疾病的治疗和预防通过调节血小板功能。

确认

这项研究受到了基础科学研究项目通过韩国国家研究基金会(NRF)由科技部,ICT和未来规划(NRF - 2012 r1a5a2a42671316)。

声明感兴趣的语句

没有宣布。

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