抗肿瘤活性的酸性杂多糖隔绝木耳属auricula-Judae

文摘

一个名叫wAF的水溶性酸性杂多糖是隔绝木耳属auricula-judae。它组成的骨干α-(1→3)联系D-mannopyranose残留。防止腺泡细胞癌扩散WAF分数表现出强烈抑制体外测试。它显著地抑制肿瘤生长在BALB / c小鼠的剂量依赖性的方式。此外,增强小鼠体重的比率wAF分数都高于5 -氟尿嘧啶,化疗抗癌剂。荧光显微镜和肿瘤组织细胞形态学观察表明,wAF3分数诱导肿瘤细胞的凋亡。伯灵顿apoptosis-related蛋白免疫组织化学和Bcl - 2表达表明wAF3诱导s - 180上调伯灵顿和下调肿瘤细胞凋亡的Bcl - 2。这些发现证实了wAF多糖具有良好的抗肿瘤活性,可能被认为是一个潜在的抗肿瘤剂

关键字

木耳属auricula-Judae、多糖抗肿瘤活性,细胞凋亡

介绍

癌症是全世界首要死因,导致正常细胞的染色体DNA的突变。多糖最近吸引了越来越多的关注,因为他们的抗肿瘤和免疫调节作用[1]。许多结果表明,多糖具有广泛的生物学效应,如抗生素、anti-mutant、抗凝剂、免疫刺激剂活动(2,3]。

酸性多糖组成的α-1→3-D-mannopyranose作为骨干,组成了水溶性部分的重要组成部分木耳属auricula-judae,一只耳朵形状的食用菌(4,5]。除了酸性多糖的性质,甘露糖丰富的结构可能有益生物制剂和天然药物。一些mannose-binding蛋白质c型凝集素,发现在动物细胞表面(6]。这些凝集素可能在免疫监视功能识别高甘露糖结构出现在致病菌如细菌和真菌(7]。各种多糖分离侧耳属块茎regium(8],香菇[1],茯苓[9,10),灵芝tsugae菌丝体(11),木耳属auricula-judae(12,13)研究,关注结构和链性质的影响,如灵活性,或多路形成的生物活性。

在我们之前的工作中,水溶性酸性杂多糖的结构隔离木耳属auricula-judae进行了研究。它的化学结构是决定由骨干的α-(1→3)联系D-mannopyranose残留与吊坠β-D-xylose组的副作用,β-D-glucoseβ-D-glucuronic酸或位置O6或O2 (图1)[14]。

这是第一次揭示构象和结构中包含最丰富的多糖木耳属auriculajudae(15]。然而,它的抗肿瘤生物活性从来没有被报道。

在目前的工作,在活的有机体内多糖的抗肿瘤活性wAF对异种移植肉瘤180肿瘤细胞在体外腺泡细胞癌的增殖抑制率(ACC) (16肿瘤细胞进行评估。wAF的抗肿瘤机制的活动由形态学研究方法(荧光显微镜与赫斯特染色)和免疫组织化学方法,试图阐明抗肿瘤机制。

实验

材料

木耳属auricula-judae从访仙(湖北省,中国)。腺泡细胞癌(16——武汉大学口腔)是由学校(武汉,中国)。肉瘤180 (s - 180)是由药房,华中科技大学同济医学院(武汉,中国)。雄性BALB / c小鼠动物中心,华中科技大学同济医学院(武汉,中国)。

孤立和分离

wAF孤立于水果的尸体木耳属auricula-judae根据我们之前报道的方法(14]。获取样本有不同的分子量,WAF溶解在纯水和室温ultrasonicated超声波清洁(亩/ 1004)等不同的时间0 h, 0.5 h, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h, 16 h编码为WAF对应样本,WAF1, WAF2, WAF3, WAF4, WAF5 WAF6, WAF7。WAF样本和冻干用分数终于干。

在体外抗肿瘤试验

MTT法被用于在体外抗肿瘤试验。短暂,腺泡细胞癌(ACC)肿瘤细胞(1×105细胞/毫升)是生长在罗斯威尔公园纪念研究所(电源中断)1640中补充10%胎牛血清(的边后卫)在大气中5%的二氧化碳在37°C h。72年的浓度样本5和50μg /毫升0.9%氯化钠溶液。生活ACC肿瘤细胞的数量的最后72 h潜伏期确定colorimetrically根据Mosmann描述的肝癌和四唑盐(17]。5 -氟尿嘧啶(研究者用)被视为积极的控制。

荧光显微镜和凋亡的评估

ACC肿瘤细胞治疗与wAF3样本,并同时在孵化RPMI 1640中含10%胎牛血清(的边后卫)5%股份的氛围₂在37°C。细胞被染色的赫斯特33342年(10毫克/毫升,σ)15分钟在黑暗中,紧随其后的是洗两次磷酸盐(PBS)。他们倒相荧光显微镜下观察(奥林巴斯DP70、东京、日本)配备一个40×为凋亡评估目标和紫外线过滤数据集。定量分析是由数超过6个随机领域的500个细胞样本。每个实验至少重复三次。

在活的有机体内抗肿瘤试验

8-week-old雄性BALB / c小鼠权重20±1 g接种肉瘤180 (s - 180)肿瘤细胞。24小时后,研究者用和WAF样品溶解在消毒0.9%氯化钠水溶液为8天每天腹腔注射一次。同样体积的生理盐水腹腔内注入控制老鼠的解决方案。注射后,老鼠牺牲和肿瘤切除。抑制率(ξ)和增强体重比(f)计算如下:

ξ= [(W_c- W_t)/ W_c)×100% (1)

f= ((W_一个- W_b)/ W_b)×100% (2)

其中W_c是对照组的平均肿瘤重量,W_t是测试组的平均肿瘤重量;和W_b和W_一个的体重是老鼠在试验前后。完整的回归表示数量的比值tumorfree老鼠老鼠测试的数量。

免疫组织化学apoptosis-related蛋白质

免疫组织化学测试是根据我们之前报道的方法(13]。

预处理的疣状肿瘤组织

s - 180肿瘤组织从小鼠切除,切成小块。与福尔马林固定36 h。Fixed-tumors沉浸在一系列的70%,80%,90%,95%到100%的粒级15 - 20分钟。乙醇的乙醇溶液dehydratedtumors取代苯甲酸甲酯苯甲酸甲酯的通过连续变化。随后,肿瘤被嵌入到石蜡保持下调查。4毫米串行部分被剪切了预防肿瘤块和安装在poly-L-lysine(锁相环)涂布显微镜载玻片,然后在60°C干1 h为疣状。

应用伯灵顿和bcl - 2

免疫组织化学的伯灵顿和bcl - 2测试执行的peroxidase-labeled链霉亲和素生物素法与微波抗原检索(18- - - - - -20.]。石蜡在二甲苯的部分被删除。内源性过氧化物酶被孵化3% H₂O₂10分钟37°C,紧随其后的是洗涤与PBS的四倍。在微波炉抗原进行了检索。简单地说,肿瘤组织的部分加热到95°C和保持在0.01 mol / L柠檬酸缓冲(pH值6.0)10分钟。随后在温暖的自来水冲洗。然后部分正常山羊血清治疗,疗程10分钟37°C,以减少非特异性染色。随后,兔子antimouse伯灵顿和bcl - 2多克隆抗体(圣克鲁斯生物技术公司,圣克鲁斯,CA,美国)作为主要的抗体被添加在最适稀释和一夜之间,部分被孵化湿润在4°C室。这一步,每一个被洗了四次PBS成功后5分钟。在湿润孵化室的部分与生物素化的山羊antirabbit免疫球蛋白作为二次抗体10分钟37°C,紧随其后的是接触链霉亲和素辣根过氧化物酶10分钟37°C。颜色是使用含有0.05%的解决方案开发diaminobenzidine (DAB)发色体。辣根过氧化物酶活动的可视化后通过与涂颜色反应,部分弱与苏木精复染色,安装并使用光学显微镜检查配备40×目标。确认immunospecificity -控制包括的部分主要抗体是省略了,取而代之的是缓冲区或无免疫力免疫球蛋白。Formalin-fixed,石蜡包埋的部分正常的人类淋巴结作为积极的控制。 Both the number of immune reactive cells and the total number of cells (at least 500 cells) were determined to calculate percentage of Bax and Bcl-2 positive cells by visual inspection of six different fields per section.

统计分析

学生的学习任务是用来评估控制和测试组之间的差异。两组之间的显著差异定义为p < 0.05。

结果与讨论

在体外和在活的有机体内结果

的在体外肿瘤细胞的增殖抑制率ACC的wAF分数所示图2。

很明显,所有的wAF分数表现出强烈抑制细胞生长。wAF分数明显的剂量反应关系在体外观察抑制ACC细胞增殖。抑制50微克/毫升剂量高于5 ug /毫升。有趣的是,wAF3 wAF4和wAF5中间M_w显示相当强的抑制ACC细胞。的样本wAF3 (29.4×10⁴),wAF4 (12.8×10⁴)和wAF5 (11.2×10⁴)在50微克/毫升的浓度很高的抑制率为34.0%,分别为34.4%和34.1%。这是与研究者用(40.5%)。然而,众所周知,研究者用有毒而多糖从天然产物相对安全。一般来说,相对高分子量葡聚糖似乎更有效的抗肿瘤活性的低分子量(21]。但医学的性质等蘑菇多糖(1→3)-β-glucuronoxylomannans并不强烈依赖于分子量。他们与分子量水解含glucuronoxylomannans分数从53到1000 KDa相当于分数,高分子量(22]。

评估在活的有机体内抗肿瘤活性wAF分数,示例解决方案是腹腔内注射(i.p。20毫克/公斤,60毫克/公斤)BALB / c小鼠每天一次对s - 180肿瘤细胞接种后8天24小时的结果在活的有机体内wAF样品抗肿瘤活性进行了综述表1研究者用的,还列出了,化疗抗癌剂作为积极的控制。结果表明,wAF分数显著地抑制肿瘤的生长,但所有的剂量显示某些对肿瘤细胞的生长抑制率。对照组的肿瘤重量是0.73克,而治疗组小鼠的肿瘤重量和高浓度的wAF3被减少到较低的平均重0.20克和0.48克,分别。相比与其他剂量,剂量20毫克/公斤表现出相对较高的抗肿瘤的活动。治疗组小鼠的肿瘤重量低,或高剂量wAF分数与研究者用组相比较。此外,增强所有剂量的体重重的比率明显高于研究者用,表明wAF样品比研究者用低毒性,导致正常细胞以及肿瘤细胞(表1)。

表1:wAF分数与抗肿瘤活性肉瘤180实体瘤生长在BALB / c小鼠。

酸性多糖组成的a - 1→3-D-mannopyranose水溶性部分木耳属auricula-judae。甘露糖丰富的结构可能有益生物制剂和天然药物。它可能有潜在的免疫监视的功能识别高甘露糖结构出现在细胞凋亡。

荧光显微镜和凋亡的评估

荧光显微镜是利用观察凋亡细胞的形态学变化,包括细胞收缩、凝结和核分裂,所有这些表明细胞凋亡。图3显示各种类型的核形态ACC细胞死亡与赫斯特染色后暴露在wAF3 24 h在0.5毫克/毫升的浓度。赫斯特染色细胞核的细胞破碎或一个完整的细胞膜。圆核、蓝片段核或收缩细胞与可行的和凋亡细胞。见图3。

对照组主要是活细胞,而wAF3治疗组与分散核有许多凋亡细胞。明显的抑制与肿瘤细胞表明wAF3样本可以在ACC细胞诱导细胞凋亡。形态变化可以提供最可靠的标准识别凋亡过程。细胞形态学的变化,包括细胞收缩,凝结和核分裂,所有这些表明ACC wAF3治疗后细胞凋亡。

wAF对肿瘤组织细胞形态学的影响

图4组织切片显示肿瘤组织在对照组和wAF3 wAF4和wAF5治疗老鼠。与对照组小鼠的肿瘤组织,肿瘤组织wAF样品处理小鼠显示大量坏死,如核萎缩,瓦解和结构少红染色区域。同时,染色质凝聚、细胞收缩、质膜八卦和形成membrane-enclosed凋亡wAF的尸体被发现在肿瘤部分分数处理老鼠,表明许多肿瘤细胞发生凋亡。

apoptosis-related蛋白bcl - 2、Bax的表达在s - 180肿瘤腹腔内注射治疗的wAF3水溶液为BALB / c小鼠研究(图5)。

显示,apoptosis-related蛋白质伯灵顿和bcl - 2应用s - 180肿瘤的治疗控制老鼠和wAF3治疗老鼠。结果显示显著差异表达的蛋白质控制和wAF3组。在对照组,伯灵顿没有检测到,而bcl - 2应用显著的s - 180肿瘤。与对照组相比,小鼠接受wAF3表现出显著降低bcl - 2的表达,增加了伯灵顿的表情。独特的高伯灵顿bcl - 2表达较低的应用wAF3组表明,wAF3多糖诱导细胞凋亡的s - 180肿瘤细胞可能通过调控表达的伯灵顿抵消bcl - 2的效果。此外,bcl - 2高表达水平的伯灵顿伴随着低免疫反应性可以维持较低的bcl - 2:伯灵顿比支持细胞凋亡,或者,它可以有效地对抗抗凋亡bcl - 2的水平。免疫组织化学结果表明wAF3在异种移植s - 180肿瘤细胞诱导细胞凋亡调控的伯灵顿和bcl - 2显示的。细胞凋亡的肿瘤细胞通常涉及许多癌基因和抑癌的表达(23]。bcl - 2家族作为一个变阻器调节程序性细胞死亡,是抗癌治疗的目标24]。死亡的比率拮抗剂(bcl - 2、Bcl-xL)受体激动剂(伯灵顿,坏,出价)决定了细胞对凋亡刺激作出反应。下调的抑制肿瘤生长抑制bcl - 2可能通过促进细胞程序性死亡(25]。已经证明伯灵顿bcl - 2促进细胞凋亡而抑制细胞凋亡(26]。伯灵顿驻留在许多细胞的细胞溶质的非活动状态。为了应对死亡刺激,伯灵顿蛋白质发生构象变化,暴露membrane-targeting域,导致其线粒体膜易位,伯灵顿插入,使细胞色素c的释放激活caspase-3和其他apoptogenic蛋白(27,28]。伯灵顿主导时,细胞凋亡是加速29日]。我们的研究结果表明,比例的bcl - 2 /伯灵顿wAF3治疗组明显低于对照组,表明thatwAF3还可以调节和控制bcl - 2、Bax的表达诱导细胞凋亡。然而,相关的作用机制尚未清楚,需要进一步的研究。

结论

一个名叫wAF的水溶性酸性杂多糖被隔绝木耳属auricula-judae。的在活的有机体内和在体外评估表明,wAF分数表现出强烈的对肿瘤细胞生长抑制剂量依赖性的方式。荧光显微镜和肿瘤组织细胞形态学观察表明,wAF分数诱导肿瘤细胞的凋亡。肿瘤抑制机制的进一步分析显示,伯灵顿的表达增加,而bcl - 2的表达在s - 180肿瘤组织切片急剧减少。免疫组织化学结果表明wAF多糖在s - 180肿瘤细胞可以诱导细胞凋亡调控的伯灵顿和bcl - 2显示的。这些发现证实了wAF能够被视为一个潜在的抗肿瘤剂。

确认

这项工作是由基础研究基金支持中央大学(2014 py030)。

引用

1. 张,等。抗肿瘤从蘑菇多糖:回顾他们的孤立过程、结构特点和抗肿瘤活性。食品科学与技术的趋势。2007;18:4-19。
2. 阿里BH, et al。阿拉伯树胶的生物效应:最近的一些研究的回顾。食物ChemToxicol 2009; 47:1-8。
3. Wijesekara我,et al。硫酸多糖的生物活性和潜在的健康益处来自海洋藻类。CarbohydPolym 2011; 84:14-21。
4. Hara C, et al。O-acetyl组织的位置(1→3)从Dictyophoraindusiatafisch -α-d-mannan。Carbohyd杂志1982;111:143 - 150。
5. 宋Y, et al .隔离和表征的多糖“Kikurage Auriculariaauricula-judae的子实体。农业和生物化学。1978;42:417 - 425。
6. Ng KK-S、等人取向mannose-binding蛋白质对多价结合配体的配位体识别。生物化学杂志。2002;277:16088 - 16095。
7. Weis WI, et al . C型凝集素超科应承担的免疫系统。免疫学检查1998;163:雷竞技苹果下载19-34。
8. 道Y, et al .理化性质和水溶性抗肿瘤活性本机和硫酸超支化蘑菇多糖。Carbohyd杂志2006;341:2261 - 2269。
9. 黄问,et al .评价硫酸α-glucans从Poriacocos菌丝作为潜在的抗肿瘤剂。CarbohydPolym。2006;64:337 - 344。
10. 王Y, et al。结构五个抗肿瘤活性的相关性从Poriacocossclerotiumβ-glucan的衍生品。Carbohyd杂志2004;339:2567 - 2574。
11. 彭Y, et al。从菌丝体胞外多糖的结构和抗肿瘤活性。CarbohydPolym。2003;54:297 - 303。
12. 马Z, et al .结构和链构象的β葡聚糖Auriculariaauricula judae应承担的隔绝。生物聚合物。2008;89:614 - 622。
13. 马Z, et al .评价从木耳属水溶性β-d-glucan auricular-judae作为潜在的抗肿瘤剂。CarbohydPolym。2010;80:977 - 983。
14. 马佐,et al。的分子结构和溶液构象Auriculariaauricula-judae.Biopolymers酸性杂多糖。2011;95:217 - 227。
15. 马Z, et al .评价从木耳属水溶性β-D-glucan auricular-judae作为潜在的抗肿瘤剂。碳水化合物聚合物。2010;80:977 - 83。
16. Cataldo F, et al。食物不耐受和过敏症增加移民儿童来自发展中国家的?儿科过敏和免疫学:欧洲社会的官方出版物儿科过敏和免疫学。2006;17:364 - 69。
17. Mosmann t细胞生长和存活的快速比色测定:应用程序来增殖和细胞毒性分析。J Immunol方法。1983;65:55 - 63。
18. 罗曼厘米,et al . Bcl 2:应承担的伯灵顿和Bcl 2:地理Bcl x比率图像仪定量免疫组织化学表达在卵巢癌:与预后相关。血细胞计数。2000;42:61 - 66。
19. Saxena, et al . Bcl的表达量x, Bcl 2,应承担的伯灵顿,贝克在动脉内膜切除术和atherectomy标本。《病理学》杂志上。2002;196:335 - 342。
20. 谢X, et al。自发凋亡的预后价值,伯灵顿,地理Bcl 2,在口腔鳞状细胞癌p53 tongue.Cancer。1999;86:913-20。
21. 美津浓t从蘑菇真菌多糖抗肿瘤的发展。食品食物是J日本。1996;167:69 - 85。
22. 高Q, et al .性格化的酸性杂聚糖TremellafuciformisBerk与细胞因子刺激的活动。碳水化合物研究。1996;288:135 - 142。
23. 罗问,et al . Lyciumbarbarum多糖诱导人类前列腺癌细胞凋亡和抑制前列腺癌生长在人类前列腺癌的异种移植小鼠模型。药用食品杂志》上。2009;12:695 - 703。
24. Bae j s, et al。多糖分离Phellinusgilvusinhibit黑色素瘤小鼠的增长。癌症信件2005;218:43-52。
25. Zhivotovsky B, et al。注射细胞色素c诱导细胞凋亡。自然1998;391:449-50。
26. 管理员,et al .小鼠模型的细胞死亡。自然遗传学2001;28:113-8。
27. 沃尔特公斤,et al。运动细胞溶质的伯灵顿线粒体在细胞凋亡。细胞生物学杂志》1997;139:1281 - 1292。
28. 郭B, et al。Humanin肽抑制凋亡通过干扰伯灵顿激活。自然423:456 2003;61年。
29. Oltval锌、et al . bcl - 2二聚化体内守恒的相同器官,伯灵顿,加速细胞程序死亡。细胞。1993;74:609 - 619。