研究和评论:微生物学和雷竞技苹果下载生物技术杂志》上
菜单E - ISSN: 2320 - 3528
P - ISSN: 2347 - 2286
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朱莉安娜克里斯蒂娜·圣地亚哥巴斯托斯1Beatriz阿方索de Menezes克劳迪娅2,菲比安娜Fantinatti-Garboggini2,玛丽娜Aiello帕迪拉1克拉丽斯,Weis攻击1,她曾Konecny科恩1*
1实验室病毒学、部门的遗传学坎皮纳斯大学,进化和自然界——由残雪。6109年邮政,CEP 13083 - 970, SP、巴西坎皮纳斯。
2多学科生物和农业化学研究中心,由坎皮纳斯大学,Av。亚历山大•Cazelatto 999年槟榔,CEP 13148 - 218, Paulinia, SP,巴西。
收到日期:06/08/2015接受日期:22/12/2015发表日期:18/01/2016
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的丙型肝炎病毒(黄家人,Hepacivirus属)代表全世界的一个主要公共卫生问题,它负责慢性感染在人类身上,可以开发肝硬化和肝细胞癌。这种病毒并不复制有效地在细胞培养和动物,牛病毒性腹泻病毒(BVDV)作为代理模型筛选抗病毒活性的检测,和作用机理分析。从海洋无脊椎动物和微生物分离,我们准备提取和分数,我们分离物质的评估可能的抗病毒活性。71年的测试,7个被认为是有前途的提出保护的比例超过80%。最好的抑制的结果提取Gordonia细菌产生的样本有99.9%抑制和微球菌抑制99%。此外,大多数选择的提取比例保护选择性索引值被认为是有前途的,尤其是提取的细菌Williansia (SI = 27)和Brachybacterium (SI = 39)。作用机理,大部分的承诺提取显示活动抑制细胞内复制的步骤,虽然一直在观察行动不同提取物在几个阶段的病毒复制周期。因此,各种提取突出和可能导致药物的发展,确保一个另类疗法治疗肝炎C。
丙型肝炎病毒;抗病毒药物;海洋放线菌。
的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)是黄家的一员,负责引起严重的临床疾病在人类和动物1]。这些病毒组成一个积极意义的单链RNA和膜信封2]。
BVDV病毒股票相似之处与丙型肝炎病毒生物学和基因组织(3]。他们有着高度的同源性的基因的复制和组织和策略蛋白表达(4]。
由于这些相似之处与丙肝病毒很容易在体外文化,BVDV是一种有效的替代病毒模型确定新药的潜力抗病毒活性针对丙肝病毒及其作用机理(5- - - - - -9]。
丙肝病毒感染的主要原因是人类和世界卫生组织估计,全球型肝炎病毒慢性感染约1.7亿人(10- - - - - -11]。这些患者通常不表现临床症状,直到他们演变成严重的情况下12]。这是全球一个主要公共卫生问题,因为慢性HCV感染患者患肝硬化的风险甚至是很高肝细胞癌(13]。
由于缺乏可用的疫苗和有效的治疗,有必要寻找新的化合物可以用作抗病毒和可能代表替代现有的治疗。寻找新药从自然资源已成为全球趋势14]。近年来,涉及海洋生物的研究大大促进了新发现的可能生物活性物质用于治疗(15]。这些研究表明,海洋无脊椎动物属于海绵动物,软体动物类,刺细胞动物,珊瑚虫类、棘皮类、苔藓虫门家庭来源丰富的各种生物活性代谢物(16,17]。然而,有证据表明,在许多情况下,从共生微生物活性化合物与人隔离16,18]。
菌株
用于本研究菌株保存在巴西工业和的集合环境微生物(CBMAI CPQBA,由坎皮纳斯,SP,巴西)。隔离恢复从9样品宏观的海洋生物,包括海绵Amphimedon冬青(AV);Axinella corrugata(交流);Dragmacidon试(博士);Geodia corticostylifera(GC);Mycale laxissima(毫升)和Mycale angulosa(马);的海鞘Didemnum ligulum(DL)和Didemnumsp。(DSP)和藻类海藻sp ()。宏生物收集2007年1月,在海滩地区叫普拉亚Guaeca(23149年代;45125 w),岛Toque-Toque(23151年代;45131 w)和小岛da Prainha(23151年代;45124 w),在圣Sebastiao,圣保罗,巴西,深度之间的5和10米。磨碎样品细菌菌株和0.001 g / L是消毒后氯化汞在5%乙醇,然后用消毒海水洗两次。100年整除μl (102,104和106)被接种到培养皿中包含下面描述的细菌特定的媒体之一。四种培养基补充与环己酰亚胺(50μg /毫升)被用于细菌隔离:玉米,TSA, M1(可溶性淀粉10 g / L,酵母提取物4 g / L,蛋白胨2 g / L,琼脂15 g / L)和海洋琼脂(Difco™,美国)。所有媒体都准备用人造海水(ASW): KBr 0.1 g / L,氯化钠23.48 g / L, MgCl2×6小时2O 10.61 g / L, CaCl2×2 h2O 1.47 g / L,氯化钾0.66 g / L, SrCl2×6小时2O 0.04 g / L, Na2所以43.92 g / L, NaHCO30.19 g / L, H3薄30.03 g / L。琼脂板接种和孵化25°C 1 - 4周。隔离的殖民地进行2nd到30th天的电镀。串行传输后纯文化得到相同的培养基用于板macroorganism样本。维护的菌株进行甘油20%至-80°C。
原油中提取
提取来源于放线菌菌株的代谢是通过液-液分离的方法。的pre-inoculum隔离在7毫升的营养肉汤培养(Oxoid)和孵化在30°C 48 h 100 rpm。经过文化增长,总量被转移到一个包含50毫升的锥形烧瓶的营养肉汤(Oxoid)和一直在同一温度和旋转24 h, 50毫升细菌生长被转移到一个玻璃罐中包含500毫升相同的介质,在相同条件下提到的三个星期。这段时间后,增加了500毫升的乙酸乙酯,混合物在高旋转搅拌机磨碎。然后,混合搅拌在100 rpm 24 h。最初,混合物在布氏漏斗过滤包含c盐和有机相的垫是恢复在一个锥形烧瓶用分液漏斗。在水相,细胞碎片和培养基被保留,在有机相,可能的生物活性代谢物被恢复。
有机相然后过滤棉,被转移到一个圆底烧瓶。提取物中含有有机阶段集中在rotaevaporador (BuchiRotavapor r - 215)在真空37°C到完整的溶剂干燥。然后悬浮在甲醇提取,过滤棉,音量调到新管玻璃用巴斯德吸管。这些管子是导致莎凡特真空离心;模型210 Speedvac®加上SC蒸发。完整的溶剂干燥后,提取被溶解在10% DMSO中抗苗勒氏管激素和保持在4°C到使用抗病毒活性测定。
抗病毒活性测定
病毒和细胞系
Madin-Darby牛肾(MDBK)细胞在单层文化传播使用最少的必要媒介(MEM)厄尔的盐,补充10%马血清。细胞通过在1:2 1:10稀释按照常规程序用0.05%胰蛋白酶0.02% EDTA。是使用的病毒毒株BVDV歌手,一个细胞病变BVDV-1压力。
细胞的细胞毒性效应
整除的100μl悬挂被播种在96 -文化板块的密度1×105细胞/毫升。包含细胞的微量滴定板pre-incubated 24 h在37°C允许稳定之前,除了11点浓度的样品(100μl) 0.48μg /毫升(500)。最大无毒浓度(MNTC)确定观察显微镜下的细胞形态的变化在24日,48和72 h的孵化,72 h后MTT试验的结果。
MTT试验
MTT试验是一个敏感的在体外试验的测量细胞增殖或减少细胞生存能力。细胞培养在96年组织培养板。肝癌和四唑化合物(3 - 4,5-dimethylthiazol-2-yl 2, 5-diphenyltetrazolium溴)添加到井和细胞被孵化。麻省理工是降低新陈代谢活跃的细胞不溶性紫色甲瓒染料晶体。二甲亚砜被添加到井,使溶解晶体吸光度可以阅读使用分光光度计吸光度的540海里(19,20.]。分析的数据绘制细胞数量与吸光度,允许变化的定量细胞增殖。四唑还原率正比于细胞增殖率和间接表明减少细胞生存能力由病毒引起的行动。
病毒的滴定
细胞被播种在96 -文化板块的密度1×105细胞/毫升,然后孵化在37ºC在湿润的气氛中包含有限公司224 h。连续稀释的病毒股准备和细胞感染了病毒的稀释。一个额外的孵化(1 - 2天)后,细胞病变效应被记录。50%的组织培养感染剂量计算每毫升(TCID50)如前所述,里德和咀嚼21]。
抗病毒活性
抗病毒活性测定是基于抑制细胞病变效应。所有实验一式四份。简要评价抑制,细胞被播种在96 -文化板块。孵化24小时后,媒介取代100年μl MEM (E)包含提取50μg /毫升,100和50μl TCID50/50μl病毒添加一式四份,培养3天。控制包括未经处理的感染(病毒在100 TCID50/50μl),治疗没有感染(提取控制),未经处理的没有被感染。72 h后观察细胞病变效应和抗病毒活性的提取物是决定性的。量化的这个活动,我们进行MTT试验。这个试验允许细胞生存能力的量化和间接允许量化细胞提取病毒防护。
保护百分比计算使用以下公式(29):治疗(吸光度-吸光度控制病毒)/(吸光度的细胞控制-控制病毒的吸光度)×10022]。
抗病毒活性测试评估最初的单剂量MNTC对100 TCID50 /毫升的病毒。提取与活动超过80%被认为是有前途的。
确认活动,与不同浓度的提取浓度响应曲线的MTT比色100 TCID50 /毫升的病毒化验,以确定抗病毒药物浓度(EC50) 50%。
经过计算得出了EC50浓度效应曲线线性回归分析。一式三份化验的结果至少有五个提取浓度。细胞毒性的百分比计算,((A - B) /)×100 A和B的OD540治疗和治疗的细胞,分别。保护计算的百分比(−B)×100 / (C−B)],在那里,B和C表示提取物的吸光度,病毒和细胞控制,分别。每个获得的EC50值定义为有效浓度的吸光度降低50%相比细胞和病毒感染细胞的控制。每个化合物的抑制(IC50) 50%来自dose-effect-curves(图中未显示)线性回归分析后所产生的空斑实验。EC50和IC50三个化验的平均有5个化合物抑制中浓度范围。治疗指数(即。,selective index) was defined as EC50/IC50.
潜在的病毒感染周期的阶段
细胞和病毒潜伏在活跃提取物在病毒感染周期中不同阶段为了确定抗病毒作用的模式。细胞被病毒感染之前用样品预处理;病毒潜伏在样品之前感染细胞;细胞被感染病毒和孵化前样本之外。样本使用的最大无细胞毒性的浓度。随后的分析进行区分之间的活跃的提取物预处理吸附和渗透。
值表示为效价(TCID50 /μl)和抑制百分比(IP)中描述(23]。的抑制百分比计算公式:(IP) = (1 - T / C)×100,其中T是extract-treated病毒滴度的反对数和C的反对数控制(没有提取)病毒滴度。知识产权被认为是积极的在大于或等于98%。
杀病毒的行动
为了评估可能的细胞外提取病毒失活,等于卷(100μl)连续的10倍稀释的病毒悬液和MNTC提取涨跌互现,孵化1 h在37°C。每个被添加到混合细胞单层和感染滴度与控制。
统计分析
结果表示为均值±S.E.M.选择性指数(SI)是由CC50 EC50比决定。测试的统计不同影响提取物的抑制病毒复制与对照组相比,使用学生的学习任务与p≤0.05显著的结果。
细菌鉴定16 s rRNA基因测序分析
基因组DNA的提取方法获得的所述Pospiech和诺伊曼24];16 s核糖体核糖核酸基因是由使用引物PCR扩增p27f和p1401r25普遍的细菌域。50微升反应混合物包含0.4μM每个引物,0.2毫米的核苷酸(GE医疗)混合,2 U Taq DNA聚合酶(表达载体®),大约100 ng基因组DNA。聚合酶链反应(PCR)扩增是通过使用一个初始的变性步骤2分钟在94ºC,紧随其后的是10 1分钟周期在94ºC, 30年代在62和57ºC (0.5°C减少在每个周期),和2分钟在72ºC扩展,紧随其后的是另一个20周期在94ºC 1分钟,2分钟在57ºC和2分钟在72ºC,埃普多夫热循环。DNA PCR产物纯化在GFX™PCR和DNA凝胶乐队净化设备(通用电气医疗集团)是用于1000年AnalysisSystem MegaBace DNA自动测序使用DYEnamic等染料终结者循环测序工具包(通用电气医疗集团),根据制造商的建议。测序进行了使用10 f (5´GAG TTT手枪有条件现金援助GGC柠檬酸G3´);765 f (5´ATT AGA TAC有条件现金援助GGT AG3´);782 r (5´ACC gg GTATCT AAT´有条件现金援助g3)和1100 r (5´gg GTT GGG GTG GTT G 3´)引物。16 s核糖体RNA基因部分序列从隔离被组装在一个叠连群使用phr / Phrap /缺点计划(26,27]。
识别是通过比较连续的16 s核糖体RNA基因序列得到16 s rrna序列的数据参考和类型菌株数据库中可用的基因库和RDP(美国威斯康辛州核糖体数据库项目)使用BLASTn和RDP序列匹配的例程,分别。序列对齐使用CLUSTAL X程序(28)与大型软件和分析(29日]。进化距离来自sequence-pair实现大型计算的异同,用木村的DNA替换模式30.]。进行了系统发育重建使用neighbor-joining (NJ)算法(31日),用引导值计算从1000年复制运行,使用大型软件中包含的例程。获得的序列存入基因库。
抗病毒活性
抗病毒活性评估最初使用标准滴定法测定,其中放线菌提取,无毒浓度,同时被添加到细胞单层的病毒,为了选择那些对BVDV病毒与抗病毒活性。71放线菌中提取测试,七个潜在活动反对BVDV病毒,这相当于大约9.8%。
从放线菌分离提取物被认为是潜在的活性得到来自不同宏观生物。表1总结了这些提取相关信息,包括其起源、微生物鉴定和保护比例在最初的测试中。其中,最好的活动对BVDV病毒得到的提取物B204(99.9%)和B232(99.0%),分别提取Gordonia和微球菌的细菌。
表1。识别和保护活动可能提出的提取比例
值关于CC50(提取浓度能够减少50%的细胞生长),IC50(提取浓度能够抑制病毒复制50%)和生成的值之间的比例,对应选择性指数(SI)的值决定了复合活动在不损坏细胞生存能力在这项研究中,进行评估(表2)。提取物中评估,其中大部分是显示选择性指数高于四个节目,因此,被认为是潜在的活跃。提取B137和B373显示SI值相当高,如果= 27和SI = 39岁的分别,相比其他的提取值。提取B232和B177没有显示选择性指数的最小值,导致SI = 2.9和SI = 2.2,分别为(表2)。
表2。值CC50 IC50, SI的活跃和有前途的提取
活动中提取的病毒复制周期
作用机理测试表明病毒活动周期阶段提取显示。在此基础上,提取活性测定是在病毒周期的三个阶段进行直接作用在病毒粒子吸附和/或渗透,或在细胞内的复制周期阶段。结果显示不同的操作机制的各种提取评估。提取B204, B616 B137行动,防止吸附、渗透和生产新的病毒颗粒。然而,提取B232, B255 B177能够在病毒复制周期,防止这通常发生和防止产生同样数量的新的病毒颗粒。因此,通过干涉各种重复的周期阶段,活性物质能够防止感染恶化。最后,提取B173直接作用于病毒粒子,灭活。
从病毒抑制索引值(七)和抑制百分比(IP)计算在这些测试中,提取被归类为活跃(七世≥1.5和IP≥98%)或承诺(七世在1.0和1.5之间;IP在90 - 97%之间)。提取B204、B616 B137, B232 B373被认为是有前途的,因为他们有抑制百分比在90年和97年之间。
表3。作用机理的初步筛选试验的结果
由病毒引起的疾病的病原体,在人类和动物,是一个重大的经济和社会影响,强调了需要开发新的药物,由于病毒增加可用的治疗以及阻力和/或出现新的病毒的识别。
海洋环境的开发是一个有前途的战略在寻找活性化合物对传染性疾病(32]。除了其独特的结构、海洋天然产物有非凡的多样性的分子靶点的选择性、离子通道、酶、微管,DNA,溶酶体,钙调蛋白、水解酶和氧化应激诱导和免疫系统调制。这大大增加了这些分子的药理和治疗潜在的(33]。
新药的发现,这些现有的适应,对病毒耐药中发挥着关键作用。数以百计的已经从海洋生物中分离出的化合物和评估它们的药理特性。他们中的一些已经商业化,如无环鸟苷、阿糖腺苷、阿糖胞苷和齐多夫定。许多化合物在临床前和临床测试(avarol和cyanovirin-N)。然而,很少有人从海洋细菌的环境中,获得包括EPS-1和EPS - 2,从地衣芽孢杆菌分离和Geobacillus thermodenitriA¯¬罐,分别从深海细菌和Macrolactin、孤立。然而,有几个孤立的化合物从藻类和海洋海绵与艾滋病抗病毒活性,HSV,疱疹病毒(32]。在这项研究中,通过对BVDV抗病毒活性测试,七个分离放线菌海洋生物提取物被认为是潜在的承诺,对应总数的9.8%提取分析。这些提取物被认为是潜在的承诺,因为他们表现出对病毒细胞保护超过80%在50μg /毫升浓度(表1)。然而,这个活动可以增加测试通过使用每个提取的最大无毒浓度。此外,在这项研究中,我们测试了放线菌原油提取和活性物质隔离可以增强对BVDV的活动。因此,这些提取物显示出巨大的潜力为确定活性物质对病毒。
最近的研究导致了新的放线菌不同的隔离海洋环境。他们生产不同类型的新的次生代谢产物,其中有许多生物活动和有潜力开发新治疗剂。海洋放线菌因此,是一个丰富的来源,但仍然小的次生代谢产物的发现探索治疗感兴趣(34]。我们认为潜在的活跃,根据保护比例,在比色测定,从殖民地提取生产的微球菌(和b149 b232 - 99% - 86%), Williansia (b137 - 91%);Gordonia (b204 - 99.9%);Janibacter (B255 25 - 93%);Brachybacterium (B373 - 86%)和Nocardioides (B177 - 81%)。其中,最好的活动是获得微球菌(99%)和Gordonia(99.9%)样品。这些微生物很少分析他们的生物活性。
所有这些提取物我们决定关于MNTC价值(表2)。MNTC值的最大浓度的提取可以在不损坏细胞生存能力。这个阶段提取生物活性的评估是至关重要的,因为病毒使用细胞复制,因此,它应该确保他们找到合适的条件乘法(14]。因此,有关抗病毒活性的有前途的化合物应该活动可行性和/或病毒复制,而不干扰细胞生理学。原油中提取测试这个工作,B137 MNTC值最高(500μg /毫升);因此,该提取没有毒性,即使在高浓度使用。
值CC50 IC50,选择性指数计算为每个提取、和SI值等于或高于4抗病毒活性被认为是可行的。提取B137、B204 B255, B373 B149显示,如果高于4 (表2)。
我们还进行了初步测试各种提取物对BVDV的作用机理。这些测试表明在哪个阶段提取显示活动在病毒直接作用的病毒粒子,在吸附过程中,渗透或在细胞内的复制周期阶段。
在这个阶段,我们提出的抑制百分比计算每个提取的最大活动阶段。文章的节选B204 B137显示IP等于97%;B616, B232 B373显示IP等于90%和其他人显示IP等于83%。考虑到在其他阶段提取也展示了一些活动,保护这个值初始值的百分比不同,因为这个计算只考虑阶段有最高的活动(IP)最高,和保护计算百分比,同时整个活动被认为是。
三种提取物预处理测试中非常活跃,其中两个,提取B204 B616,行动在病毒吸附和提取B137行动中渗透。通过阻止BVDV吸附或渗透,提取能够防止病毒复制周期,因为这些是初始阶段,没有的病毒粒子不能复制本身内的细胞产生新的病毒颗粒。这样就可以保证治疗效果,因为感染新的细胞在感染后病毒颗粒不断释放。活性物质,因此,干预感染进展的能力。
提取B232, B255 B177能够采取行动在细胞内的复制周期BVDV的阶段。他们可能会因此有干涉核衣壳涂料,在RNA的翻译,或者在不同阶段参与新的病毒颗粒的形成。通过在不同的细胞内复制周期的阶段,活性物质可以防止感染恶化。
提取B373直接作用于病毒粒子,从而防止吸附、渗透和生产新的病毒颗粒。如果这些提取活性物质能够在一个适当的时期内保持血液中的生物利用度,他们也能够防止感染的进展,因为它们可能防止释放病毒颗粒,这些不再能够吸附,穿透细胞和复制。
在这一研究阶段,提取测试最大无毒浓度,从浓度发现,我们决定病毒抑制指数和抑制百分比。抑制百分比显示不同的保护值百分比在初始测试。这是由于使用不同浓度的两个测试,以及使用不同的方法来确保每个阶段的这项研究的目标。
这些提取,因此,代表药物发展的一个重要来源,除了上述的活动,他们表现出抑制BVDV行动和一个伟大的能力,,根据以往的研究,我们可以推断他们也能够抑制丙肝病毒的活动,这可能是证明了这种病毒的具体测试。
还需要进一步的研究来达到这些活性物质的提取和识别细节的表现。其他提取物被认为是有前途的也应该通过物质分离和隔离程序可以检查这活动更容易。他们显示了他们潜在的开发另类疗法治疗感染世界上如此重要。
孤立的微生物的海洋生物,我们生产提取包含化合物能够抑制BVDV的行动,丙肝病毒的模型。71测试提取,七个被选中。他们中的大多数有选择性指数高于四,这决定了他们的生存能力继续实验。这些提取物能够在几个阶段参与病毒复制,和42.8%的人活跃在预处理测试;42.8%是活跃在后处理测试和14.2%是由病毒粒子活性失活。因此,在很多方面,他们已被证明能够抑制感染恶化。
这项研究是好心的支持的基础研究支持圣保罗的状态(FAPESP,必须占州政府赠款2009/53320-7)。她曾Konecny科恩要感谢CNPq(国家科学和技术发展委员会)的博士后奖学金(503259/2011-1)。
