研究与评论:微生物学与雷竞技苹果下载生物技术杂志
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朱莉安娜·克里斯蒂娜·圣地亚哥·巴斯托斯1， Cláudia比阿特丽斯·阿方索·德·梅内塞斯2， Fabiana Fantinatti-Garboggini2， Marina Aiello Padilla1，克拉丽斯·韦斯·阿恩斯1Luciana Konecny Kohn1＊
1实验室病毒学，系遗传学进化与生物制剂，坎皮纳斯大学- UNICAMP, Cx。邮政6109,CEP 13083-970，坎皮纳斯，SP，巴西。
2坎皮纳斯大学生物和农业化学研究多学科中心- UNICAMP, Av. Alexandre Cazelatto, 999, Betel, CEP 13148-218, Paulínia, SP，巴西。
收到日期:06/08/2015接受日期:22/12/2015发表日期:18/01/2016
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的丙型肝炎病毒(黄病毒科，肝病毒属)是世界范围内的一个主要公共卫生问题慢性感染在人类中，可以发展到肝硬化而且肝细胞癌．由于这种病毒在细胞培养和动物体内不能有效复制，牛病毒性腹泻病毒(BVDV)被用作抗病毒活性筛选试验和作用机制试验的替代模型。从海洋无脊椎动物及其分离的微生物中，我们制备了提取物和馏分，并分离出物质以评估其可能的抗病毒活性。在71个测试中，有7个被认为是有希望的，其保护率超过80%。以高氏菌和微球菌提取物的抑菌效果最佳，分别为99.9%和99%。此外，根据保护百分比选择的大部分提取物都表现出了很好的选择性指数，尤其是威氏菌(SI=27)和短链杆菌(SI=39)的提取物。在作用机制上，大多数有前景的提取物表现出抑制细胞内复制步骤的活性，尽管不同提取物在病毒复制周期的几个阶段都有作用。因此，各种提取物脱颖而出，可能会导致药物的发展，以确保治疗的替代疗法肝炎C。
丙型肝炎病毒;抗病毒药物;海洋放线菌。
的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)是黄病毒科的一员，可引起人类和动物的重大临床疾病[1］．这些病毒由单链阳性RNA和膜包膜组成[2］．
BVDV病毒在生物学和遗传组织方面与丙型肝炎病毒有相似之处[3.］．它们在基因组组织和复制策略方面具有高度的同源性蛋白表达［4］．
由于这些与丙型肝炎病毒的相似之处，它很容易在体外BVDV是一种有效的替代病毒模型，可用于识别有潜力的新药抗病毒活性抗丙型肝炎病毒及其作用机制[5-9］．
丙肝病毒感染是全球人类肝炎的主要原因，世界卫生组织估计，大约1.7亿人感染了丙肝病毒[10-11］．这些病人通常在病情发展为严重时才会出现临床症状[12］．这是全球范围内的一个重大公共卫生问题，因为慢性丙肝感染患者发展为肝硬化甚至肝硬化的风险很高肝细胞癌［13］．
鉴于缺乏可用的疫苗和有效的治疗方法，有必要找到可以用作抗病毒药物的新化合物，并可能代表现有治疗方法的替代方案。寻找新药从自然资源中获取资源已成为全球趋势[14］．近年来，涉及海洋生物的研究为发现新的潜在生物做出了重大贡献生物活性物质作治疗用途[15］．这些研究表明，孔虫科、软体动物科、刺胞科、珊瑚虫科、棘皮科和苔藓虫科的海洋无脊椎动物是多种生物活性代谢产物的丰富来源[16，17］．然而，有证据表明，在许多情况下，从它们中分离出的活性化合物来自共生微生物[16，18］．
菌株
本研究中使用的菌株保存在巴西的工业和环境微生物(CBMAI, CPQBA, UNICAMP, Campinas, SP，巴西)。这些分离株是从包括海绵在内的9个海洋大型生物样本中提取的Amphimedon冬青(AV);Axinella corrugata(交流);Dragmacidon试(博士);Geodia corticostylifera(GC);Mycale laxissima(毫升)和Mycale angulosa(马);的海鞘韧带(DL)和Didemnumsp. (DSP)和藻类海藻sp()。大型生物于2007年1月在名为Praia的海滩地区收集Guaecá (23149S;45125W)，伊尔哈Toque-Toque (23151S;45131W)和Ilhota da Prainha (23151S;45124W)，在巴西圣保罗São Sebastião, São，深度在5到10米之间。用0.001 g/L氯化汞在5%乙醇中消毒后，用消毒海水冲洗两次，分离出菌株。100 μl (10－2, 104和106)接种到含有下面所述的一种细菌特异性培养基的培养皿中。采用添加环己酰亚胺(50 μg/ml)的4种培养基进行细菌分离:GPY、TSA、M1(可溶性淀粉10 g/L、酵母浸膏4 g/L、蛋白胨2 g/L、琼脂15 g/L)和海洋琼脂(Difco™，USA)。采用人工海水(ASW)配制培养基:KBr 0.1 g/L, NaCl 23.48 g/L, MgCl2×6小时2O 10.61 g/L, CaCl2×2 h2O 1.47 g/L, KCl 0.66 g/L, SrCl2×6小时2O 0.04 g/L, Na2所以43.92 g/L, NaHCO3.0.19 g/L, H3.薄3.0.03 g / L。接种琼脂板，25℃孵育1-4周。菌落的隔离是从2nd到30岁th电镀日。连续转移后获得纯培养培养基用于大型生物样品的装盘。菌株在-80°C的20%甘油中进行维持。
原油中提取
采用液-液分离方法，从该放线菌株的代谢中提取提取液。预接种菌株在7 ml的营养液(Oxoid)中培养，在30°C下以100 rpm的速度孵育48小时。培养生长后，将总体积转移到含有50 ml营养肉液(Oxoid)的Erlenmeyer烧瓶中，并在相同的温度和旋转下保持24小时。再次，将50 ml细菌生长转移到含有500 ml相同培养基的玻璃罐中，在相同的条件下保持三周。在此期间之后，加入500毫升乙酸乙酯，并在搅拌器中以高转速搅拌混合物。然后，以100转/分的速度搅拌混合物24小时。最初，混合物在含有硅灰石垫的Buchner漏斗上过滤，然后使用分离漏斗在Erlenmeyer烧瓶中回收有机相。在水相中，保留细胞碎片和培养基，在有机相中，回收可能具有生物活性的代谢物。
有机相然后通过棉花过滤并转移到圆底烧瓶中。有机相中所含的提取物在37°C的真空中在旋转蒸发器(BuchiRotavapor R-215)中浓缩，直到完全溶剂干燥。然后将提取物悬浮在甲醇中，用棉花过滤，用巴斯德移液管将体积转移到新的玻璃管中。这些管子被引到莎凡特真空离心机;型号210A Speedvac®加上蒸发的SC。完全溶剂干燥后，用10% DMSO在AMH介质中溶解，4℃保存，直到用于抗病毒活性测定。
抗病毒活性测定
病毒和细胞系
Madin-Darby牛肾(MDBK)细胞在含有Earle 's盐的微量必需培养基(MEM)中单层培养，并添加10%马血清。使用0.05%胰蛋白酶和0.02% EDTA，按常规程序以1:2至1:10稀释传代细胞。所使用的病毒株是BVDV Singer，一种细胞病变BVDV-1株。
细胞毒性作用
以1 × 105个细胞/ml的密度，每孔100 μl悬液接种于96孔培养板中。将含有细胞的微量滴度板在37℃下预孵育24小时，使其稳定，然后以11种浓度(500 ~ 0.48 μg/ml)加入(100 μl)样品。通过观察培养24、48、72 h细胞的形态变化，在显微镜下测定最大无毒浓度(MNTC)， 72h后用MTT法测定结果。
MTT试验
MTT法是一种灵敏的测定方法在体外测定细胞增殖或细胞活力下降的方法。细胞在96孔组织培养板中培养。将四唑化合物MTT(3-[4,5 -二甲基噻唑-2-基]- 2,5 -二苯基溴化四唑)加入孔中并培养细胞。MTT被代谢活性细胞还原为不溶性紫色甲醛染料晶体。然后将二甲亚砜添加到孔中，使晶体溶解，因此可以使用a读取吸光度分光光度计在540 nm的吸光度[19，20.］．通过绘制细胞数量与吸光度的关系来分析数据，允许定量的变化细胞增殖．四唑还原率与细胞增殖率成正比，间接表明病毒作用引起的细胞活力降低。
病毒滴定
将细胞以1 × 105个细胞/ml的密度接种于96孔培养板中，然后在37ºC含CO的潮湿气氛中培养2连续稀释病毒液，用稀释后的病毒感染细胞。在额外的孵育(1-2天)后，记录细胞病变效应。每毫升50%组织培养感染剂量(TCID50)的计算方法如Reed和Münch所述[21］．
抗病毒活性
抗病毒活性的测定是基于对细胞病变效应的抑制。所有实验均为四重复。简单地说，为了评估抑制作用，将细胞种在96孔培养板中。孵育24 h后，换取含50 μg/ml提取液的MEM(E) 100 μl，加入100 TCID50/50 μl病毒各50 μl，四重复孵育3 d。对照组为未处理感染者(病毒浓度为100 TCID50/50 μl)、未处理感染者(提取物对照组)和未处理感染者。72 h后观察细胞病变作用，并测定提取液的抗病毒活性。为了定量该活性，我们进行了MTT试验。该方法可以定量细胞活力，并间接定量细胞提取物对病毒的保护作用。
用以下公式(29)计算保护率:(处理后的吸光度-对照病毒的吸光度)/(细胞对照的吸光度-对照病毒的吸光度)× 100 [22］．
最初用单剂量MNTC对100 TCID50/ml病毒进行抗病毒活性测试。活性大于80%的提取物被认为是有前景的。
为确定活性，采用MTT法测定了100 TCID50/ ml病毒存在时不同浓度提取物的浓度响应曲线，以确定50% (EC50)时的抗病毒浓度。
由浓度效应曲线经线性回归分析计算EC50。结果是从至少五种提取物浓度的三次试验中获得的。细胞毒性百分比计算为[(A - B)/A] × 100，其中A和B分别为未处理细胞和处理细胞的OD540。保护百分比计算为[(A−B) × 100/(C−B)]，其中A、B和C分别表示提取物、病毒和细胞对照的吸光度。每个获得的EC50值定义为与细胞和病毒对照相比，将感染细胞的吸光度降低到50%的有效浓度。每种化合物的50%抑制(IC50)是由线性回归分析后的斑块试验产生的剂量-效应曲线(未显示)得出的。EC50和IC50是化合物抑制范围内五种浓度的三次测定的平均值。治疗指标(即选择性指标)定义为EC50/IC50。
病毒感染周期的潜在阶段
在病毒感染周期的不同阶段用活性提取物培养细胞和病毒，以确定抗病毒作用的模式。病毒感染前用样品预处理细胞;病毒在感染细胞前与样本孵育;在加入样品之前，将细胞感染病毒并进行培养。样品在最大无细胞毒浓度下使用。随后进行了实验，以区分预处理中的活性提取物是吸附还是渗透。
用滴度(TCID50/μl)和抑制率(IP)表示，如[23］．抑制率的计算公式为:(IP) = (1 - T/C) × 100，其中T为经提取物处理的病毒滴度的反对数，C为对照(不含提取物)病毒滴度的反对数。IP大于或等于98%时为阳性。
杀病毒的行动
为了评估提取物可能的细胞外病毒灭活，将等体积(100 μl)的10倍连续稀释的病毒悬液与提取物的MNTC混合，在37°C下孵育1 h。然后将每种混合物添加到细胞单层，并将感染滴度与对照组进行比较。
统计分析
结果以均数±S.E.M.表示，选择性指数(SI)由CC50与EC50之比确定。用Student 's t检验比较各提取物对病毒复制的抑制作用与对照组有统计学差异，p≤0.05为显著性。
16S rRNA基因测序细菌鉴定
通过Pospiech和Neumann描述的提取方法获得基因组DNA [24];16 s核糖体核糖核酸采用引物p27f和p1401r [25]为通用细菌域。50微升的反应混合物含有0.4 μM的引物，0.2 mM的dNTP (GE Health Care)混合物，2u Taq DNA聚合酶(Invitrogen®)，以及大约100ng的基因组DNA。聚合酶链式反应(PCR)扩增是在Eppendorf热循环器中进行的，初始变性步骤为94ºC 2分钟，随后是94ºC 1分钟的10个循环，62和57ºC 30秒(每个循环减少0.5°C)， 72ºC 2分钟的扩展，然后是94ºC 1分钟、57ºC 2分钟和72ºC 2分钟的20个循环。根据制造商的建议，PCR DNA产物在GFX™PCR DNA上纯化，并使用凝胶带纯化试剂盒(GE HealthCare)在MegaBace DNA分析系统1000中使用DYEnamic ET染料终止循环测序试剂盒(GE HealthCare)进行自动测序。测序使用10f(5´GAG TTT GAT CCT GGC TCA G3´);765f(5´ATT AGA TAC CCT GGT AG3´);782r(5´ACC AGG GTATCT AAT CCT GT3´)和1100r(5´AGG GTT GGG GTG GTT G 3´)引物。利用phred/Phrap/CONSED程序将分离株的16S核糖体RNA基因部分序列组装在一个contig中[26，27］．
分别使用BLASTn和RDP序列匹配例程，将获得的16S核糖体RNA基因序列与GenBank和RDP(美国威斯康星州核糖体数据库项目)数据库中可用的参考菌株和类型菌株的16S核糖体RNA序列数据进行比较，从而实现鉴定。使用CLUSTAL X程序对序列进行比对[28]并用MEGA软件进行分析[29］．进化距离来源于MEGA中使用Kimura的DNA替代模型计算的序列对不相似性[30.］．系统发育重建使用邻居连接(NJ)算法[31]，使用MEGA软件中包含的例程，从1000次重复运行中计算出引导值。获得的序列存入GenBank。
抗病毒活性
抗病毒活性最初使用标准滴定法进行评估，其中以无毒浓度的放线菌提取物与病毒同时添加到细胞单层，以选择对BVDV病毒具有一定抗病毒活性的提取物。在测试的71种放线菌提取物中，有7种对BVDV病毒具有潜在活性，约占9.8%。
被认为具有潜在活性的提取物是从不同的宏观生物中分离出来的放线菌中获得的。表1总结了有关这些提取物的信息，包括它们的来源，微生物鉴定和初步试验中提出的保护百分比。其中，高氏菌提取物B204(99.9%)和微球菌提取物B232(99.0%)对BVDV病毒的抑制活性最佳。
表1。潜在活性提取物的鉴定和保护百分比
有关CC50(能够降低50%细胞生长的提取物浓度)，IC50(能够抑制50%病毒复制的提取物浓度)的值以及它们之间的比值的结果值，对应于选择性指数(SI)，该值决定了化合物的活性，而不会对其造成损害细胞生存能力，在本研究中进行了评估(表2)．在评价的提取物中，大部分的选择性指数高于4个，因此被认为是潜在活性的。与其他提取物相比，提取物B137和B373的SI值较高，分别为27和39。萃取物B232和B177的选择性指数均未达到最小值，SI分别为2.9和2.2 (表2)．
表2。活性提取物的CC50、IC50和SI值
提取液在病毒复制周期中的活性
作用机制测试表明该提取物在病毒周期的哪个阶段显示活性。在此基础上，在病毒周期的三个阶段进行了提取物活性测定，要么是在吸附和/或渗透期间直接作用于病毒颗粒，要么是在复制周期的细胞内阶段。结果表明，不同提取物的作用机制不同。提取物B204、B616和B137具有抑制吸附、渗透和产生新病毒颗粒的作用。然而，提取物B232, B255和B177能够在病毒复制周期内发挥作用，阻止正常发生，并阻止其产生相同数量的新病毒颗粒。因此，通过干预不同的复制周期阶段，活性物质能够阻止感染的进展。最后，提取物B173直接作用于病毒颗粒，使其失活。
从这些试验中计算的病毒抑制指数(VII)和抑制百分比(IP)，将提取物分为活性(VII≥1.5和IP≥98%)和有希望(VII在1.0和1.5之间;IP在90%到97%之间)。其中B204、B616、B137、B232和B373的抑菌率在90 ~ 97之间，具有较好的抑菌效果。
表3。作用机理初步筛选试验结果
病毒病原体在人类和动物中引起的疾病是一项重大的经济和社会影响，由于病毒对现有治疗方法的耐药性增强，以及新病毒的出现和/或鉴定，因此突出表明需要开发新的药物。
海洋环境开发是寻找抗传染病活性化合物的一种有前途的策略[32］．海洋天然产物除了其独特的结构外，还具有极具选择性的分子靶点的多样性，如离子通道、酶、微管、DNA、溶酶体、钙调蛋白，蛋白酶体和氧化应激诱导与免疫系统调节。这大大增加了这些分子的药理和治疗潜力[33］．
新药的发现和对现有药物的改造在对抗病毒耐药性方面发挥着关键作用。从海洋生物中分离出数百种化合物，并对其药理特性进行了评估。其中一些药物已经上市，如阿昔洛韦、阿糖腺苷、阿胞苷和齐多夫定。许多化合物正在进行临床前和临床试验(阿瓦洛尔和氰毒素n)。而从海洋细菌环境中分离得到的EPS-1和EPS- 2分别从地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)和地质杆菌(Geobacillus thermodenitriﬠcans)中分离得到，Macrolactin A则从深海细菌中分离得到。然而，从藻类和海绵中分离出的一些化合物对艾滋病、HSV、疱疹病毒具有抗病毒活性[32］．在本研究中，通过对BVDV的抗病毒活性测试，从海洋生物中分离出7种放线菌提取物，被认为有潜力，占总分析提取物的9.8%。这些提取物被认为具有潜在的前景，因为它们在50 μg/ml浓度下对病毒的保护作用超过80% (表1)。然而，通过使用每种提取物的最大无毒浓度，可以在测试中增加这种活性。此外，本研究还测试了放线菌粗提物和活性物质分离对BVDV活性的增强作用。因此，这些提取物显示出很大的潜力，以确定活性物质对抗病毒。
近年来的研究已从不同的菌株中分离出新的放线菌海洋环境．它们产生不同类型的新型次生代谢产物，其中许多具有生物活性，具有开发新型治疗剂的潜力。海洋放线菌因此，是一个丰富的来源，但仍很少探索具有治疗意义的次生代谢物的发现[34］．根据比色法显示的保护百分比，我们认为微球菌菌落(B232-99%和B149-86%)、威氏菌(B137-91%)的提取物具有潜在活性;Gordonia (b204 - 99.9%);Janibacter (B255 75:25 - 93%);短链杆菌(B373 - 86%)和诺卡菌(B177 - 81%)。其中，微球菌(99%)和戈登菌(99.9%)的活性最好。这些微生物的生物活性很少被分析。
对于所有这些摘录，我们确定了关于MNTC (表2)。MNTC值是可以在不损害细胞活力的情况下使用提取物的最大浓度。这一阶段对于评估提取物的生物活性至关重要，因为病毒利用细胞进行复制，因此，应确保它们找到适当的增殖条件[14］．因此，具有抗病毒活性的化合物应在不干扰细胞生理的情况下，对病毒的生存能力和/或病毒复制具有活性。在本工作所测粗提物中，B137的MNTC值最高(500 μg/ml);因此，该提取物即使在高浓度使用也没有毒性。
计算每种提取物的CC50、IC50和选择性指数，SI值等于或大于4被认为具有抗病毒活性。提取物B137、B204、B255、B373和B149 SI均高于4 (表2)．
我们还对各种提取物对BVDV的作用机制进行了初步试验。这些测试表明提取物在哪个阶段表现出抗病毒活性，或直接作用于病毒颗粒，或在吸附、渗透或在复制周期的细胞内阶段。
在这一阶段，我们计算了各提取物在最大活性阶段的抑制百分比。提取物B204和B137的IP值为97%;B616、B232、B373的IP为90%，其余为83%。考虑到其他阶段提取物也表现出一定活性，因此初始值的保护百分比与此值不同，因为此计算仅考虑活性最高(IP最高)的阶段，计算保护百分比时，同时考虑整个活性。
3个提取物在预处理试验中具有活性，其中提取物B204和B616在病毒吸附过程中起作用，提取物B137在渗透过程中起作用。通过阻止BVDV吸附或渗透，该提取物能够阻止任何病毒复制周期，因为这些都是初始阶段，没有这些阶段，病毒颗粒就无法在细胞内复制自己并产生新的病毒颗粒。这确保了治疗效果，因为感染新细胞后病毒颗粒会不断释放。因此，活性物质能够干预感染进程。
提取物B232, B255和B177能够在BVDV复制周期的细胞内阶段起作用。因此，他们可能干预了核衣壳在RNA翻译中，或在新病毒粒子形成的各个阶段。通过在复制周期的不同细胞内阶段工作，活性物质能够防止感染进展。
提取物B373直接作用于病毒颗粒，从而阻止新的病毒颗粒的吸附、渗透和产生。如果这些提取的活性物质能够在血液中保持足够的生物利用度，它们也能够阻止感染的进展，因为它们可以阻止释放的病毒颗粒，并且这些病毒颗粒不再能够吸附、穿透细胞和复制。
在本研究阶段，我们测试了提取物的最大无毒浓度，从发现的滴度，我们确定了病毒抑制指数和抑制百分比。在初始试验中，抑制率显示出不同的保护率值。这是由于在两个试验中使用了不同的浓度，以及使用了不同的方法来确保本研究每个阶段的目标。
因此，这些提取物是药物开发的重要来源，除了上述活性外，它们还表现出很强的抑制BVDV活性的能力，由此我们可以推断，根据以往的研究，它们也具有抑制HCV活性的能力，这可能是通过对该病毒的特定测试来证明的。
还需要进一步的研究来了解这些提取物中的活性物质，并详细确定它们的性能。其他被认为有希望的提取物也应该经过物质分离和分离程序，以便可以检查这种增强活性。他们都表现出了发展的潜力另类疗法治疗世界上如此重要的传染病。
在从海洋生物中分离出的微生物中，我们提取了含有能够抑制BVDV作用的化合物，这是HCV的模型。在71个测试提取物中，筛选出7个。大多数选择性指数大于4，这决定了它们继续实验的可行性。这些提取物可在多个阶段参与病毒复制，其中42.8%的提取物在预处理试验中具有活性;42.8%在治疗后检测中有活性，14.2%在病毒颗粒灭活中有活性。因此，在许多方面，它们已被证明能够抑制感染的进展。
本研究得到了São Paulo州研究支持基金会(FAPESP;赠款2009/53320-7)。Luciana Konecny Kohn感谢CNPq(国家科学技术发展委员会)提供博士后奖学金(503259/2011-1)。
