研究和评论:微生物学和雷竞技苹果下载生物技术杂志》上
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P - ISSN: 2347 - 2286
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1天津工业生物系统重点实验室和生物工艺工程、系统微生物生物技术重点实验室,天津工业生物技术研究所、中国科学院300308年天津,中国
2生物技术学院,天津科技大学,天津300222年,中国的公关
收到日期:08/09/2015接受日期:08/01/2016发表日期:01/02/2016
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Ergothioneine(废气温度)可以由菌丝蘑菇通过深层发酵。在这项研究中,我们开发了一个简单的方法提取胞内废气温度。热水被选为适当的溶剂萃取过程中以其高安全性和有效性。单因素实验和响应面方法(RSM),水菌丝的比率的影响,温度、搅拌速度、处理时间对提取过程进行调查和优化。结果表明,水的比例的条件菌丝24.5:1 (ml: g),温度为87.5°C,处理时间10分钟和搅拌速度的200 rpm,细胞内的废气温度的提取比例高达97.1%,该方法简单快速,因此它可以应用于工业化方便。此外,这项研究表明,少量的细胞外废气温度观察积累在发酵的整个阶段,提出了影响细胞内的废气温度提取和促进废气温度是有用的生物合成。
Ergothioneine;提取;优化;响应面方法;积累;发酵
Ergothioneine(废气温度)是一种L-histidine-derivative代谢物,各种各样的细菌和真菌可以合成废气温度(1),而植物和哺乳动物吸收它分别从土壤和饮食2,3]。硫醇基存在的原子位于C2的咪唑环,它具有抗氧化能力,从而涉及到多个生理过程在高等生物,如清除强氧化剂(4],螯合二价金属阳离子[5),过滤紫外线(6),调节氧化还原反应和细胞生物能疗法(7,8]。此外,由于拥有稳定的属性thione结构和水溶性,提出废气温度已经广泛的应用在许多领域,如医药(9),功能性食品(10)、化妆品(11)等等。
在最近的研究中,蘑菇被发现废气温度的主要来源,因此具有较高的抗氧化能力(12]。与化学合成和bio-extraction相比,使用菌丝食用菌生产废气温度的淹没发酵在高收益的角度有很大的优势,成本低,易于工业化和安全的产品,它可以是一个有前途的战略工业生产的废气温度。废气温度是细胞内代谢物检测,制备、净化和废气温度的应用,主要步骤是从菌丝提取废气温度。Dubost等使用80%的乙醇提取胞内废气温度从冷冻蘑菇粉60°C (13),后来,轻微的修改,70%乙醇与二硫苏糖醇、甜菜碱和2-mercapto-1-methyl咪唑添加被用作溶剂提取胞内菌丝的废气温度,随后,与菌丝提取物溶液处理声波降解法(14- - - - - -16]。先后拜会了由甲醇等从蘑菇粉中提取胞内废气温度的温度条件25°C, 150 rpm的风潮和处理时间的24小时12]。周等提取胞内废气温度从双孢菇通过以下程序:蘑菇干首先切碎,然后破成碎片,过滤后,氢氧化钠溶液pH值为8.0添加提取废气温度为20分钟,最后,与菌丝提取溶液被加热到100°C 6分钟(17]。
强调以前提取的过程用于废气温度测定、有机溶剂和复杂的程序都使用不合适的工业化废气温度制备的高成本和安全问题的原因。在包的研究等。18),热水的方法在95°C 1 h用于从废物中提取胞内废气温度固体培养基菇中孢子培养,而没有进一步优化和提取参数,处理时间1 h,材料是不同的从菌丝收获形式发酵肉汤。此外,虽然产生的废气温度蘑菇通常被认为是一个细胞内代谢物没有相关报道,在深层发酵的废气温度累积规律。本文开发了一个简短的提取方法适合工业化的废气温度的准备,和调查废气温度在深层发酵菌丝体的积累规律平菇。
材料
应变:生产废气温度应变平菇CGMCC No.6232,菌丝体与子实体分离,保持在PDA上。
媒介
PDA:马铃薯葡萄糖琼脂(Becton, Dickinson正欲;火花,医学博士,美国)。
菌丝培养基:30 g / L玉米面粉,15 g / L大豆餐,3 g / L KH2阿宝4,1.5 g / L MgSO4h·72O和80 U / Lα-amylase。
发酵培养基:50 g / L甘油,35 g / L酪蛋白胨,3 g / L KH2阿宝4和1.5 g / L MgSO4h·72O。
化学成分:L-Ergothioneine(纯度≥98%)购买的恩佐生命科学国际有限公司;甲醇的高效液相色谱级购买从Bonna-Agela技术(天津);高效液相色谱级的醋酸从Kermiou购买化学试剂有限公司(天津),分别;甲醇、乙醇、丙酮、氢氧化钠、甘油和其他化学试剂的分析纯化学试剂购自国药控股有限公司(上海,中国)。
装置:Chest-Type孵化器瓶(IS-RDH1、水晶技术和产业,Inc .)、美国);发酵罐(生物抑制剂D-DCU 75 L、缝匠肌、德国);高效液相色谱法(美国安捷伦科技安捷伦1260),水浴(TW 20、温泉浴、德国);电磁搅拌器(WIGGENS WHMIXdrive 6日,德国);Amicon ultra - 0.5毫升离心过滤装置(Ultracel-3 K,默克公司,德国)。
方法
菌丝发酵肉汤的准备:7天的文化在PDA培养基上菌丝25°C是切成大约1厘米2并用于接种发酵液体培养基。4.5天的菌丝文化生长500毫升和150毫升消毒摇动烧瓶培养基在25°C和150 rpm。对发酵罐培养,5% (v / v)的菌丝文化是用作发酵培养液。消毒的45 L发酵罐中发酵培养基和培养在25°C。最初的曝气和搅拌速度分别为10 L / min和150 rpm,做水平维持在约30%饱和度通过调整在整个培养期间曝气和搅拌速度。采集标本每12 h,分析相关参数。14天的发酵后,菌丝发酵肉汤是收获。
制备细胞外和细胞内的废气温度的样品:菌丝发酵肉汤的滤液后,滤液液体和菌丝分别收集,然后是菌丝和去离子水冲洗三次,提取在不同预设定条件。滤液和提取液离心机在12840×g (4°C)与离心过滤装置10分钟,之后获得的上层清液过滤离心后的发酵肉汤和菌丝提取的水是细胞外和细胞内的废气温度样本分别进行分析。
量化的废气温度:废气温度浓度定量确定了高效液相色谱法(19]。分析是在两个反相C18柱(Eclipse XDB-C18)每一列是4.6×250毫米,5μm粒度在串联连接。流动相为1%甲醇含有硼酸调整pH值为5.0和0.7毫升/分钟的流量。注射量是5μL列温度是25°C。紫外可见检测器配备一个波长257 nm。
细胞内的废气温度的设置对萃取率:在细胞内的废气温度提取的研究,评价因素显著影响提取胞内废气温度,其中的内容提取酒废气温度得到的条件中描述的“制备细胞外和细胞内的废气温度的样本”。热水提取和三次被用来获取内容的胞内废气温度条件如下:20的水比菌丝:1 (ml: g),搅拌速度300 rpm,温度为90°C,处理时间30分钟,三次提取。
统计分析:Origin8.5软件用于计算均值和标准差的多个测量数据和生成图表。每个值被表示为平均值±标准偏差(SD)。Mintab15和Matlab2010软件被用来响应面分析实验。
影响细胞内的废气温度的热水提取
实验评估的影响进行在细胞内的废气温度热水提取条件的方法“胞内废气温度设置对萃取率”描述与轻微的调整。在前两个步骤使用热水。在最后一步:在室温下,热水代替了相同体积的甲醇,乙醇,丙酮,去离子水分别与氢氧化钠调节pH值10.0提取细胞内的废气温度。结果所示(表1)。
表1。提取溶剂和提取时间对细胞内的废气温度的影响提取。
可以看出表1提取的第一步,废气温度浓度是109.11 mg / L,它近似98.6%的废气温度浓度三抽提过程后,很少或没有废气温度检测到在过去的两个步骤。结果是,利用热水可以完全提取胞内废气温度同时效率高。因此,我们定义内容初步提取胞内废气温度是量化的参数;热水被选为唯一提取胞内废气温度萃取溶剂。水提取胞内废气温度提取适用于商业规模制备废气温度通过大规模发酵过程由于它有利于避免经营风险,防止安全问题通过使用有机溶剂,与此同时,后续净化技术将简化和更广泛的选择的净化提供自注意但水并提取期间使用。
不同因素对细胞内的废气温度提取的影响
废气温度的工业化制备参数,如比水的菌丝,温度、搅拌速度、处理时间不仅影响细胞内的废气温度提取的效率,而且也涉及到能源消耗和准备周期,为了优化提取工艺,进行了如下的实验来评估不同的影响因素对细胞内的废气温度提取。
影响不同比例的水在胞内菌丝废气温度提取
90°C的初始温度,搅拌速度的500 rpm和处理时间30分钟,不同比例的水菌丝被设置为10:1日20:1,30日:1、40:1,50:1和60:1 (ml: g),分别。,其结果所示(图1)。
图1所示。影响不同比例的水在胞内菌丝废气温度提取。
它可以看到从图1与水菌丝的比率的增加,萃取率的细胞内的废气温度增加,后来它基本上保持常数,结果表明,当水菌丝的比率是60:1,提取胞内废气温度达到最大速度的96.9%,而60之间没有显著差异:1和20:1。由于低比例的水菌丝不能完全提取胞内废气温度,而废气温度可以稀释浓度比例高,因此对下游操作的性能产生重大影响,因此,水比菌丝与20:1被选为细胞内的废气温度提取。
不同温度对细胞内的废气温度提取的影响
与水的初始比例菌丝20:1 (ml: g),搅拌速度的500 rpm和处理时间30分钟,萃取过程的不同温度设置为50°C, 60°C, 70°C, 80°C,分别为90°C和95°C。,其结果所示(图2)。
图2。不同温度对细胞内的废气温度提取的影响。
简而言之,图2表明,萃取率的细胞内的废气温度随着温度增加,增加的最大萃取率的细胞内接近94.5%在95°C,而92.6%在80°C,这可能是由于当温度达到80°C,细胞渗透性显著增加。考虑节能和高温可能影响废气温度的稳定,80°C被选为细胞内的废气温度提取。
不同的搅拌速度对细胞内的废气温度提取的影响
与最初的水比菌丝20:1 (ml: g),温度为80°C和处理时间30分钟,不同的搅拌速度的提取过程设置为0 rpm, 100 rpm, 200 rpm, 300 rpm, 400 rpm,分别500 rpm和600 rpm。,其结果所示(图3)。
图3。不同的搅拌速度对细胞内的废气温度提取的影响。
发酵罐是主要的工业化装置的废气温度提取的废气温度制备、摇动烧瓶和发酵罐的区别在维度的角度考虑,适当的搅拌速度是需要确保传热的均匀当萃取过程是在发酵罐中执行,而没有必要工业萃取过程中准确控制搅拌速度。
不同处理时间对细胞内的废气温度提取的影响
初始水菌丝的20:1 (g:毫升),温度为80°C 200 rpm的搅拌速度和不同处理时间设置为5分钟,10分钟、20分钟,30分钟,40分钟,50分钟,60分钟、90分钟和120分钟,分别。,其结果所示(图4)。
图4。不同处理时间对细胞内的废气温度提取的影响。
此外,我们提取10分钟到120分钟时,细胞内的废气温度的萃取率没有明显的变化,所以没有必要酷迅速拥有10分钟的时间到达时,它可以长时间维持在更高的温度,这将有利于防止微生物污染在提取和减少能源冷却。
响应面分析实验
结果显示在“不同因素对细胞内的废气温度提取的影响”,在参数优化,水比菌丝和温度都是相对意义的因素对细胞内废气温度提取,为进一步优化、温度和水的比例菌丝作为独立变量,以及细胞内的废气温度的萃取率作为响应值。所示的中央设计因素和水平(表2)。
表2。中心复合设计的因素和水平。
RSM的设计和结果所示(表3)观察细胞内废气温度的最大萃取率的测试12(96.8%),最低的值是观察到测试2 (55.4%)。
表3。设计和中心合成设计的结果。
中的数据表3被minitab15软件回归分析和方差分析结果和模型可靠性总结了吗表4。二阶模型也得到Y = 93.8 - 10.98×5.92×A + B + - 14.45×6.25××B2- 9.8×B2°。
表4。回归方程的方差分析。
的F值模型和Pr值> 28.09 F表示,模型是重要的和可选择的条款,和A和B的影响细胞内的废气温度提取显著,证实了这一事实两个因素都是细胞内的废气温度提取的关键。此外,调整系数确定的R2= 91.8%)模型的表示,91.8%的变化响应模型可以解释的,所以提供适当的回归方程模型优化因素在细胞内的废气温度提取的过程。
RSM优化反应的因素
响应面和等高线图显示图5根据回归方程。从表面轮廓曲面图,方便解释两个变量之间的相互作用,并找到他们的最佳水平。
图5。响应面和等高线图互动A和B对萃取率的影响细胞内的废气温度(Y)。
也可以看到图5Y的最高价值超过97%,两个因素的最佳组件从matlab2010软件如下:温度(0.48),水比菌丝(0.45)和胞内废气温度的最大萃取率的预测是97.8%。实验值是97.1%,接近最大预测反应。这些结果证实了模型的有效性,A和B的最佳值为87.5°C和24.5:1。此外,还有大面积的预测值Y超过90%,这表明,允许轻微调整A和B的预测在最好的条件。
rp -色谱extracelular和intracelular废气温度样本
图6和Figure7显示extracelular rp -色谱和intracelular废气温度样本。
图6。产物的色谱extracelular废气温度样本。
图7。产物的色谱intracelular废气温度样本。
废气温度规律积累在深层发酵
应用参数优化的结果”响应面方法实验”,进一步研究评估研究深层发酵的废气温度累积规律。(所示的结果图8)。
图8。废气温度规律积累在深层发酵。
图8表明,在发酵过程中,总浓度废气温度迅速增长在前6天,后来它慢慢增加,达到最大值127.3 mg / L的12th的一天。细胞外的浓度废气温度增加,在3 12.0 mg / L理查德·道金斯天,虽然它基本上保持不变。在发酵结束时,细胞外废气温度的比例高达14.56%,这表明大部分的废气温度胞内积累。
结果表明,似乎存在机制调节的过程中废气温度分泌,很难解开废气温度的底层机制积累目前,流体环境或其他原因等,废气温度运输车可能提议的原因。废气温度累积规律具有重要影响生产废气温度和提取,它可能是一个主要目标为提高生产废气温度通过调节细胞渗透排泄废气温度渗透。当废气温度积累细胞外,萃取过程应该完全从发酵肉汤中提取废气温度调整包含细胞外废气温度和细胞内的废气温度。
我们开发了水提取胞内废气温度提取。适合工业化制备的废气温度由于其高安全、低投资、低污染、低能耗、操作简便、有效的和其他高的优势。
我们发现少量的弥漫废气温度在深层发酵。当调查总含量的废气温度,比例的细胞外废气温度应该考虑。此外,进一步的工作将集中于细胞渗透调节机制研究废气温度分泌和促进生产废气温度。
从自然科学基金会赞助的这项研究是天津的年轻人,中国(13 jcqnjc10100)和年轻学者的中国国家自然科学基金(31100012)。
