伤寒沙门氏菌DT104在埃塞俄比亚传统发酵乳制品Ergo和Ayib生产过程中的行为研究

摘要

在生产埃塞俄比亚天然发酵牛奶Ergo和埃塞俄比亚白软干酪Ayib过程中，对鼠伤寒沙门氏菌DT104的生长和存活进行了研究。三种不同初始接种量的DT104(高:~108 cfu mL-1;中:~106 cfu mL-1，低:~104 cfu mL-1)。在发酵0、12、24、36、48、60和72 h时提取样品，进行细菌计数和pH测量。使用脱脂发酵乳在发酵24和72小时后，在三种烹饪温度(50、60和70°C)下制作Ayib，并在烹饪0、20、40和60分钟进行采样。DT104共接种后发酵72 h乳酸菌(LAB)，尽管DT104种群数量分别下降了3.3和5.6 log cfu mL-1。在不添加LAB的对照乳中，DT104的存活率较好，发酵72 h后细胞数量仅减少0.8 log cfu mL-1。当发酵乳(在发酵后0或24小时接种或不接种LAB)在50°C下煮熟用于制作ayib时，DT104在煮熟后可存活60分钟，其存活率取决于初始接种量。在60和70°C烹饪20到40分钟之间实现了完全抑制。直接食用Ergo是不安全的。在制作ergo时，建议使用煮沸的牛奶，并通过“向后倾倒”产生的部分发酵牛奶进行发酵。对于阿伊布的制作，至少需要60°C的烹饪温度至少40分钟，以确保产品的健康。

关键字

鼠伤寒沙门氏菌DT104, Ergo, Ayib，发酵乳制品，挑战试验

简介

沙门氏菌是肠杆菌科的主要病原体之一。它是引起严重肠胃炎的病原体。尽管所有种类的沙门氏菌实际上都对人类具有致病性，鼠伤寒沙门氏菌是沙门氏菌病最常见的病因[1］．鼠伤寒沙门氏菌权威104型(DT104)是一种新近发现的沙门氏菌菌株，已成为世界范围内的一种重要病原体。这种病原体令人担忧，不仅因为它能够在包括人类在内的许多不同种类的动物中致病，而且因为它对五种常用抗生素(氨苄西林、氯霉素、链霉素、磺胺类药物和四环素)具有耐药性。[2，3.］．

虽然发酵食品通常被认为是安全的，因为发酵生物的pH值低和产生抗菌物质，但据报道，人类病原体，如大肠杆菌O157:H7、单核细胞增生李斯特菌和肠炎沙门氏菌，可以在发酵牛奶中存活和繁殖[4，5］．

不同国家报告的沙门氏菌及沙门氏菌病与牛奶及发酵奶制品的关系[6-10]，以及在埃塞俄比亚背景下缺乏信息，促使我们评估的可行性鼠伤寒沙门氏菌DT104在为Ergo(埃塞俄比亚发酵牛奶的制作和为Ayib(埃塞俄比亚白软干酪)制作脱脂发酵牛奶的发酵过程中使用挑战试验。

材料与方法

在发酵麦尔果乳和发酵阿伊布乳的发酵过程中进行了攻毒试验。

材料

本研究使用来自Boran(埃塞俄比亚zebu品种)和来自Holetta农业研究中心(埃塞俄比亚)的Boran x Friesian奶牛的复合早奶。压力鼠伤寒沙门氏菌DT104 (Ref. 02-7209 - CNR-Salm)(最初是2002年从法国分离的人类)由François-Xavier WEILL(巴斯德研究所，巴黎)慷慨提供。这种细菌对氨苄西林、链霉素、氯霉素、磺胺和四环素具有耐药性。从天然发酵的牛奶中分离出革兰氏+，过氧化氢酶-和氧化酶-的球菌和骑形乳酸菌(LAB)的混合物用于启动发酵。在进行挑战试验之前，将该LAB混合物接种在无菌牛奶中，并在室温下发酵约36小时。然后由4人小组检查该发酵牛奶的感官特性，并确认符合自然发酵牛奶的特性。

发酵

牛奶在120°C下高压灭菌15分钟，并无菌分配到无菌螺旋盖瓶中，以获得每个瓶中约200 mL的最终容量。然后，根据研究地区小农生产者的通常做法，将牛奶在环境温度(22-27°C)下发酵约72小时。DT104和LAB的活菌计数与pH(使用数字pH计测量)一起测定。

Ayib-making

在埃塞俄比亚，Ayib是用低温煮脱脂发酵牛奶制成的(图1)．在本研究中，根据研究地区的实践，使用了3种烹饪温度:50°、60°和70°C。产品保存在50、60和70°C的水浴中。在产品内部插入温度计测量产品内部温度，当达到预定内部温度后，继续烹饪60分钟。在阿易布making上进行了三次实验:

实验1:以Ergo为原料，在常温下发酵72 h制成阿伊布。DT104接种于发酵0 h的乳汁中。

实验2:环境温度下发酵24小时后制成阿伊布。DT104在发酵0 h时接种。

实验3:环境温度下发酵24小时后制成阿伊布。在烹饪开始前发酵24 h接种DT104。

在所有情况下，在开始烹饪之前，从发酵牛奶中无菌去除奶油层。

试验生物的接种和发酵的开始

DT104有三种初始接种量:高(~10⁸cfu毫升^－1)，中(~10⁶cfu毫升^－1)和低(10⁴cfu毫升^－1)．阳性对照(10⁴cfu毫升^－1)，也不使用LAB。LAB接种~10⁶cfu毫升^－1开始发酵根据微生物悬液浓度调整至Mac Farland标准，估算初始接种量。在缓冲蛋白胨水中制备悬液，这些蛋白胨水来自于在营养琼脂上过夜培养的DT104;在MRS琼脂上培养的MRS肉汤中制备悬液(在35°C下培养48小时)。

计数Dt104及实验室

在发酵实验中，在发酵0、12、24、36、48、60和72 h时提取1 mL发酵乳;在制作阿伊布实验中，在烹饪0、20、40和60 min时从每个处理组和对照组中提取1 mL或g产品。测试部分直接在含有9ml缓冲蛋白胨水(BPW) (Oxoid，英国)的试管中混合，用于DT104, MRS肉汤(Oxoid，英国)用于LAB。0.1 mL适当稀释液表面涂于木糖-赖氨酸-去氧胆酸盐(XLD)琼脂(Oxoid, UK)复制板上，计数活DT104。在35°C好氧瓶中培养48 h后，计数LAB。

统计分析

每条试验重复4次。挑战试验期间测定的DT104和LAB计数转换为日志₁₀值。这些log转换的值(log₁₀cfu毫升^－1或g^－1)及发酵乳中各取样时间所测得的pH值，均采用统计分析系统的一般线性模型[11］．采用LSD检验进行均值分离，以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

DT104在牛奶发酵过程中的生长和存活(Ergo的制造)

环境温度下发酵牛奶中DT104和LAB种群的变化图2．在高初始接种量下，DT104种群数量和pH值在发酵过程中逐渐下降。72h发酵结束时，DT104计数下降3.3 log cfu mL^－1与初始接种量相比(P<0.05)。在中低初始接种量水平下，DT104种群数量在发酵24-36小时前增加，然后逐渐下降，直至发酵结束。发酵72 h时，DT104计数下降5.6 log cfu mL^－1在中等初始接种量，下降到低于电镀检测限(<10 cfu mL^－1)在低初始接种水平。在发酵的前24 h内，3种初始接种量下发酵乳的pH值从~6.7下降到~4(此时LAB种群有增加的趋势)，并保持在这一水平直到发酵结束。在不含LAB的对照乳中，DT104存活较好，仅为0.8 log cfu mL^－1发酵72小时后细胞数量减少。

DT104在阿伊布制作过程中的存活

实验1:以Ergo为原料，在常温下发酵72 h制成阿伊布。DT104接种于发酵0 h的乳汁中。

在50、60和70°C烹饪开始时，DT104计数为5.4(高)、2.0(中)和5.7 log cfu mL^－1(控制);而LAB计数为4.0,4.0和5.6 log cfu mL^－1分别在高、中、低初始接种水平(图3)．在烹饪20 min和在60°C和70°C制作ayb温度下，DT104和LAB均低于电镀检测限(<10 cfu mL^－1)，即使在一夜的浓缩后(数据未显示)。

DT104下降2.5和1 log cfu mL^－1，分别在50°C烹饪后20分钟内以高和中等初始接种量(图3)．在无LAB的情况下，DT104下降2.9 log cfu mL^－1．DT104的完全抑制在50°C烹饪20至40分钟之间实现。LAB计数在烹饪40分钟时逐渐下降，在50°C烹饪60分钟时未检测到(图3)．

实验2:制作阿伊布:原料Ergo发酵24 h后，DT104与LAB共接种于牛奶中发酵0 h。

本文介绍了DT104和LAB在脱脂发酵乳发酵过程中的生长和存活情况图4．DT104种群减少5.2 log cfu mL^－1在50°C烹饪温度下，以高初始接种量接种60分钟后。在没有LAB的情况下，DT104存活较好，为4.2 log cfu mL^－1在50°C烹饪60分钟后减少。在中等和较低的初始接种量水平下，DT104计数分别在50°C烹饪60和40 min后下降至镀层检测限以下(图4)．在60°C和70°C烹饪温度下，在所有初始接种水平下，在烹饪20 min后，DT104种群数量急剧下降(p<0.05)，在烹饪40 min时未检测到(图4)．LAB计数从平均约8 log cfu mL下降^－1在50°C和60°C开始烹饪，烹饪温度约为3 log cfu mL^－1在50°C烹饪结束时，而在60°C烹饪温度下，即使在富集后，计数仍低于电镀检测限(p<0.05)。

实验3:环境温度下发酵24小时后制成阿伊布。在烹饪开始前发酵24 h接种DT104。

DT104和LAB群体的变化见图5．DT104在50°C加热60分钟后存活，细胞数量减少5.9、4和2.5 log cfu mL^－1初始接种量分别为高、中、对照;而在低初始接种量时，DT104下降1.9 log cfu mL^－1烹饪40分钟后，60分钟后低于电镀检测限(图5)．

DT104在60°和70°C烹饪温度下接种，在没有LAB的情况下存活60分钟，计数减少6.3和5.4 log cfu mL^－1在烹饪开始时，浓度为2.2和1.5 log cfu mL^－1， (p<0.05)。而与LAB共接种的DT104在两种温度下烹饪40 min后均未检测到。LAB在50°C烹饪下存活至60分钟，数量从6.2、6.3和6.0 cfu mL逐步减少^－1在烹饪开始的2.7,2.0和1.9 cfu mL^－1在烹调结束时，分别为高、中、低初始接种量。在60°C烹饪20分钟后检测到LAB，但在70°C烹饪温度下此时未检测到存活的LAB。

讨论

发表的关于行为的研究鼠伤寒沙门氏菌DT104在埃塞俄比亚的传统食品生产中，如牛奶加工，通常是稀缺的。本研究主要研究了DT104在环境温度下发酵用于制造ergo和加热脱脂发酵牛奶用于制造Ayib过程中的生长和存活情况。

酸度和pH值以及热处理是影响食品中病原体生长和存活的重要因素[12］．有机酸的抗菌作用是众所周知的[10］．发酵乳对沙门氏菌的抑制作用已有文献记载[13］．在酸奶中，乳酸是主要的抑制因子鼠伤寒沙门氏菌［14］．这支持了目前发现的结果，即DT104种群随着牛奶发酵的推进而减少。在本研究中，DT104在高初始接种量下比低初始接种量下更能在牛奶发酵中存活，这表明其抑制程度取决于病原体的初始接种量。发酵乳制品有不同的抑制作用机制。有机酸通过其未解离的分子发挥作用，酸的活性取决于pH值，pH值决定了解离的程度。在pH值较低时，未解离分子的比例大于pH值接近中性时[10］．鲁宾(15]，另一方面表明酸奶乳清中酪蛋白浓度的增加与沙门氏菌存活时间的长短直接相关。根据El-Gazzar和Marth [10]，对其施加保护层作用鼠伤寒沙门氏菌而保护的程度取决于酪蛋白的浓度，酪蛋白分子的形式和pH值。

沙门氏菌能开始并维持生长的最低pH值，由El-Gazzar和Math指出[10]，是血清型、孵育温度以及生长培养基的性质和成分的函数。例如，在最佳实验室条件下，沙门氏菌开始生长的最低pH值报告为4.05，当肉汤用盐酸或柠檬酸调整时[10］．最适pH值为6.5至7.5 [16］．pH值为4.4时沙门氏菌的繁殖[17]及5.2至5.3 [18，19也有报道。然而，在目前的研究中，DT104在pH为3.8的发酵牛奶中存活了72小时，发酵0小时时pH从6.7逐渐下降。这一发现与Ashenafi的发现一致[20.]他们报告了肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌在熏制容器中在常温下发酵48至60小时。然而，他报告说，在pH值降至3.7的样品中实现了完全抑制。耐酸反应鼠伤寒沙门氏菌，如Jung和Beuchat所指出的[12]，这是由暴露在酸中诱导的，它增强了随后对极端酸性环境(pH 3.0)的抗性。

酸的适应性似乎增加了DT104的生存能力。Samelis的作品[19例如，揭示了非酸适应鼠伤寒沙门氏菌DT104种群数量下降4.1 log cfu mL^－1在30°C的乳酸(pH 3.5)中暴露120分钟，而适应酸的种群的相应下降仅为1.6 log cfu mL^－1．雷耶及强森[18]还报道了酸适应沙门氏菌细胞增加了对发酵乳制品中发现的有机酸的抗性，并且在牛奶发酵和储存在5°C的奶酪中，它们比未适应的细胞存活得更好。

在埃塞俄比亚，Ergo通常在室温发酵24小时后直接食用，因为它的味道更好[20.］．然而，根据目前的研究，根据初始接种量的不同，DT104在发酵中存活了72小时。当发酵乳(在发酵0小时或24小时接种或不接种LAB)在50°C下烹饪用于ayib制作时，DT104存活长达60分钟，存活时间根据初始接种量而有所不同。D 'Aoust [21]表明在60°C加热牛奶只产生2对数₁₀降低了活菌数量，但没有达到完全抑制。在本研究中，DT104的完全抑制在60 - 70°C烹饪20 - 40分钟之间实现。暴露的鼠伤寒沙门氏菌对各种应力已证明增强耐热性。雷耶及强森[22例如表明酸适应了鼠伤寒沙门氏菌对热的耐受力增强。这一发现证明了在食品加工过程中使用次巴氏杀菌热处理的一些预防措施，这是埃塞俄比亚传统阿伊布制法的普遍做法。

自从Idziak和Suvanmonkol [12的毒性鼠伤寒沙门氏菌在酸性条件下增加，低感染剂量的细胞可能会在像Ergo这样的酸性环境中引起疾病。因此，直接食用不安全。在制作ergo时，建议使用煮沸的牛奶，并通过“向后倾倒”产生的部分发酵牛奶进行发酵。对于阿伊布的制作，至少需要60°C的烹饪温度至少40分钟，以确保产品的健康。

确认

法国驻埃塞俄比亚大使馆和国际科学基金会(IFS)的财政支持以及Andinet GETACHEW的技术援助得到了适当的承认。

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