小檗碱影响生物膜的形成和表达勒克斯和链球菌毒力因素

昌旺,帅Wang Yanbei杨Yonghui周,陈,看淡了烟花^*
东北农业大学兽医学院,哈尔滨,黑龙江省150030年,中国的公关

通讯作者:烟花,东北农业大学兽医学院59木材载重线街香坊,哈尔滨,黑龙江,150030年中国公关,电话:+ 86045155191881电子邮件:liyanhua1970a@163.com

收到日期:08/21/2015接受日期:12/10/2015发表日期:12/17/2015

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文摘

猪链球菌(猪链球菌)是一个猪的重要病原体,负责不同的疾病在猪和人类。它发现形式生物膜在virtro和体内。勒克斯/ AI-2不仅影响生物膜的形成,而且细菌毒性因子。小檗碱是一个isoquinoline-type生物碱分离Copyidis粉末和其他草本植物对细菌。在这项研究中,我们观察到sub-minimal抑制浓度(sub-MIC)小檗碱(62.5μg•mL-1)都能充分表现出一个抗菌效果和显著抑制生物膜的形成,由扫描电镜如图所示。实时PCR表明,小檗碱降低luxS-mRNA的数量低于消极的控制。已知的毒性基因的表达水平的量化实时PCR表明,小檗碱的转录水平ef,狡猾和gapdh基因生物膜的形成是表达下调,尽管国民幸福指数,cps和mrp基因调节。总结集体数据表明,小檗碱可能调节转录水平的勒克斯/ AI-2和许多毒性基因,猪链球菌生物膜的形成和抑制。

关键字

猪链球菌、生物膜、小檗碱、AI-2勒克斯毒力基因

介绍

猪链球菌是一个重要的病原体负责重要的经济损失猪全球行业。它会导致各种危及生命的感染,引起脑膜炎,败血症,心内膜炎在猪、关节炎和肺炎。猪链球菌感染在超过30个国家已报告和35个血清型(猴和1/2)已确定的基础上荚膜antigerns [1]。猪链球菌形成生物膜的能力,导致持续性感染中发挥着关键作用[2]。

群体感应系统中生物膜的形成起着重要的作用。群体感应是一个细菌细胞的细胞间通信系统能够间接监测自己的人口密度通过生产和交换扩散性的信号分子(3]。这一监管体系涉及细胞信号分子通过的生产勒克斯基于autoinducer-2 (AI-2)浓度的增加,细胞密度增加(4]。作为细胞外信号分子的浓度达到一个阈值时,细菌可以改变他们基因表达一致(5]。的勒克斯基因在生物膜的形成起着至关重要的作用,基因表达,能动性和耐药性(6]。在以前的研究中,更高浓度的AI-2抑制猪链球菌生物膜的形成和宿主细胞粘附7]。mrp,毒性等因素cps gapdh,狡猾,出口押汇,国民幸福指数和ef突变株,媒体附着力、侵略、殖民和扩散的能力猪链球菌宿主细胞。因此,了解生物膜之间的关系、毒性和群体感应可能导致小说的发展策略来抵抗感染。

目前迫切需要开发替代治疗猪链球菌生物膜感染安全、有效和廉价的。草药几个世纪以来一直用于治疗各种疾病。他们还表现出抗菌、抗病毒(8),抗炎和抗癌活性9]。在所有的策略被用来克服耐药性,使用天然物质显示特定的承诺,和许多天然物质也有antibiofilm属性(10- - - - - -12]。先前的报道表明,黄连提取物的法语和黄柏鲁普雷希特有抗菌作用13]。紫荆的主要成分之一,p . amurense小檗碱。小檗碱,其中最重要的生物碱protoberberine小组的成员,展品抗疟,antisecretory、抗炎以及抗癌活性相对较低细胞毒性(14]。它也被报道,小檗碱治疗是很有用的肠胃炎、腹泻和霍乱疾病(15]。之前的研究表明,小檗碱对几种细菌抗菌活性物种,和干扰酿脓链球菌的粘附宿主细胞,通过预防lipoteichoic的络合酸与纤连蛋白或解散一旦形成这样的复合物(16]。

在大多数研究小檗碱的抗感染药活动,重点是它的抗菌效果,没有支付给小檗碱在生物膜形成的影响猪链球菌。在这里,我们专注于研究小檗碱的影响勒克斯/ AI-2 QS系统和毒性的生物膜的形成因素猪链球菌。

材料和方法

菌株和文化条件

猪链球菌应变ATCC700794被用于这项研究。这是生长在Todd-Hewitt汤(有)含5%胎牛血清在37°C与震动150 rmp获得浮游文化mid-exponential增长阶段。

最低抑制浓度(MIC)

麦克风的最低浓度,抑制明显增长。麦克风决心为每个化合物通过使用采用微量测定,如前所述[17]。简而言之,100μl 1.0×10⁶cfu /毫升猪链球菌(基于麦克法兰标准)被添加到每个,微量滴定板是孵化24小时在37°C。

量化的生物膜的形成

生物膜的形成是在卡尔加里生物膜装置(CBD)根据先前所描述的方法修改18]。简而言之,200μl 1.0×10⁶cfu /毫升猪链球菌(基于麦克法兰标准)添加到CBD。孵化在37°C 3天不摇晃。

小檗碱对生物膜形成的影响

100年μl有汤含小檗碱的添加到井CBD的板。一夜的文化猪链球菌在新鲜文化肉汤稀释到1.0×10⁶cfu /毫升和100μl接种到每个。所有化验进行五次。孵化后3天在37°C,井被丢弃的内容和挂钩洗了三次使用200μl无菌PBS去除松散附着的细胞。板与结晶紫染色。修复后的甲醇,然后染色测量在595海里。

测定集落形成单位(CFU)

测试的杀菌活性小檗碱对细菌生物膜,100μl猪链球菌(1.0×10⁶细胞/毫升)添加到CBD,方法如上所述。微型板块是密封的,用10分钟。这些细胞被镀在培养皿中含有固体培养基在一式三份,在37°C和孵化前2天计算。±标准差计算方法。

通过扫描电子显微镜观察生物膜的形成

此外,扫描电子显微镜(SEM)影像被用来证实预防生物膜的形成。生物膜的形成对CBD如上所述。简而言之,挂钩与PBS洗两次,然后最初由2.5%戊二醛固定20 h在4°C。表面与PBS洗两次。细菌被更换缓冲然后脱水随着乙醇浓度(50%,70%,90%,100%)为10分钟。临界点干燥后和金溅射涂层,样品用扫描电子显微镜检查。

实时聚合酶链反应分析

总RNA被隔绝猪链球菌随着生物膜细胞3天。互补脱氧核糖核酸是由反转录。16 srna作为内部控制实时聚合酶链反应(rt - PCR)分析。rt - pcr是根据以前描述的方法(19]。rt - pcr进行总量的20μl包含10μl由于“快速上手”项目的DNA大师SYBR GreenI, 1.2μl cDNA、7.6μl ddH₂啊,0.6μl正向引物,和0.6μl反向引物。相关基因的引物用于各种rt - pcr分析表1中列出。

统计分析

数据被表示为平均数±标准差。AP值< 0.05被认为是显著的。所有使用SPSS 20.0统计软件进行统计分析。使用棱镜软件进行数据分析。

结果与讨论

小檗碱对生物膜形成的影响

作为生物膜的形成被认为是持续感染的导致原因所致猪链球菌。因此,我们研究了小檗碱的影响猪链球菌生物膜的形成和生物膜CFU计数。不同浓度的小檗碱被添加到生物膜板测试是否小檗碱调节猪链球菌生物膜的形成。王等人报道,小檗碱是活跃在体外对美国epidermidis sub-MICs小檗碱可能发挥作用在生物膜形成的预防美国epidermidis [20.]。,我们发现对小檗碱的麦克风猪链球菌被确定为62.5μg /毫升。3天的接触后,我们观察到生物膜的降低CFU计数。生物膜的截流率减少了孵化与31.25μg /毫升小檗碱72 h (P < 0.01)降低(图1)生物质观察berberine-treated细菌相比un-treated控制如图2所示。的猪链球菌cfu /毫升下降从控制9.16±0.90 cfu /毫升6.71±0.11 cfu /毫升berberine-exposed隔离(P < 0.05)。生物膜CFU计数显著降低了小檗碱的细胞被孵化。

的猪链球菌扫描电镜观察到图3所示。应变形成一个厚的,异构的层柱状块的CBD孵化时没有小檗碱72 h。当劳损是小檗碱处理浓度的31.25μg / ml,没有明显的生物膜形成和可以看到只有少数细菌一个个独立王国。结果表明,小檗碱能剂量依赖性地抑制生物膜的形成。

小檗碱的影响勒克斯/ AI-2猪链球菌生物膜

先前的研究已经发现勒克斯/ AI-2 QS系统和毒力因素影响生物膜的发展猪链球菌,这些研究的结果表明,AI-2和毒力因素限制了生物膜的形成21]。据报道,小檗碱可能发挥作用在生物膜形成的预防美国epidermidis [20.),但它的影响猪链球菌还不清楚。在这项研究中,我们专注于研究小檗碱的影响勒克斯/ AI-2 QS系统和毒性的生物膜的形成因素猪链球菌。

生物膜的发展和群体感应有密切联系的过程。群体感应是细胞的人口密度依赖的调控基因表达的小信号分子,称为人工智能(22]。AIs积累浓度阈值时,系统被激活,直接或间接地控制目标基因的转录。一种叫做勒克斯需要的合成AI-2 [23]。实时PCR的结果表明,小檗碱的数量减少勒克斯信使rna低于4.35倍猪链球菌在那有细胞生长(P < 0.05)(图4)。总之,小檗碱可能调节转录水平的勒克斯/ AI-2和抑制猪链球菌生物膜的形成。

小檗碱对毒性的影响基因的表达猪链球菌生物膜

先前的研究的virulence-associated因素猪链球菌主要关注了荚膜多糖(cps) muramidase-released蛋白(mrp) (mrp基因),细胞外蛋白质因子(ef)和suilysin(狡猾)[24]。这些分子已经建议virulence-related因素。最近,大量的假定的毒性相关的因素猪链球菌2描述了[25- - - - - -27]。这些包括纤连蛋白,fibrinogen-binding蛋白质(fbp) [28),glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(gadph) [29日),而谷氨酸dehydrogenas (gdh) [30.]。广泛的研究在过去二十年已经确定了许多因素参与这种病原体的毒性包括特别是cps,扮演了一个主要对宿主免疫保护作用[31日]。到目前为止,不同的基因已经被确定为关键猪链球菌毒性(32]。哈默施密特et al ., (33]发现侵入性肺炎双球菌展出一个增强的能力遵守和入侵上皮细胞,导致出现减少荚膜材料,这可能会增加生物膜的形成。在这项研究中,增加了cps小檗碱比负控制1.54倍(图5)。结果表明,cps表面结构似乎对于生物膜发展的监管和毒性。mrp,最初与毒性菌株,据报道在血清型2株(34]。

的氨基端地区BaoA1同源的mrp猪链球菌。之前的研究表明,BaoA1缺乏抑制细菌生物膜的形成(35]。杨等人报道了生物膜之间的mrp基因表达下调表达水平和浮游细胞(36]。在这项研究中数据表明,小檗碱增加了mrp表达比负控制1.71倍。因此,小檗碱能够调节mrp的表达和抑制猪链球菌生物膜的形成。gapdh具有约束力的活动白蛋白白蛋白在细菌表面的存在增加了毒性猪链球菌(37]。猪链球菌在细菌粘附(gapdh中也扮演了重要的角色29日]。表达式的数据表明,小檗碱降低gapdh 3.85折。顺理成章地,小檗碱处理gapdh减少了细菌粘附,因此削弱了毒性猪链球菌。狡猾的属于家庭的毒素被称为thiolactivated毒素或相关cholesterol-binding溶细胞的毒素,可以调节溶血素(4]。表达数据表明,小檗碱降低了3.13折的狡猾。在这项研究中,小檗碱可能调节狡猾的表达水平,这是影响猪链球菌。杨等人报道三毒力基因表达下调表达水平的国民幸福指数,cps2和mrp基因生物膜和浮游细胞之间,在生物膜(gapdh和狡猾的调节36]。在这项研究中,三个毒性基因(ef、狡猾和gapdh)表达下调和三毒力基因(国民幸福指数、cps mrp) upregualted添加31.25μg /毫升小檗碱。然而,小檗碱相比没有显著增加fbps-mRNA消极的控制。类似的结果是发现了杨等。结果表明,小檗碱能够调节的毒性基因的表达猪链球菌。

确认

这项工作得到了国家自然科学基金(820055)和应用技术研究和开发的项目在黑龙江(2014号g0173)。

表乍一看

表1

数据乍一看


图1	图2	图3	图4	图5

引用

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