研究与评论:药物分析杂雷竞技苹果下载志
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e-ISSN: 2320 - 0812
1药学院药物分析系，Tal: Sangamner, Dist: Ahmednagar，马哈拉施特拉邦，印度
2质量保证技术系，Amrutvahini药学院，Tal: Sangamner, Dist: Ahmednagar，马哈拉施特拉邦，印度
收到日期:18/07/2018;接受日期:08/08/2018;发表日期:20/08/2018
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对乙酰氨基酚(PAR)，盐酸曲马多(TRM)和多潘立酮(DOM)用于急性肌肉骨骼疼痛。这些药物在生物样品中低水平的定量方法有待优化。色谱柱为C18柱，流动相为甲醇:磷酸盐缓冲液(50:50 v/v)，流速为1 ml/min，波长为272 nm。体内药代动力学研究，大鼠口服扑热息痛、盐酸曲马多和多潘立酮(1 mg/kg)后采集血液样本。对乙酰氨基酚、盐酸曲马多和多潘立酮的保留时间分别为3.3、5.3和8.9 min。分析结果进行了静态验证。PAR、TRM和DOM的线性范围分别为250 ~ 1500、25 ~ 150和25 ~ 150 μg/mL，精密度回收率分别为100.12、99.87和100.4%，片剂分析分别为99.88、100.28和99.6%。该方法已成功应用于PAR、TRM、DOM的口服药代动力学研究。对乙酰氨基酚、盐酸曲马多和多培立酮在(Tmax) 3,4,6时的最大浓度(Cmax)分别为156.36、335.15和55.34 (ng/mL)，半衰期分别为3.75、5.8和4.8 h。该方法已成功应用于药代动力学研究。
化学上，扑热息痛(图1一个)是N-(4-羟基苯基)乙酰胺。它是一种止痛解热剂。可有效治疗轻度至中度疼痛，如头痛、神经痛及肌肉骨骼源性疼痛[1］．扑热息痛的半衰期为1-3小时，生物利用度为70-90%。化学性质:盐酸曲马多(图1 b)是2-(二甲氨基甲基)-1-(3-甲氧基苯基)环己醇。盐酸曲马多是一种用于治疗中重度疼痛的中心镇痛药。盐酸曲马多通过与μ-阿片受体结合并作为血清素-去甲肾上腺素再摄取抑制剂起作用。盐酸曲马多是μ-阿片受体激动剂[2］．盐酸曲马多的半衰期为6.3-7.4小时，生物利用度为70-75%。Domperidone (图1 c)化学上是5-氯-1-[1-[3-(2-氧- 1,3 -二氢苯并咪唑-1-基)丙基]-4-哌啶基]- 1,3 -二氢苯并咪唑-2-酮。DOM是多巴胺受体的特异性阻滞剂。它加速胃肠蠕动，引起催乳素的释放，并被用作止吐药和研究多巴胺能机制的工具(图1) [2，3.］．
图1:a.对乙酰氨基酚b.盐酸曲马多和c.多潘立酮的化学结构。
采用高效液相色谱法测定PAR、TRM和DOM [4]，稳定性指示法已报道[5，6］．对乙酰氨基酚输注白化Wistar大鼠亚急性毒性研究测定PAR [7］．生物分析方法的开发和验证及其药代动力学应用尚不能用于这三种药物。最广泛接受的方法验证指南是ICH和USFDA指南Q2 (R1)，这在药学和医学科学中都使用[8-11］．
仪表
高效液相色谱法(Water 600控制器)仪器配备型号代码6CE In Line Degasser AF，往复泵，rhedyne 7725i手动注射器20 μl固定环和高效液相色谱注射器100UI和紫外-可见检测器。采用rp -18、Inertsil ODS色谱柱(250 × 4.6 mm × 5 μ) (5 μm粒径)进行分离定量。探测器设置在254 nm。用HANNA pH计测定流动相的pH值。
材料与方法
PAR、TRM和DOM来自印度格伦马克制药有限公司。所用磷酸氢二钾、磷酸二氢钠和氯化钠分别为AR级和HPLC级。所用甲醇为HPLC级。血浆取自实验动物。
方法优化
采用甲醇:磷酸盐缓冲液(Dibasic) pH为4 (50:50 v/v)的流动相，流速为1ml min-1进行等容分离。注射量固定为20 μl。流动相经膜过滤器(0.45 μ)过滤。选择该方法的原因是，它比其他流动相具有较好的分辨率。在此色谱条件下(图2)．
图2:针刺血浆中扑热息痛、盐酸曲马多和多潘立酮的代表色谱。标准溶液的制备。
PAR、TRM和DOM的原液分别在100 ml甲醇中称量10 mg。在流动相中进一步稀释，得到PAR、TRM和DOM在2.5 ~ 12.5 μg/ml、0.25 ~ 1.25 μg/ml和0.25 ~ 1.25 μg/ml范围内的工作标准溶液。
血浆制备
储存的大鼠血浆样品在室温下解冻后处理，以4000转/分离心10分钟，取0.5 ml移液管放入10ml聚丙烯管中，加入乙腈(2.0 ml)。将混合物进行简单的涡流混合，在室温下静置5分钟后，混合物以4000 rpm离心5分钟。小心地将上清液转移到管中并注入HPLC系统。所得样品在开发的色谱条件下注入。
测定方法的应用
利用上述方法成功分析了PAR、TRM和DOM的血浆样品，进行了药代动力学研究。应用该方法在片剂中发现的PAR, TRM和DOM如下所示。精密度的RSD % <2，证实该方法足够精确(图3)．
图3:针刺血浆中对乙酰氨基酚、盐酸曲马多和多潘立酮片剂分析的代表色谱。
特异性
生物分析方法在可能出现的组分存在的情况下测量和区分被分析物的能力。PAR、TRM和DOM用于生物分析方法的开发和验证，该方法在色谱条件下被接受用于生物分析研究(图4)．
图4:空白等离子体的代表色谱图线性。
PAR、TRM和DOM在2.5 ~ 12.5、0.25 ~ 1.25和0.25 ~ 1.25 μg/mL浓度范围内线性良好，相关系数均超过0.999。结果表明，在浓度范围内，PAR、TRM和DOM的峰面积比与相应浓度之间存在极好的相关性表1．
| 参数 | 票面价值 | TRM | DOM |
|---|---|---|---|
| 线性范围 | 2.5 - -12.5µg / ml | 0.25 - -1.25µg / ml | 0.25 - -1.25µg / ml |
| 回归方程 | Y =51.96x - 25.4 | y = 4.88 - -3.33 | y = 13.6 -523 |
| 相关系数(r2) | 0.999 | 0.999 | 0.999 |
| 坡 | 51.96 | 4.88 | 13.6 |
| 截距 | 25.4 | -3.33 | -5.23 |
表1:线性的结果。
精度
以血浆回收率测定方法的准确度。分别在400、500、600 μg/mL、40、50、60 μg/mL和10、15、20 μg/mL 3种浓度水平下测定血浆中PAR、TRM和DOM的回收率。%回收率和% RSD的计算方法见表2．
| 浓缩的。(µg / mL) | 标准添加药物(µg/mL) | 回收量(µg/mL) | %的复苏 | ||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 票面价值 | TRM | DOM | 票面价值 | TRM | DOM | 票面价值 | TRM | DOM | 票面价值 | TRM | DOM |
| 500 | 50 | 15 | 400 | 40 | 10 | 399.9 | 39.5 | 9.8 | 100.08 | 99.75 | 100.3 |
| 500 | 50 | 15 | 500 | 50 | 15 | 501.1 | 50.2 | 15.5 | 100.45 | 100.06 | 100.4 |
| 500 | 50 | 15 | 600 | 60 | 20. | 599.5 | 59.1 | 20.8 | 99.85 | 99.8 | 100.5 |
表2:准确度研究结果。
精度
在高效液相色谱柱中注射3个重复，进行重复性和日间精密度研究。所有测试浓度的相对标准偏差均低于2.0%，见表3．
| 验证参数 | %的意思 | 堡。 | % R.S.D | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 票面价值 | TRM | DOM | 票面价值 | TRM | DOM | 票面价值 | TRM | DOM | |
| 可重复性 | 100.2 | 100.73 | 100.18 | 0.1 | 0.945 | 0.256 | 0.099 | 0.93 | 0.257 |
| 日复一日 | 99.83 | 100.1 | One hundred. | 0.251 | 0.3257 | 0.19 | 0.252 | 0.325 | 0.19 |
| 分析师对分析师 | 100.14 | 100.08 | 100.05 | 0.075 | 0.476 | 0.1761 | 0.074 | 0.475 | 0.1760 |
表3:岁差的结果。
鲁棒性
稳健性通过根据ICH指南故意改变色谱条件进行评估。在流动相pH (pH 4±0.1)变化的条件下研究了该方法。它显示在表4．
| 流动相pH值变化 | %的意思 | 堡。 | % R.S.D | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 票面价值 | TRM | DOM | 票面价值 | TRM | DOM | 票面价值 | TRM | DOM | |
| (pH值3.9) | 100.27 | 101.03 | 100.21 | 0.29 | 0.98 | 0.542 | 0.28 | 0.97 | 0.541 |
| (pH值4.1) | 100.15 | 100.65 | 100.41 | 0.1616 | 1.15 | 0.720 | 0.1613 | 1.14 | 0.717 |
表4:稳健性结果。
药代动力学研究
该动物研究得到了Sangamner Amrutvahini药学院动物伦理委员会的批准(批准号:CPCSEA/1153/PO/AC/08)。经验证的RP-HPLC法成功应用于PAR、TRM和DOM在大鼠体内的药代动力学研究(表5)．Wistar大鼠(250-300只)被安置在可以免费获得食物和水的地方。对健康女性受试者(n=9)进行了该药的药代动力学研究。在EDTA收集管中分别给予对乙酰氨基酚、盐酸曲马多和多潘立酮32.5、37.5和10 mg片剂，在预剂量0、1、2、3、4、6、8、12、24h后，动物禁食过夜，经反向眶穿刺收集血液样本(1 mL)。试管在4°C下以3000 rpm离心10 min，收集血浆。采集血浆样本后立即进行速冻，并在-70°C保存，直至使用。血浆样品与药物和处理按照液-液提取程序前面所述。对扑热息痛、盐酸曲马多和多潘立酮的血药浓度-时间数据采用Kinetica 5.0版(Thermo scientific)非隔室法进行分析。所述方法应用于大鼠药代动力学研究。大鼠单次口服PAR、TRM和DOM (1 mg/kg)后，测定给药后24 h内的血药浓度。 The mean plasma concentration–time curves after an oral administration of PAR, TRM and DOM (1 ng/ml) is shown in图5并对其药代动力学参数进行了综述表6．得到PAR、TRM和DOM的Cmax分别为156.36、335.15和55.15 ng/ mL, Tmax分别为3、4和6 h。所示图6．
| 参数 | TRADOL-PD | ||
|---|---|---|---|
| 票面价值 | TRM | DOM | |
| 均值(%) | 99.88 | 100.28 | 99.6 |
| 堡。 | 0.09165 | 0.4386 | 1.5307 |
| R.S.D. (%) | 0.09176 | 0.4373 | 1.5368 |
表5:片剂分析方法。
图5:大鼠血浆中扑热息痛、盐酸曲马多和多潘立酮的代表色谱。
| 参数 | 票面价值 | TRM | DOM |
|---|---|---|---|
| Cmax (ng / mL) | 156.36 | 335.15 | 55.34 |
| 达峰时间(小时) | 3. | 4 | 6 |
| AUC0-last (ng / ml.h) | 1072552500 | 2742600000 | 469687500 |
| AUC0-tot (ng / ml.h) | 1251699667.3 | 3821515685.2 | 640304279 |
| AUCextra (ng / ml.h) | 179147167.3 | 1078915685.2 | 179147167.3 |
| t1/2(小时) | 3.75 | 5.8 | 4.8 |
表6:药代动力学研究。
图6:对乙酰氨基酚、盐酸曲马多和多潘立酮的平均大鼠血药浓度-时间谱。
本研究采用反相高效液相色谱法，建立了同时测定对乙酰氨基酚、盐酸曲马多和多潘立酮含量的简便、准确的方法。该方法以甲醇和磷酸盐缓冲液(pH为4)为流动相。所建立的方法具有特异性，空白基质对定量无干扰，对扑热息痛、盐酸曲马多和多潘立酮的洗脱时间短(<10 min)。对乙酰氨基酚、盐酸曲马多和多潘立酮的单次口服剂量无显著影响。该方法成功应用于PAR、TRM和DOM在大鼠体内的药代动力学研究。所计算的药代动力学参数包括口服给药延长了药物在大鼠体内的生物半衰期(t1/2)。Tmax值相当高。发现最佳口服剂量的最大血药浓度(Cmax)较低。该方法在生物等效性、生物利用度和药物相互作用研究中有多种应用。
作者要感谢由格伦马克制药有限公司、辛纳和印度提供的标准PAR、TRM和DOM参考标准。作者对Amrutvahini药学院管理层在本研究工作中的合作表示感谢。
