生化方面Ricin-Ribosome复杂:一个简短的回顾

文摘

大型核糖体亚基包含一个高度保守的RNA序列(GAGA利乐循环)绑定的伸长是至关重要的因素在翻译。核糖体蛋白质——灭活(撕裂)蓖麻毒素和αsarcin绑定在这个序列和阻止伸长的交互因素因此,抑制翻译过程。蓖麻毒素是一种heteromer由两个子单元等,RTB联系在一起的一个二硫键。B亚基不与核糖体交互但只是一个载体催化地活跃的a亚基在本文中,我们试图名字的一些蓖麻毒素抑制剂及其作用机理。同时,我们建议策略选择一个适当的和有效的方法在各种方法。

关键字

GAGA利乐循环,逆行运输、核糖体失活蛋白(撕裂),蓖麻毒素抑制剂,RNA寡核苷酸适配子

缩写

RNA:核糖核酸;

撕裂:核糖体失活蛋白;

等:蓖麻毒蛋白毒素;

RTB:蓖麻毒蛋白毒素B;

SRL: Sarcin蓖麻毒素循环;

RCA:蓖麻凝集素;

EF-Tu:延长因子-温度不稳定;

EF-G:延长因子- G;

GTPase:鸟苷三磷酸酶;

论坛:Brefeldin;

呃:内质网;

核磁共振:核磁共振

介绍

萝藦蓖麻子豆或产生一个高度有毒蛋白质蓖麻毒素。它属于一个家庭的蛋白质称为核糖体失活蛋白(RIP)类型II [1,2]。它是由两个单体即蓖麻毒素毒素(等)和蓖麻毒蛋白毒素B (RTB),连接到彼此之间由一个二硫键等半胱氨酸259和半胱氨酸RTB的43,4](图1)。两根,RTB或蓖麻毒素B链连接到半乳糖-丰富糖蛋白细胞表面受体,负责毒素进入细胞,而其他亚基(等)停止蛋白质合成,(2,5,6]。等结合,depurinatesα-Sarcin /蓖麻毒素循环(SRL) 28 s rRNA 60年代真核核糖体亚基(2,7]。等蛋白水解乳沟,RTB非常重要的酶活性等(7]。附件后的蓖麻毒素B细胞表面,holotoxin内源性和经历逆行运输从高尔基体、内质网(8]。

蓖麻毒蛋白合成的植物

植物生产核糖体失活蛋白(撕裂)制定一些计划,以保护自己免受他们自己的毒素。这样一个计划产生的毒素不活跃的形式(9]。蓖麻毒素是合成preproricin从一个信使rna序列在种子阶段。不活跃的新兴蓖麻毒素由576名氨基酸,第一个35残留物包含信号肽的蓖麻毒素进入。等267年由残留,RTB 262残留。两个单体加入12肽长链接器序列。同时,存在未知长度的前肽后删除在ER成熟的蓖麻毒素的形成10]。创建五二硫化物键(11),其中4 intra-RTB债券和一个链接等的羧基端和氨基RTB的结束。折叠和糖化proricin交付通过高尔基体到存储液泡(12]删除链接器肽发生的地方。这释放出成熟disulfide-linked RTA-RTB异质二聚体。的酶负责转换proricin成熟蓖麻毒素是半胱氨酸蛋白酶13,14]。

蓖麻毒蛋白毒素结构

蓖麻种子包含一个混合的不同亚型的蓖麻毒素即蓖麻毒素E,蓖麻毒素D和蓖麻凝集素(RCA)。RCA,凝集素密切相关的是四聚物组成的两个ricin-like子单元。RCA是弱细胞毒素而是一个有弹性的血凝素,而蓖麻毒素是一种强大的细胞毒素。在蓖麻毒素分子结构等和RTB都是不同的,因此,表现出大幅差异他们的生物活性15]。

蓖麻毒蛋白毒素(等)

链或等由8α螺旋(A)和8β折叠(A)。117年残留在氨酰基端形成一个完整的折叠区域。测试表(行进)和螺旋(A和B)形式的基础分子。大部分的区域贸易协定是α螺旋的形成;这些螺旋形成包装结构和其他β折叠床单。非极性螺旋E(长度超过5把)穿过的分子结构和适应两个最重要的活性位点残基Arg Glu 177和180(图2)对其羧基末端。约8氨基酸残基在RIP的普遍保守,主要是出席活动的网站。123年80年这些残留物包括酪氨酸,酪氨酸,Glu 177、180参数,Trp 211 (16]。

蓖麻毒蛋白毒素B (RTB)

RTB有同源的两个域结构基因重复的结果。域是对氨基端和域两个羧基末端。每个域是一个复合结构的四子域单元;这些包含17个长连接肽(λ)和40残留的同源结构的核心(α、β和γ)17]。RTB的半乳糖结合位点是肤浅和进入接触不到一半的糖。雷竞技网页版半乳糖结合位点的底部形成3残留。结合位点的顶点是一种芳香族侧链(Trp 37和酪氨酸248)和保持接触的疏水区域糖。雷竞技网页版明确的糖和RTB之间形成氢键,占特定的绑定。C3-OH组约束的半乳糖形成一个强大的债券和Asn46 Asn255 [18,19](图3)。

核糖体的目标蓖麻毒蛋白毒素(等)

核糖体是出了名的错综复杂的多肽合成过程中的性能。这个过程使用多个因素在不同阶段增强蛋白质的生产,其中最重要的是鸟苷三磷酸酶因素(GTPase)可以自动化翻译的关键步骤。这些因素也与Sarcin网络/蓖麻毒素循环(SRL) [20.]。等的重要网站绑定的SRL大核糖体亚基,也促进了绑定的伸长因素(EF-Tu和EF-G) (21,22]。EF-Tu有助于绑定的带电tRNA核糖体和EF-G帮助peptidyl-tRNA易位步骤的过程中从一个网站到P网站翻译mRNA的多肽。绑定ribotoxins EFs是柔和的,如蓖麻毒素导致变化的阶跃恢复二极管域和连续的失活蛋白质机械(23]。螺旋95 23 s rRNA,从2653 - 2667核苷酸(prokaryotes-E.coli)由Sarcin /蓖麻毒素的循环(SRL)(图4)。

这个地区是高度保守的核糖体rna序列(24]。晶体结构研究表明,sarcin /蓖麻毒素循环网络大型核糖体亚基(原核)的表面的羧基端终端核糖体蛋白leucine6和循环的循环与helix91三级沟通在23 s rRNA [25]。两个图案都认可的生存研究实验室,从事多肽伸长ribotoxins和因素,是GAGA利乐循环和凸起G部分。A2660, G2659 G2661 A2662(原核生物)(图5)tetraloop由解理网站的毒素(26- - - - - -29日]。G2655,即。,the bulged G is the crucial site for the elongation factors [28]。

是发现等结合核糖体的组成的大亚基称为茎(30.,31日]。复杂的真核生物的核糖体茎包含两个相同的二聚体的酸性磷蛋白质,即。P蛋白(P1和P2)。这二聚体势必P0 pentameric形式(P0 - (P1和P2) 2)。在原核生物和真核生物的蛋白质是相同的,但是他们的组织是不同的。在原核生物的核糖体,pentameric单一P0组织蛋白质的异质二聚体Pα/ Pβ和Pβ/ Pα蛋白质是观察到的32]。P1蛋白结合的P1、P2二聚体上P0(两个独立的位置33,34和形成稳定的复杂35]。P1和P2蛋白的氨基端负责二聚体的形成和绑定P0 P1。尽管C - ter纯矿物保持自由细胞溶质和与gtpase [36,37]。这些磷蛋白质的复合物中发现的细胞质(38]。突变的核糖体,只P0而不是P1和P2,绑定等和核糖体被发现低(39,40]。

绑定与核糖体是一个两步的过程等。有所类型的交互表现出非常快速的协会和离解率和它需要一个完整的核糖体茎。另一方面,AB2交互协会和离解速率缓慢,一个完整的核糖体茎并不是必要的。在自然的交互都是静电,但类型有所强于AB2型。AB2互动指导等向核糖体和艾滋病交通茎和促进更具体和快速有所互动(30.],depurinates核糖体结合28 s rRNA比免费更有效地28 s rRNA [2]。脱嘌呤等也不是有效的原核生物的核糖体(41]。这清楚地表明,rRNA构象和核糖体蛋白质绑定等[中发挥着至关重要的作用42]。核糖体蛋白在原核生物中是不同的。异质二聚体蛋白质的N -末端地级/ L12呆在接触L10蛋白质。雷竞技网页版反过来,这L10沟通,通过n端rRNA [43,44]。

蓖麻毒蛋白毒素的攻击机制(等)

的内化holotoxin发生由于附件RTB的半乳糖残基呈现在细胞表面。这种毒素然后遵循逆行从高尔基ER。一种酶之间扮演重要角色打破债券等,RTB蛋白二硫化物异构酶。它是一种多功能酶结合形成RTB的二硫化物键调解蓖麻毒素的条目holotoxin ER腔。一旦holotoxin已经达到了ER减少和激活。的糖基化的膜蛋白质(45)和糖化腔蛋白(46ER的可以发送到胞质退化。这一发现导致了结论等可能立面作为传染性蛋白质和雇佣这样一个途径达到其胞质目标(核糖体)[47]。绑定后RTB半乳糖苷在细胞表面,细胞溶质的holotoxin的旅程可能继续通过clathrin-coated囊泡或non-clathrin涂布囊泡(48]。的路线一致,核内体的形成。众所周知,蓖麻毒素的毒性,核内体阶段应该超越和膜易位应(49]。即使易位,数量可观的蓖麻毒素累积在高尔基体网络。细胞治疗brefeldin (BFA),高尔基堆栈扰乱代理,表明蓖麻毒素并不是转移通过高尔基体网络(50]。这也引出了蓖麻毒素的假设转让为其毒性(内质网是至关重要的51]。等non-glycosylated起初但等胞液中糖基化的,这给了明确的迹象表明,毒素单体发生逆行转位ER (52]。

达到高脱嘌呤的核糖体,等应该有相对较高的局部浓度。同时,高催化活性的原因等的表面静电核糖体(53]。这是因为核糖体等[近120倍53,54]。的交互等的核糖体由7促进精氨酸残基通过静电力(30.Glu177和Arg180至关重要的催化活性等(55,56)和Tyr80 Tyr123、Asn209 Trp211艾滋病等的绑定到目标脱嘌呤(腺嘌呤4324 2660年真核生物和腺嘌呤在原核生物)(57,58]。同时,Asn209参与形成氢键的GAGA tetraloop sarcin /蓖麻毒素领域,根据晶体结构等(16]。建模分析表明Arg48 RNA-RTA交互,完成Arg134, Arg213, Arg258残留物,帮助在绑定的磷酸骨架rRNA [16,59]。

蓖麻毒蛋白毒素(RTA)抑制策略

腺嘌呤脱嘌呤机制的残留在GAGA核苷酸序列包括异常离解过渡态和oxocarbenium离子中间(60,61年]。蛋白质参与加速形成或劈理的含氮的碱基和糖之间的联系群著名展览各种途径(60,62年- - - - - -66年),其中一个重要的是稳定的oxocarbenium离子中间体。实验和量子力学研究表明等形式oxocarbenium离子由水(最后中和65年,67年,68年]。

许多RNA-based抑制剂的设计能够模仿这种状态(60,61年]。这些抑制剂被功能强大并不认为是有用的药物,因为他们高度不稳定和见证了困难在穿过细胞膜68年]。因此其他抑制剂等应给予优先(61年,69年- - - - - -72年]。等有两个绑定的开放构型pockets-primary和二级分区80酪氨酸的侧链。主口袋腺嘌呤特异性和次要的口袋里,这是一个小更大;港口的鸟嘌呤GAGA tetraloop [16,73年]。两个口袋之间的空间是实现由几个积极精氨酸残基。核糖体RNA的磷酸骨架占据了这个空间。因此,尽管设计新的抑制剂,所有这些点应该被考虑。至今为止最受欢迎的方法合成许多anti-RTA分子虚拟筛选和基于结构的设计。有困难在设计一个强有力的抑制剂,有能力容纳主数据和辅助口袋,因为不同的极性。许多化合物,蝶呤系列被发现是最有利的72年,74年,75年]。Pteroic酸,6-substituted蝶呤和7-carboxy蝶呤(cp) 7日报道成功等抑制剂。7 cp的交互作用和影响研究了动能和温度分析和x射线晶体学(74年]。

基于结构的药物设计是一个惊人的观点的描述micro-molecular抑制剂治疗酒醉的蓖麻毒素。这种方法的基础是研究抑制剂和目标之间的交互通过x射线晶体学和技术核磁共振光谱(17,76年,77年]。RTB似乎是一个简单的目标。这将是典型的小型抑制剂是否绑定到RTB紧密和阻止细胞吸收。然而,它不是一个有用的方案78年]。如上所述RTB结构两个域,每个域包含4子域。只有一个的子域的主要领域与细胞表面上的半乳糖残基相互作用。这些结合位点躺在B链的两端大约50远(16,79年,80年]。这使得很难对小分子抑制剂结合的同时活跃的网站(68年]。绑定等的SRL的基础在于目标的安排腺嘌呤残留的特异性的口袋等(16]。晶体研究的数据显示表明,等展览一个封闭的构象的特异性的口袋里没有衬底,即。的侧链残渣Tyr80旋转块口袋(79年]。然而,如果提供了基质等达到一个开放的构象,Tyr80允许与衬底的交互通过建立π-叠加Tyr123和腺嘌呤的底物的相互作用。同时,衬底6附加氢键形式赋予特异性腺嘌呤基(68年]。

几个寡核苷酸适配子也被报道,决然地绑定到蛋白质和阻止他们的活动81年,82年]。寡核苷酸适配子是小说类绑定到目标网站的DNA分子离解常数的范围picomolar摩尔(83年- - - - - -92年]。高亲和力核糖核酸适体(配位体)31个核苷酸的合成在体外哪有能力与SRL绑定到蓖麻毒素A链和减少SRL的脱嘌呤通过连锁。研究这个实验的有效性,荧光素酶测定了这是一个稳定的和敏感的方法筛选输出(93年]。

Landegren等人设计了一个现代技术,即。,Proximity-dependent表面杂交(17,76年]。这种技术采用DNAzymes (DNA寡核苷酸适配子在催化属性)(94年,95年这可以用作生物传感器由于其性质稳定,易标签和灵活性设计(91年,96年]。

两个分子的寡核苷酸适配子是用来绑定到单个蛋白质分子形成一个闭环结构。加强抑制已观察到的这种蛋白结合。绑定是可逆的蛋白质分子可恢复使用近红外光线。这两个基于适配子的抑制剂比单一更有效的亲和配体抑制剂(97年]。

圆形DNA核糖核酸杂交或DNA也可以用作基质/抑制剂等。他们有低分子量,从而避免核酸外切酶的降解活性。这样他们成为更好的选择线性抑制剂免费5’和3’末端容易退化和高分子量(98年]。Sturm等人合成封闭GAGA tetraloops没有茎,5’和3’末端与对方通过phosphorothioate债券或共价肟链接器。

后来等抑制化验与这些环状分子进行最后得出小环状DNA和DNA / RNA寡核苷酸有前途的抑制剂等,也phosphorothioate关闭DNA tetraloop比目的肟与环形和线性GAGA tetraloop [99年]。

这些技术被用于分析蛋白质活性和蛋白质,等活动可以确定使用这些技术,可以选择一个有效的抑制剂。

结论

这份报告包括关键细节关于核糖体失活蛋白,蓖麻毒素。的蓖麻毒素holotoxin等组成的二聚体,RTB联系在一起的一个二硫键的裂解细胞,只有等进入细胞表面上与一个高度保守的区域大型核糖体亚单位和灭活蛋白质机器。等遵循逆行运输通路,即。高尔基,呃,达到其胞质目标。茎P蛋白的构象是非常关键的绑定等核糖体。破坏高尔基堆栈与Brefeldin等化学药剂,报道了抑制的易位。RTB似乎是一个简单的目标打击蓖麻毒素中毒,但是很难实现分子港口RTB的两个不同的表面结合位点。抑制剂用于等应具备稳定的构象并能够很容易穿过细胞膜。anti-RTA分子广泛研究使用基于虚拟筛选技术和结构设计,后者非常有用的微分子抑制剂。同时,小说类的蛋白质,寡核苷酸适配子和dna rna混合动力车作为抑制剂等。

确认

本文的作者向大学拨款委员会(UGC)表示衷心的感谢,感谢他们的慷慨的财政支持。

感兴趣的宣言

作者声明没有利益冲突相关的手稿。

资金信息

目前的工作是财务支持的政府资助机构大学拨款委员会(UGC)。

作者的贡献

所有作者对本文的完成了同等重要的作用。

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