接收水系统中天然细菌对聚天冬氨酸-柠檬酸共聚物的生物降解

摘要

聚天冬氨酸-柠檬酸共聚物(PAC)是一种新型高效水处理剂可生物降解的决定了其在实际循环冷却系统中的应用前景。本文利用生活污水循环冷却系统接收水中的天然细菌研究了PAC的生物降解性，并通过二氧化碳演化试验进行了研究。通过FTIR、1H NMR和13C NMR对共聚物进行了表征。结果表明，PAC在10 d和28 d的降解率分别达到28.05%和79.73%，表明PAC属于生物可降解水处理剂。随着共聚过程中柠檬酸加入比例的增加和共聚物分子量的降低，PAC的生物降解性显著增强。Cu2+可以通过抑制酶活性降低降解速率。此外，与其他商业阻垢剂相比，PAC具有良好的生物降解性能。

关键字

聚天冬氨酸-柠檬酸共聚物;生物降解性;细菌

简介

基于“绿色化学”，目前使用抑制剂的趋势是更环保的药剂，这无疑是发展的趋势[1］．水处理剂在环境介质中的长期积累，将导致环境污染不可控制。这是降低这些化学品在环境中的暴露浓度，并防止其在特定环境隔间中扩散和积聚的重要过程[2］．从长远来看，生物可降解物质比持久性物质造成的生态问题要少[3.-4］．因此，生物降解性能已成为评价水处理剂的一个新的重要参数。

目前可用的“绿色”水处理剂主要有聚天冬氨酸(PASP)、聚环氧琥珀酸和天然聚合物．聚天冬氨酸(PASP)是一种很有前途的生物聚合物。作为水处理剂，PASP对结垢垢的抑制效果较好，对碳酸钙的抑制效果较好_3.和卡索₄，但其阻垢率对Ca_3.(PO₄）₂缓蚀效果不突出，限制了其大规模商业应用[4-6］．采用改性聚天冬氨酸作为PASP的替代品。

化学品的生物降解性能评价方法分为好氧法和厌氧法两种。前者包括好氧速率法、基质去除法、微生物指数法和二氧化碳演化试验。后者包括产气和挥发性酸测定、挥发性悬浮固体测定和无线电标记化合物测定[7-8］．经济合作与发展组织(OECD)正在领导将生物降解测试方法标准化的国际努力。公认的经合组织二氧化碳(CO₂)方法[9]基于Sturm的原始测试[10]通常用于评估或多或少可溶性有机化学品的生物降解性。根据经合组织的标准，二氧化碳的演化被认为是微生物活动的唯一明确证据。

以天冬氨酸和柠檬酸为单体，合成了聚天冬氨酸-柠檬酸共聚物(PAC)。PAC的特征为红外光谱法(IR)和核磁共振波谱学（¹H NMR和¹³C NMR)。采用二氧化碳气法研究了不同条件(柠檬酸含量、分子量、铜含量)对其生物降解性的影响^{2 +}内容物和商业阻垢剂)。

实验

材料及设备

在实验室制备了聚天冬氨酸-柠檬酸共聚物(PAC)。氨基三亚甲基膦酸(ATMP)是山东李奥纳多化工有限公司的工业产品。聚天冬氨酸(PASP)购自上海源源生物科技有限公司。实验使用的其他试剂由天津精细化工有限公司提供。

玻璃仪器浸泡在洗液中(50g K₂Cr₂O₇1000 mL H₂所以₄)浸泡30分钟，用自来水冲洗，再用洗液浸泡60分钟，用蒸馏水冲洗，105°C干燥，以去除所有有机或有毒物质。

PAC的表征

红外光谱:将纯化后的少量样品PAC在60℃真空干燥至恒重，与KBr混合后压在圆盘上。FTIR光谱范围400-4000 cm^－1用美国制造的珀金-埃尔默光谱100光谱仪对共聚物的光谱进行了测定。

¹H NMR和¹³C NMR:¹³C NMR和¹用瑞士制造的Bruker Advance AV 500 MHz核磁共振波谱仪测量PAC的H核磁共振谱₂测量用O。

PAC生物降解性的研究方法

测试装置:如图1所述测试装置由供气系统(1、2、3、9、10)、检测气体系统(4)、CO组成₂捕集系统(5、6、7、8)。空气无CO₂由供气系统供应。的有限公司₂捕获系统吸收的CO₂由检测到的混合液体在三个水平。设有水封，防止外界空气进入7，影响试验装置末端的实验结果。

检测混合溶液的制备

溶液A中加入8.5 g KH₂阿宝₄， 21 mL.75 g K₂HPO₄， 33.4 g Na₂HPO₄•2 h₂O, 0.5 g NH₄Cl在1000ml的容量瓶中。用22.5 g MgSO配制溶液B₄•7 h₂O在1000ml的容量瓶中。用36.4 g氯化钙配制C溶液₂•2 h₂O在1000ml的容量瓶中。用0.25 g FeCl配制D溶液_3.•6小时₂在1000ml的容量瓶中加入O和一滴HCl。

用800 mL H配制检测的混合溶液₂O, 10 mL溶液A, 1 mL溶液B, C和D，和40 mg测试碳源物质(转换PAC: 111.4827 mg;PASP: 95.8 mg;葡萄糖:100毫克;苯胺:51.7毫克)在1000毫升容量瓶，并调整到约7.4。

接种液的制备

试验前，用粗滤池去除原水中的杂质(含细菌)。过滤后的水在光培养箱培养板上，按计数板法培养24 h。最后，量细菌采用条纹板法测定接种稀释比。实验结果为10^－2(细菌液中细菌数量为10⁴－10⁵CFU/mL, TOC <4 mg/L)。

二氧化碳演化试验

采用二氧化碳演化试验研究了聚氯化铝(PAC)的生物降解性。将1 mL细菌溶液加入检测到的混合溶液中(第4瓶)图1)．空气在没有CO的情况下流动₂以约80-120 mL/min的流速泵入检测的混合溶液中。1个试验周期为28天，试验温度保持在23±1℃。实验是在黑暗中进行的。实验开始时，CO的含量₂第5个样品按滴定法每隔一天测定一次。同时，将第6、7个样品前移为第5、6个样品(图1)．然后在第三层加水封。更换容器，直至测试完成[11］．

空白对照组加1 mL 10 g/L HgCl₂加入到检测的混合溶液中抑制微生物活性。15天后，同样剂量的HgCl₂又加了一次。

结果以CO含量表示₂生成的。有限公司₂被Ba(OH)所吸收₂酸碱滴定溶液。苯酚为指示剂，残余Ba(OH)₂用0.05 M HCL滴定，直到粉红色的终点滴定点消失。降解百分比DM%根据式(1)计算:

结果与讨论

PAC的表征

FTIR分析:如图图2，傅里叶变换红外光谱(FTIR)表征了共聚物生物降解性的官能团。由曲线可知，N-H键和C=O键拉伸振动的特征吸收峰出现在波数为3392.55 cm处⁻¹1604.66厘米⁻¹,分别。原因是-C=O在1850-1600 cm左右的拉伸振动吸收峰^－1．与C=O的C、O、N吸收峰相连的键长为1715 cm⁻¹， 1735厘米⁻¹1680厘米⁻¹,分别。此外，由于C=O与氮原子的共轭效应，C=O键的电子云向C- n单键移动，导致其电子云密度降低，力常数降低。最后，C=O的吸收峰为1650 cm⁻¹．峰顶约911.75厘米⁻¹和1298.22厘米⁻¹分别为羧基拉伸振动的C-O和平面变形振动的-OH。频带在1074.28厘米处⁻¹在图2是由-CH₂和- ch -。吸收峰在1635.52 cm处^－1526.53厘米^－1表明了天冬氨酸单体聚合的β结构。这些峰表明天冬氨酸和柠檬酸确实发生了共聚。FTIR分析结果表明，共聚物的官能团与天冬氨酸热聚合合成的PASP具有相似的特征[12-14]，证实本研究使用的共聚物为PAC。

¹H NMR和¹³C核磁共振分析

图3显示了¹³PAC共聚物的C光谱。相比之下¹³C NMR谱化学位移值，173.98 ppm, 172.46 ppm和71.5 ppm的化学位移分别出现羰基的酰胺氨基，羰基和碳的柠檬酸与酰胺基团相连。ch的₂- nh - (50.41 ppm)， - ch₂-柠檬酸(34.41 ppm)和- ch₂-的天冬氨酸(18.27 ppm)碳从¹³PAC的C NMR谱，证实了本研究中使用的共聚物为PAC。

¹PAC的H NMR谱如图所示图4．质子共振峰为-NH (-CO-NH)，甲基(-CH₂柠檬酸和甲基(-CH₂)，分别在1.45 ~ 1.58 ppm、2.06 ~ 2.13 ppm和4.46 ~ 4.78 ppm的化学位移范围内。屏蔽区出现双键上下方向。强磁场下C=O的化学位移为2.98 ~ 3.03 ppm。共聚峰含量为2.06 ~ 2.13 ppm和4.46 ~ 4.78 ppm，表明PAC存在异构体，进一步表明了共聚物的结构。

聚天冬氨酸-柠檬酸共聚物(PAC)的生物降解性

如图5，可见PAC (Mw: 16242)在10天和28天的降解率分别为28.05%和79.73%。对葡萄糖的降解率分别为38.91%和98.99%，对苯胺的降解率分别为29.12%和60.15%。根据OECD301B水溶性物质可生物降解性评价标准，PAC属于易生物降解水处理剂。生物降解率不同的原因是由化学结构的差异引起的。在有氧条件下，葡萄糖可直接降解并完全氧化为CO₂和H₂氧和分子氧通过化学反应。苯胺中含有苯环，苯胺首先氧化邻苯二酚，同时释放出NH₄⁺．邻苯二酚的降解可以通过两种途径进行开环，即邻位和中位的分解代谢途径。催化分别是通过儿茶酚1,2双加氧酶和儿茶酚2,3双加氧酶。通过邻位分解代谢途径，将儿茶酚切至其两个羟基之间，经多步反应生成琥珀酸和乙酰辅酶(三羧酸循环中间代谢产物)。通过meta - position分解代谢途径，儿茶酚在羟基的一侧被切割，生成丙酮酸和乙醛[15-17］．PAC没有苯环，但其结构比葡萄糖更为复杂。PAC具有类似于蛋白质酰胺键的结构，其降解是一个多步骤过程。首先需要微生物胞外酶将PAC分解成短肽，短肽再分解成氨基酸小分子。最后生成CO₂和N₂通过脱氨和脱羧。因此，PAC的生物降解性优于苯胺，但略逊于葡萄糖。

柠檬酸含量对PAC生物降解性的影响

图6显示了柠檬酸含量对PAC生物降解性的影响，随着柠檬酸含量的增加，PAC生物降解性显著增强柠檬酸在共聚物中，由于PAC分子结构中官能团的性质、位置和数量会影响其性能微生物生物降解性(18-19］．柠檬酸属于聚羧酸，是一种安全、无毒、可生物降解的常用原料。其分子中含有1个羟基(-OH)和3个羧基(-COOH)，羧基为亲水基团，可与合成聚合物相互作用，与多种金属离子螯合，羧基可与水形成氢键[20.］．因此，增加共聚物中柠檬酸的比例可以增强聚合物的亲水性，为微生物提供舒适的生存环境，为降解酶提供更活跃的位点。随着共聚物中柠檬酸含量的增加，羧基数量增加。共聚物更容易被微生物分解，为微生物提供营养。从而更有利于微生物的生长和微生物对外源物质的利用。降解率提高。

共聚物分子量对PAC生物降解性的影响

如图7，共聚物降解率随PAC分子量(Mw: 16242、Mw: 16958、Mw: 26764)的不同而不同，10天降解率分别为28.05%、17.7%、15%，28天降解率分别为79.73%、51.75%、36.15%。可以看出，随着共聚物分子量的增加，共聚物的生物降解性减弱，孵育时间延长。高分子量聚合物的生物降解性能相对较差可能是由于聚合物的扩散微生物并将酶分子引入共聚物内部，阻碍酶或细菌对最敏感反应的攻击。另外，根据OECD301B中规定的水溶性可生化性评价标准，易生物降解水处理剂在10天和28天的理论降解率分别为10%和60%。根据该标准，分子量为16958和26764的共聚物不能满足易生物降解水处理剂的降解率标准。这可能是由于共聚物存在一个最佳分子量范围，可以有效地发挥其抑制性能。一旦分子量超过一定范围，PAC的抑制能力就会明显减弱。因此，在抑垢性能相近的情况下，应考虑环境相容性，选用分子量较低的产品作为水处理剂。

Cu的影响^{2 +}对PAC的生物降解性进行了研究

图8表明，随着Cu含量的逐渐增加^{2 +}浓度下，PAC的降解率呈下降趋势。其原因可能是生物降解是一种酶催化反应^{2 +}酶与-SH碱基的结合会使酶失去活性，从而影响底物与酶活性中心的结合，影响酶的化学反应能力[21］．此外，Cu^{2 +}带正电的离子倾向于与带负电的细菌蛋白质结合，从而增强其杀菌性能[22］．因此，提高Cu的浓度^{2 +}可杀灭部分细菌，从而降低降解率。

PAC、ATMP和PASP的生物降解性比较

从图9结果表明，PAC、PASP和ATMP在10 d和28 d的降解率分别为28.05%、38.31%、38.09%和79.73%、93.56%、79.32%。根据OECD301B水溶性物质可生化性评价标准，PAC、PASP、ATMP属于易生物降解水处理剂;然而，三种制剂的生物降解性差异显著。究其原因，可能是PAC、PASP和ATMP在化学结构上的差异。共聚物的单纯结构削弱了细菌与外源物质生物降解活性位点之间的粘结强度，从而降低了微生物降解酶的活性，进而影响其生物降解性能。ATMP分子中含有三个带负电荷的膦酸基团，从而排斥带负电荷的细菌蛋白质分子，从而达到平均降解性能。PASP是一种具有α和β两种不同异构体的聚氨基酸，如图10．此外，PASP和PAC的结构中同时存在-COOH和C-N键，但这可能是由于PAC结构中的-COOH基团与长碳链取代基相连，这对生物降解性有负面影响。最后，PASP的生物降解性略高于PAC。

结论

聚天冬氨酸-柠檬酸共聚物(PAC)是一种新型水溶性剂，可作为生物降解水处理剂。PAC具有类似于蛋白质酰胺键的结构，其降解是一个多步骤过程。微生物细胞外酶能将PAC分解成短肽，产生CO₂和N₂通过脱氨和脱羧。随着共聚过程中柠檬酸比例的增加和共聚物分子量的降低，PAC的生物降解性显著增强。共聚物中柠檬酸比例的增加可以增强聚合物的亲水性，为微生物提供舒适的生存环境，为降解酶提供更活跃的位点。高分子量聚合物的生物降解性能相对较差，可能是由于微生物和酶分子扩散到共聚物内部，阻碍了酶或细菌对最敏感反应的攻击。铜^{2 +}可通过抑制酶活性降低降解速率。此外，与其他商业阻垢剂相比，PAC由于存在更多的羧基(- cooh)和肽键(- co - nh -)，具有优异的生物降解性能。

确认

我们感谢FTIR的所有员工，¹H NMR和¹³C核磁共振测量。此外，感谢国家自然科学基金项目(No. 51308211)、中央高校基本科研业务费专项资金(No. 2015MS63)和河北省自然科学基金项目(No. e2016502097)的资助。

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