Bioproduction、抗菌和抗氧化活性的化合物小球藻寻常的

文摘

各种粗提物制剂(丙酮,乙醇,甲醇,buthanol DMSO溶液和水)从绿藻小球藻寻常的检查抗氧化活性、植物化学的筛查和抗菌性。体外自由基淬火和总抗氧化活性的提取物进行了1,1-diphenyl-2——picryl hydrazyl (DPPH),并与cathequin和没食子酸作为积极的控制。在大多数情况下,结果显示一个重要的抗氧化能力和总酚醛树脂之间的联系内容。水提物显示了最高抗氧化活性抑制清除(68.5%)和酚醛含量最高(3.45毫克/毫升)。抗菌活动进行了使用纸片扩散化验和肉汤稀释法对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌。结果表明活动之间的水提物和大多数标本(变形杆菌,肺炎克雷伯菌、沙门氏菌enteretidis枯草芽孢杆菌和大肠杆菌)。这些结果表明,c .寻常的的水粗提物可能被认为是一种生物抗氧化剂和抗微生物剂,并为生物技术领域的一个有价值的工具。

关键字

抗氧化、微藻、抗菌、提取物。

介绍

微藻是一种天然产品和最近研究了生物技术的应用程序。微藻的多样性使得潜在的丰富来源各种化工产品,应用在营养、化妆品、制药、和医药行业(1]。提取从海洋微藻是一种富含蛋白质、维生素和矿物质。小球藻,单细胞绿藻,包含各种有价值的蛋白质(40 ~ 60%)和已广泛应用于水产养殖、食品和生物技术产业。小球藻的提取包含各种生物活性化合物包括生长因子、抗炎和伤口愈合物质,抗氧化剂,和润肤剂的化合物(2]。

自由基在生物的生产是由不同的分子可能是内源性的抗氧化剂,如超氧化物歧化酶、或可能来自于饮食,如抗坏血酸、α-tocopherol、类胡萝卜素和多酚。当有限制可用性的抗氧化剂,可能存在氧化损伤累积的本性。各种类的天然抗氧化剂,酚类化合物,如简单的酚类化合物,酚酸(苯甲酸、肉桂酸的衍生物),香豆素类、黄酮类等,得到了很多的关注。据王et al .,孤立的土著c .寻常的应变从超临界二氧化碳萃取提取获得表现出显著的抗氧化活动和礼物双重抑制肺癌细胞生长和迁移能力,这是该指数的癌症转移(1]。

因此,微藻物种c .寻常的可能有潜在的抗氧化和抗癌产品的发展。修订涉及创新功能食品成分微藻研究显示,特定物种的微藻,化合物的活动,和提取机制的类型,这表明单细胞藻类的小球藻寻常的包含许多生物活性物质与医学属性。下进行实验研究小球藻展示了其抗肿瘤效应,癌症化学预防性质,抗炎活性,抗氧化活性、抗菌活性1,3- - - - - -5]。

的知识不同的微藻类物种的化学成分是强制性的第一步(考虑筛选方法),因为它将有助于目标有价值的化合物,抗氧化剂,suphated多糖,欧米伽,等等,在研究微藻。第二步,生长条件(盐度、光度和养分有效性)可以优化最大化生产感兴趣的化合物。下一步,一旦生物质在目标化合物(或化合物)是丰富的,是优化条件提取有价值的组件与高收益和活动。因此,有必要了解不仅过程的选择性,而且这些过程的影响在全球可持续发展的定义过程;方面相关的提取,如产量、品质、和应考虑生物活性还可持续性等其他因素,环境污染、残留物,成本效益等,还应该为最后的选择最合适的提取工艺(子任务和超临界流体有限公司₂、乙醇、水和组合)。这样的发展过程是一个打赌,每天越来越迫切的在我们的社会6]。因此,在目前的研究中我们关注不同的粗提取物c .寻常的为它的抗氧化和抗菌特性。

材料和方法

微藻生产

microalgal物种,小球藻寻常的,是来自文化集合的实验室生产食品的联邦农村伯南布哥大学的生活。微藻是种植在半连续培养系统中,分别在室内和室外。微藻的室内文化发展与热压处理过的淡水Provasoli介质在2 L瓶都洋溢着空气,和孵化温度控制房间(24°C)。瓶子与萤光管辐射(光强度,4000勒克斯)72小时。室外栽培,淡水是用氮磷钾肥料(20:10:20),持续曝气,和自然的光周期(身子)10 L, 100 L和500 L的容器玻璃纤维在大约100.000勒克斯的光强度。藻类生物量估计使用纽鲍尔室。微藻生物量的分离是通过絮凝与氢氧化钠(1米),晒干,并送往联邦大学的伯南布哥的生物技术实验室进行处理。

准备的提取

从不同溶剂提取得到:乙醇,甲醇,buthanol,丙酮,DMSO溶液和水。样品干燥微藻生物质(1 g)为每个溶剂悬浮在10毫升。样本提取下30分钟的声波降解法(40 kHz)在超声波批处理(模型超清洁1400、超声波独特、巴西)其次是相机抖动2小时和离心(4000 rpm) 10分钟得到上层的液体(图1)。这些提取物进行分析活动抗氧化,抗菌,抗真菌和植物化学的化合物。

植物化学的筛选

提取物中的总酚含量决定根据Julkunen-Titto描述的方法做了一些调整(7]。每个提取的整除(50μL)或标准的解决方案是混合1毫升的H₂O和500μL Folin - Ciocalteu酚试剂。后来2.5毫升的20% Na₂有限公司₃解决方案被添加到混合,其次是酝酿在环境温度在黑暗中45分钟。对一个空白的吸光度为735 nm(汽车斯派克紫外可见分光光度计,Labomed Inc .,卡尔弗城,CA)。没食子酸被用来准备一个标准曲线(0.025 - -0.6毫克/毫升)。结果表示为毫克没食子酸当量(GAE) / g提取(dw)。总类黄酮含量测定的方法Zhishen et al (8]。一个整除(250μL)的每个提取或标准的解决方案是混合1.25毫升的H₂O和75纳米μL 5%₂解决方案。6分钟后,150年μL AlCl的10%₃H₂解决方案被添加。5分钟后,0.5毫升的1 M氢氧化钠溶液添加然后总量由2.5毫升,H₂o .全面解决方案的混合后,对一个空白的吸光度测定510海里。(+)儿茶素是用于构建标准曲线(0.05 - -0.5毫克/毫升)。结果表示为毫克儿茶素提取的等价物(CE) / g (dw)。浓缩单宁的测定的方法Julkunen-Titto [7]。每个提取的整除(50μL)或标准的解决方案是混合1.5毫升的4%香草醛(用甲醇),然后750μL HCl补充道。混合解决方案是孵化环境温度在黑暗中20分钟。对空白吸光度在500海里。(+)-儿茶素被用于制造标准曲线(0 - 1毫克/毫升)。结果表示为毫克儿茶素提取的等价物(CE) / g (dw)。

抗氧化试验:DPPH (1-diphenil-2-picrylhydazyl)自由基清除活性

提取物的抗氧化活性p . pyrifolia叶子被DPPH自由基清除活性评价根据Soler-Rivas等的方法和作风等(9,10]。实验进行了使用SmartSpec 3000分光光度计(Bio-Rad)。短暂,buthanol整除(20μL),醚,乙酸乙酯和水提取物混合与90年分别μM methanolic DPPH彻底解决最后一卷1毫升。分析纯甲醇作为消极的控制。(+)儿茶酸、抗坏血酸盐和pirocatechin在甲醇作为积极的控制。DPPH自由基浓度反应混合物被校准曲线计算按照下列非线性回归方程(R = 0.9983): A515海里= 0.0362 (DPPH) - 0.055 (DPPH)表达在毫克mL-1。剩余的DPPH的百分比(% DPPHREM)计算根据Brand-Williams et al。(1995),如下:

% DPPHREM = (DPPH) T / (DPPH) x 100

其中T是吸光度测定的时候(min)外墙面和T0的时间为零。IP的决心,每个提取的整除(50μL)添加到90毫升的μM methanolic DPPH自由基和溶液吸光度是决定在515 nm稳态(20分钟)。

还原能力

还原能力测定的方法科斯塔et al。11]。在不同溶剂提取准备10% (w / v)离心机10000 xg 20ºC, 15分钟,和上层清液干后5毫克(干重)停牌1毫升甲醇。整除的样本(250μL)是与250μL钠混合磷酸盐缓冲剂(0.2 mol / L, pH值6.6)和250μL K₃铁(CN)₆:H₂O (1:9 9 w / v)孵化20分钟的50°C。在250年添加三氯乙酸μL: H₂O (10:90 w / v)的混合物在3750 g离心10分钟。上层清液(100μL)被收集并立即与甲醇混合(100μL)和25μL氯化铁:H₂O (0.1:99.9 w / v)。孵化后10分钟,吸光度决心在700海里。IC50值浓度的吸光度是0.5。利用抗坏血酸为标准。

抗菌活性

的不同提取物的抗菌活性c .寻常的确定根据科斯塔et al。11]。细菌的抗生素提供(DA),大学联邦德伯南布哥(UFPE),巴西DifcoTM营养琼脂(NA)和储存在4°C。革兰氏阳性菌株是粪链球菌、枯草芽孢杆菌;革兰氏阴性菌株是肺炎克雷伯菌,变形杆菌,肠炎沙门氏菌和大肠杆菌。提取准备盘扩散法研究了抗菌活性。一百毫升的温暖NA (43°C)和0.5毫升细菌悬浮液(105 - 106 CFU mL-1)喜忧参半,和10毫升量分布在贫瘠中板块(90 x15毫米)和允许固化。无菌白纸光盘(6毫米直径)浸满20μL无菌提取使用干海藻(10%,w / v)获得在不同溶剂(丙酮,乙醇,甲醇,buthanol DMSO溶液和水)添加琼脂板的中心。消极的控制盘与不同溶剂(20μL)。盘子在37°C孵化24 h。该报盘周围有一圈透明显示抗菌活性。

抗真菌活性

的不同提取物的抗菌活性c .寻常的确定根据科斯塔et al。11]。Aspergilus尼日尔(URM2813), a flavus (URM2814), a .来自烟(URM2815),根霉arrhizus (URM2816),拟青霉属variotti (URM2818)、镰刀菌素moniliforme (URM2463), f . lateritium (URM2665)白色念珠菌(UFPE-DA1007)和c . burnenses (UFPEDA4674)从文化获得收集-Micoteca⌊(阶层)的真菌学和抗生素(DA),联邦大学伯南布哥(UFPE),巴西。

统计分析

数据提出了均值±标准差(SD)的四个决定。统计分析使用一个单向方差分析。差异被认为是显著,P值< 0.05。

结果与讨论

植物化学的筛选和抗氧化特性

干的样本c .寻常的藻类是提交的分析他们的选民。在整个植物化学的分析从不同溶剂提取获得,使用水作为溶剂提取显示总酚类的最高水平(3.45毫克/毫升)的浓度高于他人,其次是DMSO溶剂(2.23毫克/毫升)。Buthanol和丙酮提取物含有更少的酚类和黄酮类化合物。结果通过王et al ., Rhodomela confervoides藻类表明乙酸乙酯溶剂(小极性)比别人更好地提取TPC,大约74毫克/毫升。洛佩兹et al。(2011)的总酚类物质提取Stypocaulon scoparium变化从1.23到3.28毫克当量GA / g干海藻粉,而在我们的研究TPC变化从0.110到3.450毫克当量GA / g干海藻粉(12]。我们同时注意到,单宁含量低的特点提出了在所有样本或检测不到。众所周知,化学萃取的产量取决于不同极性溶剂的类型,pH值,提取时间和温度以及样品的化学成分。早些时候,溶剂如甲醇、乙醇、丁醇、丙酮、氯仿和水提取的常用酚醛树脂从棕色和红色的海藻13,14]。进一步的提取进行了测试c .寻常的甲醇和水来评估香豆素,phenilpropanoglicoside化合物、萜烯、生物碱和碳水化合物。低量的碳水化合物被观察到在methanolic提取而不是水。其他生物分子检测不到。在Turbinaria Ananthi et al .,表明这种,碳水化合物的主要贡献定量评估化合物存在于相同的提取(15]表1。

表1:植物化学的筛选不同的提取c .寻常的。

由于存在不同的粗提取物的抗氧化成分生物组织样本,它是相对难以衡量每个单独的抗氧化成分。因此,开发了几种测定方法和应用近年来筛选和评估样本的总抗氧化活性(16]。化验和DPPH自由基清除已知的抗氧化剂的作用,抑制氧化产品。因此,DPPH实验通常被作为抗氧化活性的指标(1]。(图2)显示抗氧化提取物对DPPH的动力学行为。数据显示,DMSO溶液和水提取证明最高的抗氧化性能。这可能发生,因为分子在这些提取物抗氧化性能呈现出亲水特征。抗氧化剂能够稳定或禁用自由基在生物细胞攻击目标。形成的自由基的抗氧化剂活性不足以传播连锁反应与另一个激进的中和反应形成稳定的产品,或可能被另一种抗氧化剂17]。在(图2),我们观察到拔牙获得使用丙酮和丁醇提供最低的抗氧化活动确认了早些时候报道结果提取的化合物的亲水特性。DPPH自由基清除测试系统是一个承认机制抗氧化剂抑制氧化产品。因此,这个DPPH实验被广泛应用为抗氧化活性的指标之一。

在这项研究中化合物的溶剂萃取效率较高的抗氧化活性物种的小球藻寻常的所示表2。水和溶剂DMSO(二甲亚砜)显示,DPPH的抑制百分比为64.6%和68.5%,分别高于标准使用儿茶素(49.6%)和没食子酸(28.7%),表明他们是潜在的抑制剂细胞氧化的自由基。当王等人研究了同一物种DPPH实验中观察到,使用超声提取和乙醇发现抑制的比例最低(0.74%)比在本研究发现(37.2%)(1]。这一事实可能与变异株微藻和适当的成分。结果发现使用水提取证明令人满意,因为除了降低处理成本,导致产品没有发现的潜在的有毒残留物在其他溶剂。

表2:彻底清除提取物的性能c .寻常的

抗菌活性的c .寻常的

不同提取物的抗菌和抗真菌的影响在本研究评估活动。表3抑制的显示区域的大小(毫米)c .寻常的提取物对不同的菌株。水提物显示对大多数细菌抗菌活性测试,除了美国粪。观察生长抑制大肠粪只有当使用丙酮和DMSO的提取,与抑制区大小12毫米和15毫米,分别。其他提取物对测试显示没有抑制细菌。表4显示最低抑制浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)不同的摘录c .寻常的。根据Aligiannis et al,植物材料显示麦克风0.5毫克/毫升的值被视为强有力的抑制剂,值0.6 - -1.5毫克/毫升的温和的抑制剂,和威尔士人高于1.6毫克/毫升弱抑制剂(18]。这项工作的结果表明,提取的MIC值c .寻常的用以下溶剂:水更令人满意呢枯草芽孢杆菌(0.7毫克/毫升),DMSO对美国粪(0.55毫克/毫升)和丙酮为美国肠炎(0.8毫克/毫升)。古兹曼,猫和Calejja(2001),在评估methanolic提取物的抗炎活性的小球藻stigmatophora,没有发现显著的结果即使在高浓度的提取,只有在水提取物。这个结果是类似于目前的工作发现的抗菌活性c .寻常的对所有细菌测试。

表3:Size 的 抑制 区 (mm) (mean ± 标准 deviation) C. 寻常 的 提取 每 对 不同 strains. disc) (20L

表4:最低抑制浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)不同提取物的C。

根据Ki-Bong et al .,化合物从Odonthalia corymbifera显示有效的抗菌效果金黄色葡萄球菌,枯草芽孢杆菌、微球菌危害,变形杆菌属寻常的,和鼠伤寒沙门氏菌(19]。此外,抗真菌活性发现最活跃的反对白色念珠菌、曲霉菌来自烟,毛癣菌属石和毛癣菌属mentagrophytes。尽管有强大的抗菌活性,抗菌活性测试显示没有影响提取。

结论

总之,一系列的摘录c .寻常的已经准备好了。抗氧化活性的结果从不同溶剂获得了更高的效率使用水和DMSO,和一个更有效的提取和抗氧化活性的化合物。我们得出这样的结论:溶剂的亲水特性与这些结果。抗菌活性也较高的水和DMSO溶液提取,包括丙酮提取,也展示了一些细菌生长抑制(粪大肠,美国肠炎和枯草芽孢杆菌)。其他提取物对测试显示没有抑制细菌。微藻没有展示任何抑制真菌生长。我们的实验演示了一个过程导致水从微藻中提取的一个efficienct隔离使用一种更高效的协议,避免使用有毒残留物中发现其他溶剂。

确认

作者深表感激Departament抗生素,农村联邦大学的伯南布哥宝贵的援助。这项研究受到了慰问Nacional de尽管(CNPq), Fundacao德帕罗Ciencia e Tecnologia做Estado de伯南布哥(FACEPE)和Coordenacao de Aperfeicoamento de Pessoal de含量优越。

引用

1. 王H, et al .识别anti-lung癌症提取物小球藻寻常的碳碳byantioxidant财产使用超临界二氧化碳萃取。学生物化学过程。(2010);45:1865 - 1872。
2. 金正日年代,et al。潜在的药妆品来自海洋生物。BiotechnolBioprocEngin。(2008);13:511 - 523。
3. 古斯曼年代,et al . .抗炎、镇痛和自由基清除活性的海洋微藻小球藻stigmatophoraand Phaeodactylumtricornutum。植物疗法研究》(2001);15:224 - 230。
4. Vijayavel K,等。抗氧化作用的海藻小球藻对naphthalene-induced寻常的白化大鼠氧化应激。分子细胞生物化学。(2007)303:39-44。
5. Makridis P, et al .微生物条件和文化两种微藻的抗菌活性,Tetraselmischuii和小球藻minutissima和丰富Artemiametanauplii对细菌负荷的影响。Aquacul。(2006);255:76 - 81。
6. 广场,从微藻等。创新的天然功能性成分。阿格利司杂志》上。食品化学。(2009);57:7159 - 7170。
7. JulkunenTitto RJ。酚类成分在北部柳树的叶子:某些酚醛树脂的方法来分析。J阿格利司食品化学。(1985);33:213 - 217。
8. Zhishen J,蒙城县T, Jianming W (1999)类黄酮含量的测定桑及其对超氧化物自由基清除作用。食品化学64:555 - 559。
9. Soler-Rivas CJ,等。一种简单和快速测试来比较总自由基清除剂食品的能力。Phytochem肛门。(2000)11:1-9。
10. 作风,等。抗氧化活性的提取物Gevuina avellana和罗莎rubiginosadefatted种子。国际食品Res。(2001);34:103 - 109。
11. 科斯塔RMPB,等。一个新的槲寄生Phthirusa pyrifolia叶凝集素具有抗菌特性。ProcBiochemy。(2010);45:526 - 533。
12. 王兵Gui, et al .提取物的体外抗氧化活动和semi-purified分数的海洋红藻,Rhodomelaconfervoides(松节藻科)。食品化学。(2009年);113:1101 - 1105
13. Ganesan P, et al .甲醇提取物的抗氧化性能及其溶剂分数从选定的印度红海藻。Biores抛光工艺。(2008);99:2717 - 2723。
14. 洛佩兹,et al .溶剂的影响Stypocaulonscoparium酚醛含量和抗氧化活性的海藻提取物。食品化学(2011);125:1104 - 1109。
15. Ananthi年代,et al。体内体外抗氧化和抗炎的潜力从Turbinariaornata粗多糖(海洋褐藻).Food ChemToxicol。(2010年);48:187 - 192
16. 角色KR,等。抗氧化和放射防护效果的活跃部分Pileamicrophylla (l)ethanolicextract。Chemico-Biological交互。(2007);165:22-32。
17. 安德拉德CA, et al . Determinacao conteudo fenolico e avaliacao da atividade antioxidante de金合欢podalyriifolia Cunn。g .不交货Leguminosae-mimosoideae。巴西J医药。(2007);17:231 - 235。
18. Aligiannis N, et al。成分和两个Origanumspecies精油的抗菌活性。j . a .食品化学。(2001);49:4168 - 4170。
19. Ki Bong O, et al .抗菌活动的溴酚红藻类Odonthaliacorymbifera和一些合成衍生品。地中海Bioorg化学字母。(2008);18:1040 - 108。