研究和评论:微生物学和雷竞技苹果下载生物技术杂志》上
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P - ISSN: 2347 - 2286
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而法达席尔瓦1,2,她曾克里斯蒂娜Vitorino2,玛丽亚Andreia科雷亚资助者2,埃德森路易斯Souchie2*Luiz de Araujo Welington,3,Manuella Nobrega Dourado里贝罗3列奥纳多·达·芬奇达·德·阿尔伯克基4,马科斯安东尼奥苏亚雷斯5
1热带病理学和学院公共卫生戈亚斯的联邦大学,哥亚尼亚,巴西戈亚斯
2农业微生物实验室,联邦教育学院,科技Goiano校园,力拓佛得角,巴西戈亚斯
3实验室分子生物学和微生物生态圣保罗大学,巴西圣保罗
4联邦教育学院、科技Goiano校园Morrinhos,巴西戈亚斯
5植物学和生态生物科学学院,联邦大学的马托格罗索州,巴西马托格罗索州的首府库亚巴所召开
收到日期:31/10/2018接受日期:27/11/2018发表日期:05/12/2018
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内生植物的细菌社区动态,能够蔓延的植物组织,并执行可能对寄主植物的代谢功能。尽管目前药用植物共生微生物的兴趣高,很少知道endophilic细菌的功能特征芦荟精华素(l)发热管。f,不同的化学成分,具有各种生物活性物质的合成。像这种成分可以影响植物内生微生物群,我们测试的假设根的细菌芦荟精华素为植物的生长提供与潜在生物技术的多功能性。共有129个内生细菌从三个环境,一个字段,花园,和托儿所(n = 3),被孤立,系统发育分析显示四组的存在:变形菌门,厚壁菌门,拟杆菌门和放线菌。功能特征的合成吲哚乙酸(IAA)在32的隔离观察,强调135 v肠杆菌属烟应变,显示最高的生产(225.2μg毫升1)。结果发现Bayovar磷酸溶解不表达,最高的值观察细菌149 hParaburkholderiasp。(45.7毫克L1)。3 v隔离Brevibacillus阿勒提出了45.6%的对抗反对美国sclerotiorum。最大的抑制植物病原体镰刀菌素sp.和丝核菌观察sp. 149 hParaburkholderiasp.和348 ve .烟,分别。这是第一个研究来评估潜在的内生细菌芦荟精华素。我们的研究结果表明,隔离135 v和348 ve .烟和149 hParaburkholderiasp.有潜力在活的有机体内测试在促进植物生长。
内生菌;生长素;磷酸溶解;抗菌;功能特征;促进植物生长;Xanthorrhoeaceae。
植物与一系列微生物建立内在关系,如内生植物的根际的,和菌根生物,引起了科学界的兴趣。由于他们的好处1- - - - - -5]。这些微生物与寄主植物相关的自然,从内部可能发生。这是对植物内生微生物,在植物组织内部至少有一个生命周期的一部分6)不会导致功能损伤或疾病症状(5,7]。此外,他们可能会依赖于寄主植物,通过垂直传播或向量昆虫(8]。
植物内生细菌群落动态和有能力传播系统在植物组织(9]。这种殖民有几个好处,因为这个社区可以有效地交流和互动,不管环境条件的植物受到[10]。这增加了植物的生长11)和最大化保护植物病原体(12),这可以增强抗压力(13,14),可能刺激的合成或生产生物活性感兴趣的化合物(15- - - - - -17]。
几项研究已经证实,菌株与根能促进植物健康和成长通过phytostimulation等机制,生物肥料,和/或生物防除[18- - - - - -20.]。几个属,等假单胞菌(21- - - - - -22),Pantoea,芽孢杆菌(23),沙雷氏菌属,肠杆菌属(24),Azospirillum(25),而Paraburkholderia(26)对植物生长有益。
内生植物和微生物之间的关系结果直接生理影响植物的生长和发展,如:固氮作用[27)和磷酸盐溶解(23,28),以及氨的生产(29日),含铁细胞(18),激素(30.,31日),和水解酶(27]。这些好处满足当前的需要植物栽培可持续发展的减少化肥和农药的使用方法,取代传统的机制来保护土壤生物多样性。因此,战略选择的选择和使用微生物与生物技术的应用,影响植物的生长和健康,以及土壤质量和养分循环。
知识农学会关系和有害的影响,过度或不足的应用化肥对环境改变了农民的观点对生物制品的使用,如微生物菌剂;它们的使用增加了全球由于证明农艺的影响(32]。P化肥的生产是昂贵的,因为他们是基于不溶性磷酸岩的化学处理,使农民under-capitalized和一般家庭,繁重的。因此,基于phosphatesoluble生物技术bioinoculants已经被提议作为替代品增加P可用性作物,减少化肥的使用(33]。
细菌、真菌和放线菌等药用植物的孤立Asclepias sinaica(34),紫锥菊紫竹,金银花粳稻(35),萝芙木属serpentina,武靴叶,甜菊糖甙crenata,一种monnieri,穿心莲香,Withania somnifera(36),Teucrium polium(37),榄仁树属bohera,木薯耐(38),已经被证明是高效农业,已应用于不同作物由于他们执行多种功能。
药用植物在一个特定的方式选择内生菌时,因为选择可能基于产生的次生代谢物植物根系分泌物的组成;因此,这些微生物群体根据他们的营养需求,多样化的土壤类型,它们被发现的环境(39]。研究表明,宿主药用植物的生物活性化合物的合成也产生的植物内生微生物群(40- - - - - -43),有证据表明,代谢合成途径在植物和微生物(独立进化44,45),水平基因转移(46]。药用植物产生的代谢物以外也可以由植物内生微生物群,导致植物化学的概要的异质性和植物biofunctions [47- - - - - -49]。因此,药用植物可能代表现成的微生物与生物技术的潜在来源(34,50]。
芦荟精华素l。发热管。f。是植物闻名于世,传统医学和是重要的商业重要性51,52]。它广泛用于化妆品的生产,补养药,在食品行业52,巨大的药用潜力,大约75活性成分描述(53]。考虑到这种潜在可能是由于在endopathic社区的一部分芦荟精华素,我们测试了这种植物的根内生细菌的假设是多功能的,可以为农业贡献依然。
最近,Akinsanya et al。54]分离内生细菌芦荟精华素,包括假单胞菌hibiscicola,Macrococcus caseolyticus,肠杆菌属ludwigii,炭疽杆菌的医学的重要性,它可以产生生物活性化合物对细菌病原体的抗菌活性。在另一项研究中,Akinsanya et al。55)评估这种植物内生细菌群落的多样性通过宏基因组,并演示了一个更大的殖民根系;但是没有研究检查了这个社区所表达的功能特征。因此,为了解决这个差距,我们旨在孤立可培养的细菌分离株的根源芦荟精华素从异构环境,测试生物技术的潜力菌株的植物的生长。
研究区和样本收集
三的根系芦荟精华素人在不同环境中采样在里约热内卢佛得角,,巴西中西部,在以下位置和地理坐标:(1)托儿所(17°47.224纬度,经度050°57.966 'w,海拔786米),在与不同的植被,树栖和草本物种之间;(2)花园(17°48.137纬度,经度050°55.824 'w,和701米)的高度与草本植物,特别是药用植物,接受定期的文化治疗;雷竞技网页版和(3)场(经度纬度18°13.407的,51 'w 01.174°,海拔553米),人为地区的植被(图1)。采样与恢复的目标进行了广泛的多样性可培养的细菌,增加隔离细菌的机会为生物技术的应用程序和功能特征。为了避免这种气候因素可能影响微生物群落的动态,干扰结果,芦荟精华素植物采样当天(02/05/2015)08点和10点之间。这是雨天,收集不同地区之间的温度在19一个¹¡C和20一个¹¡C,而相对空气湿度保持在80%。
图1:的环境中芦荟精华素根收集。)字段:农场;B)足底的花园e维达合作;C)托儿所里约热内卢大学的佛,去;D)广泛的根系芦荟精华素。
个人选择没有明显疾病症状。收集到的根被存储在正确识别塑料袋和运输的农业微生物实验室如果Goiano,里约热内卢佛校园进行分析。
植物内生细菌的分离
内生细菌分离使用根碎片。这些在自来水清洗去除多余坚持土壤和碎片被动摇在水和中性洗涤剂(1%)在70转10分钟减少的密度附生植物的微生物。碎片的表面被连续消毒洗在乙醇(70%)、2.5%次氯酸钠(活性氯)和乙醇(70%)1分钟、5分钟和30秒。在过程的结束,四个洗进行使用热压处理过的蒸馏水。此外,整除100μL来自最后洗接种在营养肉汤(3 g肉汁,5 g蛋白胨)28°C的24小时测试灭虫法过程的效率。
杀灭片段被减少到大约1厘米长,放置在培养皿中含有马铃薯葡萄糖琼脂(Acumedia®;PDA)。内生细菌的生长监测到第十天。殖民的频率评估考虑片段的比例与至少一个内生细菌,与总片段进行分析,根据下面的公式。
殖民的频率=(没有。碎片/总碎片)x 100
丛枝菌根真菌(AMF)建立孢子提取
三个样品根际的土壤收集来自同一采样站点在0-20厘米深度。孢子是由wet-sieving提取的方法(56),50克干土是通过0.42毫米和0.053毫米筛筛子和离心机在水和在804 x 1811 x g g在50%蔗糖溶液,分别为3分钟,2分钟。孢子密度确定下通过计算z蔡司发现V8 (40 x)立体显微镜与canalettes在盘子里。
识别和隔离的系统发育关系
总基因组DNA提取纯化的细菌被程和江57]。细菌物种被确定基于16 s rRNA的部分序列,使用通用引物27 f (5‘aga GTT TGA中医TGG CTCAG-3”)和1492 r (5‘TAC GGY TAC CTT GTT ACG行动条t - 3”) (58]。
PCR产品使用PureLink快速凝胶提取和纯化PCR净化组合工具包(表达载体®按照制造商的指示。排序是由桑格法。与16 s基因片段序列至少900个基点BLASTn分析软件,每个菌株被发现通过国家生物技术信息中心爆炸(www.ncbi.nlm.nih.gov /爆炸)(59]。
隔离的系统发育关系推断使用661个snp序列中发现从16 s地区获得一致序列型核糖体数据库项目的从数据库中提取和使用软件的国家生物技术信息中心爆炸CLUSTALω(60]。参考序列选择的基础上获得的序列的相似程度的隔离,由数据库。
TrN + G序列的进化模型被选中使用贝叶斯信息准则(BIC),在软件中实现JMODELTEST 2 (61年]。系统发育树贝叶斯v.3.2.6先生是通过软件来进行推断。(62年),使用基于贝叶斯推理的方法。四个独立的进行运行,10×106代分配给每个链,每500代的后验概率分布。之前计算树的共识,并确保链的收敛,第一批2500棵树采样丢弃。随后,恢复系统测试的引导方法,5000复制,通过大型7项目(63年]。获得的树是无花果树可视化和编辑程序v 1.4.2 [64年]。一个序列Methylobacterium rhodinum被用作外群体。
选择植物内生细菌和植物激素的生产
吲哚乙酸(IAA)生产用于研究细菌的多功能潜力;只有细菌这种潜在的测试的其他特征。这一标准的使用反映了这样一个事实:根内生细菌与它的生物合成植物激素,可以直接影响其体内平衡,而根际微生物往往更与养分供应(65年]。
IAA生产量化使用比色法由戈登和韦伯(66年]。细菌分离株的培养下不断搅拌在营养肉汤培养基90 rpm (3 g肉汁,5 g蛋白胨)在72年28°C h。光密度(OD600年)的所有细菌样品被稀释调整至0.3与盐溶液(0.85%)。
IAA生产量化一式三份。细菌培养在营养肉汤培养基接种补充色氨酸(1%)和维持72 h在28°C在黑暗中在90 rpm。控制,肉汤培养基用于色氨酸没有细菌培养液。孵化后,样本离心机(5分钟12000转10°C),然后从每个隔离1毫升的上层清液转移到试管中,和1毫升Salkowski试剂(1875 g FeCl3.6H2啊,100毫升H2啊,150毫升H2所以4)补充道。
管被蒙在鼓里的15分钟28°C为进一步量化IAA的分光光度计(530海里)。IAA浓度得到使用校准曲线的方程可以同商业IAA (31日]。最多的32株IAA生产满意的结果然后测试其他功能特征。
磷酸溶解
细菌培养是标准化的OD600年0.3和接种一式三份,每个青霉素1毫升玻璃包含9毫升GY培养基(10 g葡萄糖,2 g酵母提取物),补充磷酸分别有四个来源:5 g L1从Bayovar磷酸反应自然,秘鲁(12.8% P), 5 g L1磷酸三钙(Ca3(PO4)2),2 g L1磷酸铁(FePO4),1 g L1磷酸铝(AlPO4)。这些仍在不断搅拌在90 rpm 72 h 28°C。控制,GY媒介使用与每个磷酸源。随后,pH值测量。无机P的数量是由比色法描述墨菲和莱利67年]。细菌磷酸溶解估计使用标准曲线方程。
含铁细胞生产
含铁细胞生产使用通用方法评估适应Schwyn和尼兰德(68年]。细菌分离培养在tryptophanin大豆培养基、稀释的1/10,在烤箱和孵化28°C h。72年该细胞悬液离心10分钟,每分钟12000转1毫升的上层清液转移到试管,然后1毫升chromoazide S (CAS)的解决方案是添加指标。转换CAS蓝色的解决方案在上层的橙黄色15分钟期间表示,隔离是生产含铁细胞的能力。
抗菌植物病原真菌
拮抗细菌对植物病原体菌核病sclerotiorum(白色的模具),镰刀菌素sp。丝核菌sp.测试使用双培养法[69年]。最初,四个内生细菌接种在每个板块的边缘包含PDA培养基,从板的中心3厘米,5毫米直径病原体菌丝体盘是沉积。包含植物病原体的控制治疗,一盘的中心使用。评估是相对于控制盘,菌丝体生长观察到3厘米远离中心,通过视觉分析。
隔离呈现某种程度的植物病原体抑制单独测试一式三份。在PDA培养基皮氏培养皿中,一个直径5毫米培养皿包含内生细菌和每个病原分离接种在相等的距离。的控制治疗包括一盘只包含植物病原体。板块在25°C,直到孵化病原体的菌丝发达,没有内生细菌的存在,在整个培养基。随后,引起的抑制区不同的内生细菌进行了评价。
每个真菌的直径测量厚度测量器和抑制真菌生长的区域是证实了细菌的抑制化合物的生产。每个治疗抑制百分比的计算使用的相对指数(RI),如下:
RI (%) = (RC−RX) / RC x 100,地点:
RC =半径病原体殖民地的控制治疗
RX =半径病原体的殖民地搭配内寄生的隔离
酶的评价
的酶活动(淀粉酶、纤维素酶、果胶酶和蛋白酶)菌株的评估。进行pre-inoculum细菌在生长在营养肉汤培养基为48小时在室温下90 rpm。每个隔离的测试,5μL micro-plating接种的培养基用于每个测试技术,每个培养皿和四个菌株进行了评估。
淀粉酶的生产
确定淀粉分解的活动,这种细菌被micro-plating接种在营养琼脂(NA)中补充0.2%可溶性淀粉(70年为72 h)和孵化28°C。培养基是15分钟然后Lugol覆盖解决方案。由于接触金属碘、一个透明的光环观察菌落周围产生淀粉酶(71年]。
纤维素酶的生产
确定纤维素酶的生产,培养基是作为被展出72年),即细菌接种在trypticasein大豆琼脂培养基(TSA)包含10 g / L纤维素和孵化72 h 28°C。刚果红溶液(0.3%)被添加到每个板在室温下15分钟,孵化。多余的就删除和氯化钠(1米)的解决方案是添加变色和孵化15分钟。Cellulase-producing细菌提供了一个浅色的光环与橙色边界,表明水解(73年]。
果胶酶的生产
确认生产果胶酶、Hankin等提出的方法。74年)是修改。短暂、PDA培养基使用果胶的+ 10 g / L。细菌生长为48小时28°C和15分钟的板上覆盖hexadecyltrimethylammonium溴铵溶液(1%)。这种试剂沉淀果胶在中,光区在殖民地表明果胶的降解通过果胶酶的作用。
蛋白酶生产
YPD介质(5 g蛋白胨、3 g酵母提取物,10 g葡萄糖,和20 g琼脂含有2%酪蛋白),并随着在热水高压灭菌法10分钟110°C。72 h盘子被孵化的28°C。细菌培养在这个媒介;protease-positive细菌形成了一个光光环围绕着他们的殖民地,表明蛋白酶的存在(71年]。
耐盐度
四个细菌,为植物生长在之前的测试中,提出了积极的特点。这些细菌的宽容是评估在营养琼脂培养基含有不同浓度的氯化钠(0,1,2,4,6%)和培养48 h 28°C,所描述的卡多佐et al。75年]。
统计分析
数据提交给方差分析和平均AMF孢子密度比较图基的测试(5%)。平均值为磷酸溶解、IAA合成和抗生Scott-Knott比较的测试(5%)。所有使用软件分析SISVAR [76年]。
隔离和内生细菌密度和AMF孢子
植物内生细菌在根碎片的殖民频率为100%,苗圃和花园样本为98.6%,样本。总共得到了129植物内生细菌,包括36场,从花园20和73年的托儿所。只有32隔离被选为后来的研究基于生长素生产如下:一个领域,从花园六,从托儿所25 (图2)。
图2:比例的内生细菌隔绝的根源芦荟精华素。细菌选择基于吲哚乙酸的生产和丛枝microrrheic真菌孢子(AMF)的根际的土壤样品,花园和托儿所。
土壤孢子密度差别显著环境评估;密度最高的托儿所样品在1375(50克1)与花园样本865(50克1样品在93(50克)和字段1)。
识别和隔离的系统发育分析
确定细菌代表10属,分布在四组。变形菌门最丰富,Gammaproteobacteria和所代表的类Betaproteobacteria;厚壁菌门,类杆菌;拟杆菌门、类Flavobacteriia;和放线菌、类放线菌。32隔离被确定的遗传相似度:肠杆菌属sp。(4),肠杆菌属asburiae(1),肠杆菌属烟(8),大肠ludwigii(4),Pantoea agglomerans(1),p . cypripedii(1),Lelliottia nimipressuralis(1),Paraburkholderiasp。(1),芽孢杆菌megaterium(3),b·阿勒(1),Lysinibacillus xylanilyticus(1),l . macroides(2),小细菌属aerolatum(1)和Chryseobacterium taiwanense(3)(图3)。
图3:基于16 s基因序列相似性树分离到的内生细菌的根源芦荟精华素在三个不同的网站最近的压力之间的关系。应变(T)类型。字母后隔离数字显示采样站点(V =托儿所,H =花园,和C =字段)。黑色数字表示后验概率低于节点,和蓝值高于基于10000复制节点代表引导价值。
IAA内生细菌的生产和选择
合成IAA的能力定量评估129年内生细菌;24.8%(32细菌)提出了积极的结果,不同浓度在0.3和225.2之间μg毫升1。19细菌隔离产生大量的植物激素(大于80μg毫升1),只有7个隔离了不到20μg毫升1IAA。135 ve .烟隔离产生最高的IAA浓度(表1)。
| 隔离 | IAA(μg毫升1) | σM± |
|---|---|---|
| 389 cPantoea cypripedii | 42.4 d | 1.5 |
| 62 h肠杆菌属sp。 | 113.7 b | 10.3 |
| 63 h肠杆菌属sp。 | 116.3 b | 6.7 |
| 65 h肠杆菌属sp。 | 119.4 b | 8.8 |
| 149 hParaburkholderiasp。 | 132.6 b | 1.9 |
| 180 h肠杆菌属sp。 | 97.9摄氏度 | 4.5 |
| 383 hLysinibacillus大环内酯类 | 5.7 d | 1.6 |
| 2 v芽孢杆菌megaterium | 6.4 d | 1.9 |
| 3 vBrevibacillus阿勒 | 0.3 d | 0.2 |
| 4 v芽孢杆菌megaterium | 5.3 d | 2.6 |
| 6 vLysinibacillus xylanilyticus | 7.9 d | 1.2 |
| 14 v肠杆菌属烟 | 119.2 b | 1.4 |
| 16 vLysinibacillus大环内酯类 | 29.9 d | 1.9 |
| 17 v肠杆菌属烟 | 83.0摄氏度 | 8.6 |
| 18 v肠杆菌属烟 | 113.3 b | 6.5 |
| 20 v肠杆菌属烟 | 88.6摄氏度 | 10.8 |
| 23 v小细菌属aerolatum | 11.6 d | 6.7 |
| 32 vChryseobacterium taiwanense | 24.3 d | 1.2 |
| 35 v肠杆菌属ludwigii | 122.8 b | 3.7 |
| 38 v肠杆菌属asburiae | 152.1 b | 0.7 |
| 41 v芽孢杆菌megaterium | 8.3 d | 1.2 |
| 43 v肠杆菌属烟 | 111.6 b | 12 |
| 49 v肠杆菌属ludwigii | 83.2摄氏度 | 11.1 |
| 54 vPantoea agglomerans | 20.7 d | 1 |
| 116 vChryseobacterium taiwanense | 22.1 d | 0.5 |
| 125 vChryseobacterium taiwanense | 24.3 d | 2.9 |
| 126 v肠杆菌属ludwigii | 101.0摄氏度 | 8.7 |
| 127 v肠杆菌属ludwigii | 115.9 b | 3.1 |
| 128 v肠杆菌属烟 | 131.0 b | 6.8 |
| 135 v肠杆菌属烟 | 225.2 | 2.9 |
| 348 v肠杆菌属烟 | 103.4摄氏度 | 1.6 |
| 349 vLelliottia nimipressuralis | 104.0摄氏度 | 1.8 |
平均值遵循相同的字母不之间相差Scott-Knott测试(5%);σM =平均数标准误差。
表1:在体外由细菌生产吲哚乙酸(IAA)获得的根源芦荟精华素。
磷酸溶解
最大Bayovar磷酸溶解细菌检测到的149 hParaburkholderiasp。(45.7球型投手1),这减少了pH值为3.3。最有效的增溶的Ca3(PO4)2观察分离389 cPantoea cypripedii(36.5毫克升1),pH值3.9。对于FePO4,只有四个细菌溶解,虽然观察到较低水平,在≤3.4。当使用AlPO4作为磷源,没有观察到任何溶解细菌的测试。隔离383 hLysinibacillus macroides6 v和16 vl . xylanilyticus,116 v和125 vc . taiwanense没有溶解的磷酸源测试。正如预期的那样,最终的pH值是更高的增溶水平较低(表2)。
| 隔离 | Bayovar磷酸 | Ca3(PO4)2 | FePO4 | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| pH值 | L P可溶性(毫克1) | σM± | pH值 | L P可溶性(毫克1) | σM± | pH值 | L P可溶性(毫克1) | σM± | |
| 389 cPantoea cypripedii | 6.3摄氏度 | - - - - - - | - - - - - - | 3.9 | 36.5 | 0.18 | 3.4 | 2.8 | 0.02 |
| 62 h肠杆菌属sp。 | 5.2 b | 7 c | 0.09 | 6.7 e | 4.9克 | 0.03 | 7 f | - - - - - - | - - - - - - |
| 63 h肠杆菌属sp。 | 5.3 b | 5.7摄氏度 | 0.11 | 6.8 e | 2.1 h | 0.02 | 7.2度 | - - - - - - | - - - - - - |
| 65 h肠杆菌属sp。 | 4.4 | 10.3 b | 0.09 | 6.8 e | 2 h | 0.01 | 6.9度 | - - - - - - | - - - - - - |
| 149 hParaburkholderiasp。 | 3.3 | 45.7 | 0.12 | 6.1 d | 29.6 b | 0.29 | 7 f | - - - - - - | - - - - - - |
| 180 h肠杆菌属sp。 | 5 b | 12.9 b | 0.03 | 6.8 e | 2.1 h | 0.01 | 8 f | - - - - - - | - - - - - - |
| 383 hLysinibacillus macroides | 8.1 d | - - - - - - | - - - - - - | 8 f | - - - - - - | - - - - - - | 7 d | - - - - - - | - - - - - - |
| 2 v芽孢杆菌megaterium | 4.1摄氏度 | 2.6 d | 0.04 | 5.5摄氏度 | 8.7度 | 0.03 | 5.6 d | - - - - - - | - - - - - - |
| 3 vBrevibacillus阿勒 | 7.5 d | - - - - - - | - - - - - - | 7.1 e | - - - - - - | - - - - - - | 4.2 b | 2.1 | 0.03 |
| 4 v芽孢杆菌megaterium | 4.5 | - - - - - - | - - - - - - | 4.8 b | 23.8摄氏度 | 0.06 | 4.8摄氏度 | - - - - - - | - - - - - - |
| 6 vLysinibacillus xylanilyticus | 7.5 d | - - - - - - | - - - - - - | 8 f | - - - - - - | - - - - - - | 7.8度 | - - - - - - | - - - - - - |
| 14 v肠杆菌属烟 | 6.8摄氏度 | - - - - - - | - - - - - - | 6.6 e | 8.4度 | 0.02 | 7.1度 | - - - - - - | - - - - - - |
| 16 vLysinibacillus macroides | 6.4摄氏度 | - - - - - - | - - - - - - | 8.2度 | - - - - - - | - - - - - - | 5.8 d | - - - - - - | - - - - - - |
| 17 v肠杆菌属烟 | 6.9摄氏度 | - - - - - - | - - - - - - | 6.7 e | 9.1度 | 0.06 | 7.1度 | - - - - - - | - - - - - - |
| 18 v肠杆菌属烟 | 4.8 b | 3 d | 0.03 | 4.9 b | 21.5 d | 0.03 | 5.3 d | 0.7 b | 0.02 |
| 20 v肠杆菌属烟 | 6.7摄氏度 | - - - - - - | - - - - - - | 6.7 e | 5.9克 | 0.03 | 6.7 e | - - - - - - | - - - - - - |
| 23 v小细菌属aerolatum | 6摄氏度 | - - - - - - | - - - - - - | 5.3摄氏度 | 18.2 d | 0.07 | 5.7 d | - - - - - - | - - - - - - |
| 32 vChryseobacterium taiwanense | 6.9摄氏度 | - - - - - - | - - - - - - | 6 d | 6.1克 | 0.02 | 5.6 d | - - - - - - | - - - - - - |
| 35 v肠杆菌属ludwigii | 5.3 b | 12.3 b | 0.09 | 6.6 e | 12.6 e | 0.05 | 7.1度 | - - - - - - | - - - - - - |
| 38 v肠杆菌属asburiae | 6.7摄氏度 | - - - - - - | - - - - - - | 6.6 e | 4.1克 | 0.04 | 7 f | - - - - - - | - - - - - - |
| 41 v芽孢杆菌megaterium | 4.1 | 2.1 d | 0.01 | 4.9 b | 25.6摄氏度 | 0.12 | 5.4 d | - - - - - - | - - - - - - |
| 43 v肠杆菌属烟 | 6.7摄氏度 | - - - - - - | - - - - - - | 6.5 e | 6.7克 | 0.05 | 7.2度 | - - - - - - | - - - - - - |
| 49 v肠杆菌属ludwigii | 4.3 | 16.9 b | 0.09 | 6 d | 3.3 h | 0.02 | 6 d | - - - - - - | - - - - - - |
| 54 vPantoea agglomerans | 5.1 b | 7.1摄氏度 | 0.08 | 6、1 d | 24.6摄氏度 | 0.05 | 4.8摄氏度 | 3.4 | 0.01 |
| 116 vChryseobacterium taiwanense | 6.6摄氏度 | - - - - - - | - - - - - - | 6.2 d | - - - - - - | - - - - - - | 5.5 d | - - - - - - | - - - - - - |
| 125 vChryseobacterium taiwanense | 6.9摄氏度 | - - - - - - | - - - - - - | 6.2 d | - - - - - - | - - - - - - | 5.5 d | - - - - - - | - - - - - - |
| 126 v肠杆菌属ludwigii | 4.5 | 9 b | 0.01 | 6.5 e | 14.5 e | 0.18 | 6.6 e | - - - - - - | - - - - - - |
| 127 v肠杆菌属ludwigii | 5.2 b | 11.5 b | 0.16 | 6.7 e | 3.8 h | 0.01 | 6.8 e | - - - - - - | - - - - - - |
| 128 v肠杆菌属烟 | 6.6摄氏度 | - - - - - - | - - - - - - | 6.7 e | 2.4 h | 0.03 | 7 f | - - - - - - | - - - - - - |
| 135 v肠杆菌属烟 | 4.4 | 13 b | 0.01 | 6.7 e | 9 f | 0.13 | 5.6 d | - - - - - - | - - - - - - |
| 348 v肠杆菌属烟 | 4.4 | 14 b | 0.05 | 6.9 e | 2.4 h | 0.07 | 5.7 d | - - - - - - | - - - - - - |
| 349 vLelliottia nimipressuralis | 4.3 | 5度 | 0.04 | 6.6 e | 5.5克 | 0.18 | 6.3 e | - - - - - - | - - - - - - |
平均紧随其后的是相同的字母不之间相差Scott-Knott测试(5%)。(-)表示没有溶解;σM =平均数标准误差。
表2:pH值和体外溶解Bayovar自然磷(P)、磷酸三钙(Ca3(PO4)2)和磷酸铁(FePO4),芦荟根内生细菌
抗菌和含铁细胞生产
初步筛选32细菌显示,40.6%(13)的隔离施加一定程度的菌丝体的生长抑制的美国sclerotiorum,34.4% (11)镰刀菌素(7)对sp, 21.9%丝核菌sp。图4)。定量评估的敌对活动美国sclerotiorum显示变化的11.4 - 45.6%的相对抑制。在隔离中,383 h l . macroides 3 vBrevibacillus阿勒,14 v和17肠杆菌属烟提出了抑制率在45.6%和35.6之间。为植物病原体镰刀菌素sp.和丝核菌sp,相对抑制较低,达到不超过34%,最高水平的细菌149 hParaburkholderiasp.和348 v肠杆菌属烟(表3)。含铁细胞生产所有细菌隔离是负面的评价。
| 隔离 | 菌核病sclerotiorum | 镰刀菌素sp。 | 丝核菌sp。 | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 钢筋混凝土1 (厘米) |
σM(RC)± | 国际扶轮2(%) | 钢筋混凝土1(厘米) | σM(RC)± | 国际扶轮2(%) | 钢筋混凝土1(厘米) | σM(RC)± | 国际扶轮2(%) | |
| 389 cPantoea cypripedii | 8.0摄氏度 | 0.07 | 11.4 | 8.0 b | 0.07 | 11.5 | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - |
| 62 h肠杆菌属sp。 | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - |
| 63 h肠杆菌属sp。 | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | 8.4 b | 0.08 | 6.3 | 7.1 b | 0.04 | 21.5 |
| 65 h肠杆菌属sp。 | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | 8.8 b | 0.05 | 1.9 | 8.8摄氏度 | 0.11 | 2.2 |
| 149 hParaburkholderiasp。 | 6.5 b | 0.13 | 28.1 | 6.1 | 0.05 | 32.2 | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - |
| 180 h肠杆菌属sp。 | 7.0摄氏度 | 0.05 | 21.9 | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - |
| 383 hLysinibacillus macroides | 5.3 | 0.5 | 41.4 | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - |
| 2 v芽孢杆菌megaterium | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - |
| 3 vBrevibacillus阿勒 | 4.9 | 0.06 | 45.6 | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - |
| 4 v芽孢杆菌megaterium | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - |
| 6 vLysinibacillus xylanilyticus | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - |
| 14 v肠杆菌属烟 | 5.1 | 0.17 | 43 | 8.1 b | 0.04 | 10.4 | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - |
| 16 vLysinibacillus macroides | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - |
| 17 v肠杆菌属烟 | 5.8 | 0.23 | 35.6 | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - |
| 18 v肠杆菌属烟 | 7.3摄氏度 | 0.11 | 19.2 | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - |
| 20 v肠杆菌属烟 | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - |
| 23 v小细菌属aerolatum | 7.8摄氏度 | 0.23 | 13.7 | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - |
| 32 vChryseobacterium taiwanense | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - |
| 35 v肠杆菌属ludwigii | 6.2 b | 0.12 | 31.4 | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - |
| 38 v肠杆菌属asburiae | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | 8.7 b | 0 | 3.3 | 7.7 b | 0.37 | 14.1 |
| 41 v芽孢杆菌megaterium | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - |
| 43 v肠杆菌属烟 | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - |
| 49 v肠杆菌属ludwigii | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | 8.1 b | 0.23 | 10 | 7.1 b | 0.36 | 21.5 |
| 54 vPantoea agglomerans | 7.2摄氏度 | 0.07 | 19.7 | 7.9 b | 0.35 | 11.9 | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - |
| 116 vChryseobacterium taiwanense | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | 7.1 b | 0.04 | 21.5 |
| 125 vChryseobacterium taiwanense | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - |
| 126 v肠杆菌属ludwigii | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - |
| 127 v肠杆菌属ludwigii | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | 8.9 b | 0.06 | 1.1 | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - |
| 128 v肠杆菌属烟 | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | 8.4 b | 0.06 | 6.7 | 8.9摄氏度 | 0.04 | 0.7 |
| 135 v肠杆菌属烟 | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - |
| 348 v肠杆菌属烟 | 6.6 b | 0.17 | 27 | 6.8 b | 0 | 24.4 | 6.0 | 0.28 | 33.7 |
| 349 vLelliottia nimipressuralis | 6.8 b | 0.03 | 24.8 | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - |
| 控制 | 9.0 d | 0 | 0 | 9.0 b | 0 | 0 | 9.0摄氏度 | 0 | 0 |
平均紧随其后的是相同的字母不相差Scott-Knott测试(5%);1植物病原体半径的殖民地。2相对抑制。(-):表示没有抑制活性;σM =平均数标准误差
表3:抑制植物病原真菌的菌丝的生长菌核病sclerotiorum,镰刀菌素sp。丝核菌sp.由内生细菌在对立的测试中在体外。
图4:双文化测试之间根芦荟内生细菌和植物病原体菌核病sclerotiorum,镰刀菌素sp。丝核菌sp。(一)美国sclerotiorum(控制);(B)植物病原真菌之间的对立美国sclerotiorum和细菌14 v肠杆菌属烟。(C)镰刀菌素sp。(控制);(D)之间的对立镰刀菌素sp.细菌149 hParaburkholderiasp (E)。丝核菌sp。(控制);(F)之间的对立丝核菌sp.细菌348 v肠杆菌属烟。
显微图像显示相关经过4天的形态学变化美国sclerotiorum植物病原体与内生细菌培养。一些菌丝肿了起来,扭曲和脱水,和其他人倒塌(图5)。
图5:植物病原真菌的菌丝的形态改变美国sclerotiorum由红色箭头表示与根内生细菌相互作用后的芦荟精华素。(一)控制的菌丝美国sclerotiorum;(B)与3 v的交互b·阿勒细菌——菌丝肿胀;14 v (C)肠杆菌属烟细菌——菌丝扭曲;(D)细菌17 ve .烟-退行性菌丝的形态变化;(E) 383 h l . macroides细菌——菌丝倒塌或肿胀。
酶和耐盐碱的评估
有淀粉分解的活动的证据(11)34.4%的细菌,细菌隔离2 v、4 v, v (41b . megaterium),3 v (b·阿勒),18 v和135 v (e .烟)、23 v (m . aerolatum),32 v, 116 v和125 v (c . taiwanense)和349 v (l . nimipressuralis)。没有纤维素酶、蛋白酶、果胶酶活动观察细菌测试。
对盐度、选中的细菌中,35 v大肠ludwigii135 ve .烟,389 c p . cypripedii呈现良好的增长在所有生理盐水的浓度,而149 hParaburkholderiasp.不容忍的最高浓度的氯化钠(4%和6%)。
多功能潜力的隔离
没有32隔离测试所有的13个功能特征评估。只有三个分离株能产生IAA,和六个功能特征评估观察的三种细菌(图6)。主要特征是IAA生产和磷酸氢钙溶解(图6 b)。
图6:多功能的潜力内生细菌与从不同的站点a·维拉的根源。)数量的细菌分离株表达生物技术的潜在功能特征;B)的隔离呈现每个功能特性评估(IAA合成、淀粉酶生产、Bayovar磷酸溶解,钙和铁,和抗菌植物病原体美国sclerotiorum,镰刀菌素sp。丝核菌sp)。
隔离149 hParaburkholderiasp, 135 v和348 ve .烟的,值得注意的是,他们的表达功能特征评估(图7)。产生的135 v隔离IAA检测到的最高水平,并显示潜力Bayovar磷酸溶解,淀粉酶生产、和耐盐碱,而149 h隔离产生第二个最高水平的IAA, Bayovar磷酸盐溶解的最高价值,相对抑制镰刀菌素sp。348 v隔离显示良好的潜力IAA合成、Bayovar磷酸溶解,和植物病原体抑制,特别是丝核菌sp。
图7:内生细菌149 h Paraburkolderia sp, 135 v和348 v肠杆菌属烟隔离的根源芦荟精华素这些隔离和功能表达的特征。箭头表明隔离表示指定的特征。
尽管植物用于传统医学的兴趣高,很少知道共生这些植物与植物内生微生物协会(23,17,77年]。本研究首先对多功能的潜力菌株分离的根源芦荟精华素。
高细菌殖民化和大量的AMF孢子观察的托儿所。在这种环境下,芦荟精华素植物与植物的多样性。根据席尔瓦et al。78年),AMF密度可以解释为各种各样的植物物种;因此,这个系统与高植被多样性呈现高值指数。
这项研究的结果表明,环境的特点影响细菌群落的功能多样性。例如,36内生细菌隔绝,植被稀少,但只有其中一个物种(Pantoea cypripedii)能够产生IAA和现在的其他功能特征。从花园,在那里标本密切相关的多种药用植物,20细菌分离,其中六株肠杆菌属sp。Paraburkholderiasp.和Lysinibacillus macroide IAA的初始特征生产,以及其他跟踪评估。从托儿所,树木的和草本物种丰富,得到了更多的隔离(73),和25的功能特征,所代表的物种p . agglomerans肠杆菌sp。e .烟e . ludwigii e . asburiae l . nimipressuralis b . megaterium b·阿勒l . xylanilyticus l . macroides m . aerolatum和c taiwanense。
我们确定了大量的组织变形菌门和Firmicutis隔离,紧随其后放线菌和类细菌。这些团体的优势也观察到Akinsanya et al。54),进行了宏基因组研究确定内生细菌等组织的叶子,茎和根芦荟精华素。在我们的样本中,我们发现之前被报道为细菌生长促进剂,与潜在的促生、生物防治和生物肥料12,26,79年,80年]。这些细菌属于属芽孢杆菌(81年,82年),Paraburkholderia(26,83年),肠杆菌属(12,84年),Lysinibacillus(85年),小细菌属(80年),Pantoea(86年]。
一些家庭的属肠杆菌属iaceae是多源的,包括肠杆菌属和Paraburkholderia,目前正在修订,从而阻碍了分配相关的新物种只使用16 s rRNA基因序列。一个例子是细菌l . nimipressuralis原分类肠杆菌属(87年]。属Paraburkholderia,包含刺激经济物种,也是最近重命名。这以前属于属洋葱,一组包含机会病原体对人类和动物健康有害(88年]。α-和β-Proteobacteria类固氮相关(1,89年]。属的存在肠杆菌属、Pantoea和Paraburkholderia的根芦荟精华素可能发挥重要作用在这种植物的氮吸收。
在这项研究中,属肠杆菌属代表54%的隔离,物种证明IAA生产能力,Bayovar磷、钙和铁溶解抗生素活动对植物病原体美国sclerotiorum,镰刀菌素sp。丝核菌sp。也观察到类似的结果Nutaratat et al。90年与应变)肠杆菌属sp。DMKU-RP206显示,IAA生产潜力巨大,磷酸溶解,氨和含铁细胞生产和对抗病原大米真菌Curvularia lunata,丝核菌以上,镰刀菌素moniliforme。
厚壁菌门的门产生一系列微生物代谢物,酶,表面活性剂促进生长和诱导系统性抗性植物(91年]。属的细菌芽孢杆菌了抵抗金属和可用于植物修复。此外,他们生产了多种纤维素酶等酶,淀粉酶、木聚糖酶。属细杆菌属的细菌,属于门放线菌,也表明这些酶的合成,潜力和磷酸盐的溶解92年]。
Bacteriodetes,细菌就代表着Chryseobacterium taiwanense,已报告有潜在的生物技术应用,包括酶和颜料的生产(93年- - - - - -96年]。压力评估本研究能够产生淀粉酶和植物激素IAA。
生长素是由32 129细菌测试,强调135 ve .烟有有限的文献,一个物种。这是最近描述为一个新的属的成员,从烟草植物的茎和孤立97年]。0.3之间的水平的IAA合成不同μg毫升1和225.2μg毫升1,即最大值明显高于观察内生细菌获得其他药用物种如Hyptis marrubioides [98年),菲amarus [27),t . polium [37]。
IAA的含量的变化可以解释的位置负责生物合成的基因,这些基因的位置调节这种植物激素的水平。当基因是位于染色体DNA,他们导致较低的生产;然而,当它们位于质粒,他们生产导致更大的生长素,几位基因的存在99年]。
磷酸盐溶解之间的关系和培养基酸化得到了证实,因为P的微生物溶解在有机和无机土壤通常是与轻量级的分子有机酸的释放有关。通过羟基和羧基组,这些螯合阳离子结合磷酸,从而将它转化为可溶性形式(One hundred.]。这些有机酸可能包括醋酸、乳酸、苹果酸、草酸、琥珀酸、柠檬酸、葡萄糖酸(101年]。其他P溶解机制包括H +排泄和酸性磷酸酶生物合成(102年]。
古普塔et al。34根际细菌的索芦荟使用评估假单胞菌synxantha,洋葱剑兰,肠杆菌属hormaechei,粘质沙雷氏菌和观察磷酸三钙溶解在340毫克L1L和150毫克1。这些级别很高,相比,那些获得本研究使用芦荟植物内生细菌。我们观察到溶解水平从45.7球型投手12.1球型136.5磷酸Bayovar,球型投手12.1球型1对Ca3(PO4)2和3.4球型10.7球型1对于FePO4。这些水平表明,溶解不是主要的功能特征分析菌株。
本研究的另一个重要的功能特征评价抗菌植物病原体。属Brevibacillus显示潜在的抑制美国sclerotiorum。这个植物病原体是一个世界性的necrotrophic攻击的主机,包括400多个植物物种(103年),如菜豆(104年),大豆(105年),而芸苔属植物显著(106年]。在目前的研究中,3 vb·阿勒抑制诱导45.6%,诱导形态植物病原菌丝的变化(图5)。
莫汉蒂et al。107年]分离内生细菌麻疯树curcase并观察属的优势Brevibacillus积极的IAA生产特点和磷酸酶,诱导玉米幼苗的生长。在目前的研究中,b·阿勒物种显示低潜力IAA合成和磷酸溶解,但显著抑制植物病原体美国sclerotiorum。在一项由悦et al。108年),Brevibacillus抑制的增长美国sclerotiorum菌核的形成,Joo et al。109年)证实了根际的的影响Brevibacillus在几个种镰刀菌素。菌株的生物防治剂属被认为是潜在的候选人,由于抗生素生产和生物膜形成(如Arrigoni et al。110年];井等。111年];熊猫et al。112年]。Brevibacillusbrevi应变fjat - 0809 glx所评估坚美et al。113年),抑制病原体的扩散通过抗菌物质羟苯乙酯的生产,除了几丁质酶,抑制的七种类型的病原体:Ralstonia solanacearum,鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、尖孢镰刀菌、黑曲霉、腐皮镰刀菌,镰刀菌素moniliforme。
在这种背景下,细菌之间的类杆菌是最具代表性的能够抑制植物病原真菌的生长,符合许多对手的特性(23,114年- - - - - -117年]。这是因为这个类的细菌合成抗菌物质,如防腐、和酶攻击植物病原真菌的细胞壁,如几丁质酶(113年与抗真菌特性[],lipopeptides118年- - - - - -120年]。因此,一些研究证实细菌作为生物防治剂的潜力,鼓励他们使用在农业(113年]。
相反,植物病原体镰刀菌素sp.更大程度上抑制了细菌149 hParaburkholderiasp. RI的32.2%。霍et al。121年还观察到抑制活动Paraburkholderia根腐病菌根际分离。然而,植物病原体丝核菌sp.主要是抑制内寄生的348 ve .烟,33.7%的RI (图4)。是最近描述物种,额外的数据不可用文献中证实这种细菌抑制植物病原体的能力。
除了IAA合成外,大部分的压力测试(91%)表示其他功能特征的生物技术的重要性。因此,我们的经费支持的假设根内生细菌芦荟精华素显示多功能性,和一些有生物技术的潜力。的一些功能特性可以在合作行为,有利于植物的生长和发育,改善作物的健康和性能。在功能性特征评价中,指标通过多功能135 v和348 v隔离,这都是肠杆菌属烟是值得注意的。尽管这是一个最近描述物种,Salkar et al。122年]孤立的这个物种的生物技术的潜力,表明其在可持续农业系统中使用。另一个值得注意的分离与检测指标是149 hParaburkholderiasp。此属包含环境细菌,包括有前途的候选人为生物技术的应用程序(26,123年]。在活的有机体内使用这个属的机制菌剂已被评估和积极影响经济增长和生产率一直在观察(如伯纳乌et al。26];拉赫曼et al。124年])。因此,在这项研究中,我们已经证实一些内生菌株的体外生物技术的潜力芦荟精华素,特别是135 v、348 v和149 h。这是第一个研究来评估根植物内生细菌的社区芦荟精华素,为未来提供机会使用这个物种的内生细菌菌剂促进植物的生长。
本研究证明了植物内生细菌root-endophytic的多功能性芦荟精华素尤其是在隔离135 v和348 v肠杆菌属烟和149 hParaburkholderiasp,表示一组功能特征与潜在应用植物生长。未来在活的有机体内评估应该确认潜在的这些菌株的菌剂,生物肥料,或生物防治植物病原体的代理人以取代化学物质和增加作物生长,健康和生产力。
作者感谢Goiano联邦理工学院——力拓佛校园提供基础设施和材料开展这项工作;Pro-Centro-Oeste网络和基础研究支持戈亚斯州(FAPEG)财政援助;和改善高等教育的协调人员(披肩)博士奖学金授予第一作者。
作者宣称没有利益冲突。