研究和评论:微生物学和雷竞技苹果下载生物技术杂志》上
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P - ISSN: 2347 - 2286
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小梅张1张董,1高,洁具1张,小娟2,3,提供关于徐2,3回族,李1施,劲松1许,经2,3*
1学院制药工程实验室,制药学科学,江南大学,无锡214122年,中国
2国家工程实验室麦片发酵214122年技术,江南大学,无锡,中国
3工业生物技术重点实验室,教育部,生物技术学院的江南大学,无锡214122年,中国
收到日期:06/01/2020;接受日期:20/01/2020发表日期:27/01/2020
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在这项研究中,自适应进化实验室(ALE)结合生物传感器是用来改善L-serine产量。首先,serine-biosensor是建于E。杆菌的转录监管机构NCgl0581 glutamicum,此外,serinebiosensor的有效性和敏感性进行了研究,结果表明,serine-biosensor pds从c glutamicum以大肠杆菌是有效的,只有细胞L-serine biosynthesized被serine-biosensor监控。大肠杆菌4 w能产生1.1 g / L L-serine从甘油作为应变开始,和L-serine甘氨酸的降解途径4 w被CRISPR / Cas9删除,导致应变4 wg L-serine效价为2.01 g / L。4 wg被使用ALE结合serine-biosensor进一步进化,进化压力4 wgx达到了0.41 g / g甘油的产量,并可能产生4.13 g / L L-serine高出105%和275%,分别为4 wg和4 w,此外,4 wgx显示更好的增长在中50 g / L L-serine,指示其更好L-serine宽容。这项工作表明,从c . glutamicum serine-biosensor是有用的在选择丝氨酸超量产生大肠杆菌,这扩大了生物传感器的应用,提供了更多的筛选高性能应变策略。
大肠杆菌,生物传感器,甘油,适应实验室进化,L-serine
L-Serine是一种非必需氨基酸,人体的重要生理功能,广泛应用于医药、食品和化妆品行业(1,2]。大多数微生物L-serine生产过程依赖于大肠杆菌(大肠杆菌)或棒状杆菌glutamicum (c . glutamicum)作为生产主机(1- - - - - -8]。然而,c . glutamicum增长缓慢,从而导致长制造周期。相比之下,c . glutamicum,大肠杆菌有更高的增长率,代谢工程方法是发达,因此建议生产L-serine大肠杆菌有很大潜力(1,5,9]。
同时,除了传统的发酵基质如葡萄糖、蔗糖和其他糖原料、甘油已经成为一个竞争非常激烈的新选择10,11]。不可再生的化石能源日益枯竭,寻找新的替代能源,如生物柴油,已成为首要任务。然而,大规模的开发和利用生物柴油带来了另一个严重的问题:粗甘油的治疗和重用,生物柴油生产的副产品。据统计,每10公斤的生物柴油生产大约1公斤的粗甘油副产物(12,13]。如果这些副产品可以转化为高附加值化学品,不仅原油甘油可以重用,还化学可以降低成本。因此,使用甘油作为碳源生产高附加值化工产品生物柴油行业已成为一个主要话题(14,15]。
使用甘油作为底物产生的化学物质主要包括莽草酸、乳酸、琥珀酸、赖氨酸,1,3 -丙二醇形成规模化L-phenylalanine和11,13,16- - - - - -19]。然而,只有我们之前的研究描述了生产的L-serine甘油作为底物(20.),所有研究L-serine的生产大肠杆菌专注于葡萄糖。在重组大肠杆菌MG1655应变、丝氨酸退化是删除,eamA(半胱氨酸/乙酰丝氨酸运输车)过度表现,产生的应变产生11.7 g / L L-serine从葡萄糖苏氨酸之外(5]。此外,一种进化压力通过自适应进化实验室(ALE)积累了37个g / L L-serine从葡萄糖产量为0.24 g / g葡萄糖(1]。在最近的一项研究中,50 g / L的L-serine产生葡萄糖大肠杆菌,产量0.26 - -0.30 g / g葡萄糖(21]。相比之下,从葡萄糖、甘油的代谢途径L-serine较短,和碳原子经济也是更好的20.]。重组菌株大肠杆菌4 w,生产能力1.1 g / L的L-serine以甘油为基质,是建立在我们之前的研究(20.]。然而,它L-serine收益率相对较低,L-serine严重抑制细胞生长的菌株4 w。实现高产L-serine产生应变,除了修改代谢途径,提高菌株的丝氨酸宽容和增长率也是必要的。
适应性进化实验室,也称为进化工程、代谢工程已经成为一个有价值的工具为应变发展和优化可靠地促进微生物适应性改进(22),啤酒可以用来增加菌株的生长速率和宽容,和提高产品产量23,24]。然而,传统的筛选步骤是费力而耗时的。有需要开发一个有效的方法来筛选高性能压力(25]。大规模筛选(高温超导)与生物传感器被用来屏幕高产菌株(26- - - - - -31日]。在我们之前的研究32),的serinebiosensorc . glutamicum构建和使用屏幕L-serine高产菌株。然而,生物传感器的不同的表达的知识也是有效筛选高性能应变。
在这项研究中,serine-biosensor的有效性和敏感性c . glutamicum研究了在大肠杆菌首先,随后,增加L-serine生产,我们使用CRISPR / Cas9基因敲除基因glyA编辑技术,编码一个L-serine降解途径酶(丝氨酸羟甲基转移酶)大肠杆菌4 w,从而导致应变4工作组。的serine-tolerant压力大肠杆菌4 wg增强通过ALE结合基于serine-biosensor大规模筛选方法;和发展压力大肠杆菌4 wgx被这种策略选择。此外,进化压力4 wgx丝氨酸的公差进行了研究,和4 wgx的整个基因组测序,和比较基因组学分析和反向变异进行(图1)。
图1:协议的构造应变4 wgx超量产生L-serine甘油。GlyA编码丝氨酸羟甲基转移酶、红色十字架上实线()表示基因被删除。4 w与删除sdaA构造,sdaB, tdcG(三个基因编码L-serine脱氨酶)和删除反馈抑制血清(血清磷酸甘油酸脱氢酶编码)在我们先前的研究。
菌株和质粒
菌株和质粒用于本研究进行了总结表1。引物基因克隆列出和删除表2。应变4 w,携带sdaA删除,sdaB tdcG,构建在我们之前的研究20.]。的serine-biosensor pds从c . glutamicum也是建立在我们之前的研究32]。的质粒pTarget和pCas用于击出glyA基因。
| 菌株和质粒 | 描述 | 来源 |
|---|---|---|
| 菌株 | ||
| E .coli JM109 | recA1、endA1 gyrA96、thi-1 hsd R17 supE44 (rk -可+) | 表达载体 |
| 4 w | W3110A¢A³tdcGA¢A³sdaAA¢A³sdaB serAdr | 表达载体 |
| 4个工作组 | 4佤邦¢³glyA | 本研究 |
| 4 w-pder | 4 w窝藏丝氨酸-生物传感器pds | 本研究 |
| 4 wgx | 一个突变来自4 w | 本研究 |
| 4 wg-pder | 4 wg窝藏丝氨酸-生物传感器pds | 本研究 |
| 质粒 | ||
| pCas | 携带Cas9和λRed系统,假名 | 表达载体 |
| pTargetF | 鼻中隔黏膜下切除术后携带N20序列,程控或 | 表达载体 |
| pds | 生物传感器,假名 | 表达载体 |
表1。菌株和质粒用于这项研究。
| 引物 | 序列 |
|---|---|
| pTargetF-A¢A³glyA1-F | ACTGTGGCAGGCTATGGAGCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTT |
| GCTCCATAGCCTGCCACAGTACTAGTATTATACCTAGGACTGAGC | |
| pTargetF-A¢A³glyA2-F | AGAAGCCGAAGCGAAAGAACGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTGTTCTTTCGCTTCGGCTTCTACTAGTATTATACCTAGGACTGAGC |
| pTargetF-A¢A³glyA2-R | AGCCCTGCAATGTAAATGGTT |
| glyA-U-F | ACAGCAAATCACCGTTTCGCCCGCATCTCCTGACTCAGCTA |
| glyA-U-R | AGCTGAGTCAGGAGATGCGGGCGAAACGGTGATTTGCTGTC |
| glyA-D-F | TCGCCAGACAGGATTTAACCC |
| glyA-D-R | CCCTGATTCTGTGGATAACCGTA |
| f23 pTargetF: 1756 | ACATCAGTCGATCATAGCACGAT |
| pTargetF: 78 r23 |
表2。引物用于这项研究。
生长培养基和培养条件
Luria-Bertani(磅)中用于质粒结构。在适当的时候,链霉素(50μg /毫升)或卡那霉素(50μg /毫升)补充道。L-serine发酵,矿物AM1介质(33补充了10.0 g / L甘油,8.6 g / L (NH4) 2 HPO4, 3.9 g / L NH4H2PO4和1 g / L使用酵母提取物。
大肠杆菌根据我们之前的研究是培养(20.]。
CRISPR / Cas9基因组工程击出glyA基因
使用4 w基因组为模板,我们获得了上游glyA基因的同源臂通过PCR引物glyA-U-F glyA-U-R,和下游glyA基因的同源臂通过引物glyA-D-F glyA-D-R。然后上游和下游的手臂都被用作模板和同源重组修复模板通过重叠延伸PCR引物glyA-U-F和glyA-D-R。
质粒提取pTarget大肠杆菌JM109和引物pTargetF-ΔglyA1-F放大,pTargetF-ΔglyA1-R pTargetF-ΔglyA2-R和pTargetF-glyA2-F。模板与DpnI降解酶,然后被转移到PCR产品大肠杆菌JM109修复环合差距。f23克隆生长后,pTargetF: 1756和pTargetF: 78 r23用于PCR扩增。如果测序结果是正确的,然后放大并提取质粒。最后,两个包含N20 pTarget质粒序列专门针对glyA。在CHOPCHOP N20序列预测(chopchop.cbu.uib.no)。
最后,同源臂和两个片段pTarget质粒electroporated到主管包含pCas质粒的细胞。转化株选择卡那霉素、链霉素盘子和验证了使用对应的引物PCR glyA-U-F glyA-D-R。
serine-biosensor的建设和验证
pds质粒被建造在我们之前的研究32),然后pds质粒是介绍大肠杆菌4 w,转化株选择和验证,包含pds质粒已经实现的菌株。和验证的serine-biosensor是根据我们之前的研究32]。
过程的biosensor-driven进化实验
菌株的进化,大肠杆菌4 wg窝藏pds在LB培养基培养,10% (v / v)培养液移植到新的AM1中6 g / L L-serine和增长10代。然后,细胞被转移到新鲜AM1 12 g / L L-serine媒介。的啤酒进行了几轮L-serine逐步增加(6、12、25 - 50 g / L)。的进化压力,选择最有效的应变通过使用流式细胞仪根据我们之前的研究32]。五个不同时期的荧光分布大肠杆菌4 wg-pdser和父母的压力进行了分析。
基因组测序
大肠杆菌4 wgx GENEWIZ基因组测序,苏州,中国,Illumina公司HiSeq 10×平台,并识别序列变异相对于大肠杆菌W3110参考基因组。
分析方法
细胞生长测定OD600(效果范围uv - 1200年代,中国)。甘油浓度测量甘油三酯测定工具包是购自南京建成生物工程研究所。首先,基于不同甘油浓度的标准曲线标准,构建相应的OD550值,然后计算每个样本的实际甘油浓度根据OD550价值。细菌的荧光强度与标仪检测到的激发波长488 nm和发射波长530 nm)。L-serine的浓度测定用高效液相色谱法(高效液相色谱法;美国安捷伦1100)根据之前报道的方法(32]。
serine-biosensor的建设和验证大肠杆菌
的serine-biosensorc . glutamicum构建和使用屏幕L-serine高产菌株在我们之前的研究32]。然而,小生物传感器的研究报道,不同的表达也是有效的筛选高性能应变。所以serine-biosensor的有效性和敏感性c . glutamicum然后研究了大肠杆菌。的serine-biosensor pds变成了大肠杆菌4 w w能产生1.1 g / L L-serine从甘油是建造在我们先前的研究20.),和4 w-pdser构造。之后,4 w和4 w-pdser拍摄用激光扫描共焦显微镜在可见光和紫外光。所示图2父菌株4 w没有荧光信号。然而,4 w-pdser显示大量的荧光强度。这一结果表明,serine-biosensor已成功表达大肠杆菌。
图2:识别serine-biosensor pds大肠杆菌。4 w-pdser显然发出黄色荧光,而控制大肠杆菌4 w没有发出黄色荧光。
荧光强度和L-serine效价的关系进行了研究,结果表明,当L-serine效价提高,荧光强度增加,表明荧光信号从serine-biosensor与L-serine效价(图3)。此外,在下一个进化实验,L-serine添加到介质,然后L-serine添加到生物传感器的影响进行了研究,结果表明,荧光强度没有显著变化与不同数量的L-serine(数据未显示),表明细胞L-serine biosynthesized只是由serine-biosensor监控。这些结果表明serine-biosensor的功能c . glutamicum在大肠杆菌,然后我们使用这个方法来筛选企业丝氨酸的压力。
图3:L-serine积累和荧光强度的比较大肠杆菌4 w-pdser。方块代表荧光强度,方块代表L-serine开放。值表示三个独立实验的平均值和误差表示标准偏差。
改善L-serine积累减少丝氨酸退化大肠杆菌。
进一步提高L-serine 4 w的生产,我们淘汰glyA应变4 w用CRISPR / Cas9,从而导致应变4工作组。所示图4 b4、应变wg显示细胞生长抑制,最大OD600 2.37。相比之下,最大应变OD600 4 w为5.73 (图4一),glyA删除导致细胞生长显著减少。相应地,L-serine积累应变4 wg为0.75 g / L,水平显著低于亲代菌株4 w (1.1 g / L)。我们推测,细胞内的甘氨酸缺乏引起的敲门L-serine退化的途径导致可怜的应变的增长状态,从而导致低L-serine积累。
图4:(一)CProfiles甘油消耗,细胞生长和L-serine生产菌株4 w。(B)的甘油消耗,细胞生长和L-serine生产4个工作组。(C)的甘油消耗,细胞生长和L-serine生产菌株4 wg和0.15 g / L甘氨酸补充道。方块代表细胞生长,圆圈代表剩余甘油,三角形代表L-serine。值表示三个独立实验的平均值和误差表示标准偏差。
根据一项研究[5SHMT的失活大肠杆菌可以有效降低细胞内降解L-serine,外生甘氨酸可能被添加到维持细胞生长。然后0.15 g / L(2毫米)甘氨酸是添加到介质,压力4 wg恢复正常增长的最大OD600值4.87 (图4 c)。同时,L-serine积累也显著增加,达到2.01 g / L 54 h(发酵后,控制应变的4 w高出53.4%。同时,在发酵过程中底物甘油完全消耗48 h,亲代菌株的结果相同,4 w。
虽然L-serine应变效价4 wg增加的甘氨酸,L-serine被发现剧毒应变即使在低浓度。所示图5细胞生长的菌株4 wg L-serine明显减少了添加的媒介。6 g / L L-serine添加时,最大OD600为2.62。当L-serine除了到达12日25 - 50 g / L, 4株wg显示增长可以忽略不计。如何提高菌株的耐受性L-serine高产L-serine是关键。
图5:增长的菌株4 wg AM1 L-serine含有不同浓度。方块代表0 g / L L-serine开放广场代表6 g / L L-serine,三角形代表12 g / L L-serine开放25 g / L L-serine圆圈表示,钻石代表50 g / L L-serine。值表示三个独立实验的平均值和误差表示标准偏差。
增加L-serine收益率通过biosensor-driven进化
因此啤酒与生物传感器进行改善L-serine宽容和L-serine生产。然后应变窝藏serine-biosensor (4 wg-pdser)被构造,4 wg-pdser反复生长在培养基含有L-serine增加浓度(6、12、25 - 50 g / L),和细胞不断转移到新鲜培养基在指数增长阶段。在实验的最后,适量的细菌从三个平行板解决方案是吸收,然后稀释到10-5-10-6倍。100μL稀释细菌溶液涂在卡那霉素盘子和隔夜在37摄氏度下培养,和单一的殖民地被转移到96 -孔板。24小时的发酵后,荧光强度的应变在每个测量。所示图6,第一个是控制应变4 wgx-pdser,剩下的95株是单身殖民地选择在盘子上。相比之下的荧光强度,5株最高的被选为瓶发酵强度值。结果啤酒wgx应变被任命为4。所示图7,经过48小时的发酵,最大应变OD600 4 wgx是6.87;甘油在24小时完全消耗;L-serine效价为4.13 g / L 48 h, 4 wg的价值高出105% (2.01 g / L)和275%高于4 w (1.1 g / L);和底物转化率为41.3%。然后,应变4 wgx培养在培养基的50 g / L L-serine;细胞生长所示图7 b的最大应变OD600 4 wgx达到3.65,和父母的压力4 wg显示相同的介质(几乎没有增长图5)。澄清的原因大大提高serine-tolerance 4 wgx应变,应变4 wgx被送到Genewiz全基因组重测序。测序结果显示共有11个基地的突变菌株的基因组4 wgx与应变4 w,包括10名非同义突变(巴马、brnQ ybcJ, fepB, agp, dgcT, oppB,弗力克,ygbN和eno)和1同义突变(fdrA)。我们选择了两个基因(agp glucose-1-phosphatase编码,和烯醇酶编码的eno)没有参与膜的研究首先,agp的回复突变,eno的基因组进行了4个工作组,从而导致突变株。然而,我们没有观察到任何关于L-serine生产重大改变,细胞生长和甘油消耗在这两个菌株(数据没有显示)。进一步的研究将专注于理解的改善原因L-serine公差由这些基因突变引起的。
图6:比较适应株的荧光强度。气缸代表荧光强度。值表示三个独立实验的平均值和误差表示标准偏差。
图7:(一)甘油消费资料,细胞生长和4 wgx L-serine生产压力。方块代表细胞生长,圆圈代表剩余甘油,三角形代表L-serine。值表示三个独立实验的平均值和误差表示标准偏差。(B)增长的进化压力4 wgx AM1 L-serine含有不同浓度。方块代表0 g / L L-serine开放广场代表6 g / L L-serine,三角形代表12 g / L L-serine,三角形代表25 g / L L-serine开放,开放50 g / L L-serine圆圈表示。值表示三个独立实验的平均值和误差表示标准偏差。
在这项研究中,我们成功地建立了一个biosensor-driven实验室使用serine-biosensor从进化方法c . glutamicum为提高L-serine宽容和L-serine生产大肠杆菌。在几轮迭代,大肠杆菌4 wgx分离从一个大进化压力库,和应变产生4.13 g / L L-serine, 0.41 g / g甘油的产量。
在微生物L-serine积累退化是一个至关重要的问题。L-Serine有两个主要降解途径甘氨酸或丙酮酸。转换L-serine丙酮酸大肠杆菌是由三个L-serine催化脱氨酶、sdaA sdaB tdcG。丝氨酸的转换通过丝氨酸羟甲基甘氨酸转移酶(SHMT)由glyA催化。应变4 w删除sdaA, sdaB tdcG大肠杆菌W3110。在这项研究中,删除L-serine降解途径大肠杆菌4 w基因glyA淘汰只有通过使用CRISPR / Cas9,从而导致应变4工作组,生产2.01 g / L L-serine添加甘氨酸。减少SHMT活动强烈影响L-serine积累在其他研究[5- - - - - -7]。然而,在目前的实验中,glyA删除产生的细胞生长抑制,甘油消费率较低。这些结果并不完全符合Mundhada的研究,在T1应变(大肠杆菌MG1655 tdcG, sdaA和sdaB删除)有较高的葡萄糖消耗速率和较低的细胞生长与第一季度相比(菌株T1 glyA删除)5与glyA删除),即,细胞生长没有显著变化,我们推断,这可能是由于不同的碳源。和应变4 wg OD600较低是不适合批量发酵。为了克服这个限制,啤酒被用来增加应变的丝氨酸宽容。
生物传感器已被广泛用于构建高通量筛选方法和优化路径表达式(34- - - - - -38]。在我们之前的研究中,serine-biosensor pds被建造c . glutamicum,这是基于NCgl0581(转录因子L-serine特别敏感c . glutamicum),大规模筛选高产L-serine菌株。然而,我们不知道这是否生物传感器是适合筛选L-serine超量产生大肠杆菌与否,因为外源表达的转录监管机构可能显著干扰宿主基因调控网络。此外,生物传感器的灵敏度取决于职业的速度启动子的转录因子通过蛋白质相互作用39]。因此,有效性和敏感性serine-biosensor pds当时在这项研究中首先验证,结果表明,生物传感器c . glutamicum是有效的在选择L-serine超量产生大肠杆菌在此基础上;的高通量筛选方法。此外,在进化实验中,L-serine添加到介质,然后L-serine添加到生物传感器的影响进行了研究,结果表明,荧光强度没有显著变化与不同数量的L-serine添加(数据未显示),表明细胞L-serine biosynthesized只是由serine-biosensor监控。
在最近的一项研究中,50 g / L L-serine生产葡萄糖大肠杆菌,产量0.26 - -0.30 g / g葡萄糖,和50 g / L L-serine生产迄今报告的最高水平。与微生物L-serine生产葡萄糖相比,更具体的甘油的优点是减少其更好的碳原子经济和更高的学位,非常希望利用甘油为基质生产氨基酸(20.,40]。此外,粗甘油的重组菌株的性能应该进一步检查。努力还需要关注工程菌株为工业实现,尤其是对提高耐粗甘油的有毒物质。
本研究表明,serine-biosensorc . glutamicum在选择有用的丝氨酸超量产生大肠杆菌,biosensor-mediated啤酒是一个有价值的工具,提高微生物细胞生长和生产力的生产菌株。尽管使用甘油作为微生物发酵的底物生产成本仍高于非化工生产,由于较低的生产目前,甘油也是一个替代基质提供各种经济和代谢优势,进一步工程和优化,直接使用甘油作为碳源发酵可能成为竞争。
这项工作是在经济上支持中国国家重点研发项目(2018 yfa0901401)。国家一级学科项目计划轻工技术与工程(LITE2018-11)。
作者没有财务利益冲突声明。