青春期接触双酚A会破坏雄性和雌性小鼠下丘脑中雌激素受体α的表达

摘要

双酚A是一种异种雌激素，与雌激素受体α (ERα)和雌激素受体β (ERβ)相互作用。据报道，在环境中低剂量的双酚A会影响啮齿动物的行为，影响大脑和生殖组织的发育。在本研究中，小鼠从出生后(PND) 32日开始，每天口服低剂量(50µg/kg)双酚a，直到死亡(PND50或PND100)，在尸检时，所有动物的大脑、睾丸和子宫都被采集用于分析。免疫组化评价下丘脑弓状核和腹内侧核表达ERα的细胞数量的变化。对睾丸和子宫进行组织学评估，同时对小鼠血清进行雌二醇和睾酮分析。双酚A暴露在PND50时，雄性和雌性小鼠下丘脑弓状核和腹内侧核中表达ERï的神经元均增加(p<0.05)，而在PND100时，双酚A暴露仅增加雌性小鼠下丘脑腹内侧核中表达ERï的神经元(p<0.05)。在暴露的雄性睾丸中没有观察到不良反应，除了基底膜一致增厚。在女性中，观察到轻度单纯性子宫内膜腺体增生，BPA50组和BPA100组之间没有差异。雄性小鼠在PND50处睾酮下降，雌二醇血清浓度升高，而雌性小鼠在PND100处血清雌二醇升高。我们的研究结果表明，双酚A可以调节下丘脑中的雌激素受体，并表明在青春期暴露于双酚A对雄性和雌性小鼠的影响相当，但在成年期的影响不同。

关键字

双酚A，内分泌干扰物，下丘脑。

简介

雌激素在发育和性别分化中至关重要中枢神经系统控制神经内分泌、行为及认知功能的结构[1］．在青春期，神经回路的组织达到完全成熟，其间性腺激素的增加负责男性生殖系统和性行为的男性化和女性化[2，3.］．性别的影响甾类激素雌激素主要由雌激素受体α (ERα)和雌激素受体β (ERβ)介导[4］．ERα和ERβ类固醇受体是配体激活的核超家族的成员，特异性结合雌激素和雌激素样化学物质，并能够调节基因转录。在缺乏雌激素的情况下，ER以一种失活和未转化的状态存在，作为一种与热休克蛋白结合的单体[5］．虽然下丘脑是雌激素的经典靶区[6]，人们发现大脑细胞如神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞也表达了许多已知的er [7］．

在啮齿动物中，ERα在调节生殖功能和行为的区域高度表达，包括前腹侧脑室周围核、内侧视前核、弓状核和下丘脑腹内侧[8-10］．尽管男性和女性出生时大脑区域的神经元数量相同，但已经证明雌二醇介导的选择性细胞死亡通过ERα [11]在新生儿生活中迅速引起形态学上的性别差异[12］．双酚A (BPA)是一种用于制造聚碳酸酯、环氧树脂和聚苯乙烯树脂的单体，这些树脂被用作食品容器的生产材料。近年来，由于聚碳酸酯塑料和环氧树脂的使用增加，人类接触双酚a的频率有所增加[13］．许多研究亦显示聚碳酸酯容器有BPA的泄漏痕迹[14，15]及食物容器内环氧衬里[16，17］．双酚A是一种内分泌干扰物，具有雌激素样的作用，可以模仿天然雌激素在人体中的作用，这可能导致生殖和发展毒性［18］．虽然与雌激素相比，BPA与内质网的结合亲和力降低，但它主要通过这一途径介导内质网的作用[19］．

在啮齿类动物中，早期接触双酚a已被证明会影响雄性的生殖行为[20.]和女性生育能力[21];效果与下丘脑扰动一致。因此，本研究旨在研究青春期暴露于BPA是否会在短期(PND50)和长期(PND100)内改变ERα的表达。我们对雄性和雌性小鼠中表达核ERα的细胞比例进行了定量立体学研究，并比较了对照组和BPA暴露小鼠之间的差异。后一种比较使我们能够确定在青春期和整个成年期，大脑中ERα的表达是否因BPA的存在而改变。我们的分析集中在弓状核(ARC)和腹内侧核(VMH)上，这两个核与两性的生殖行为有关[22]，以及雌激素调节ER的表达[23］．

材料与方法

动物与实验设计

36只断奶后雌雄BALB/c小鼠来自马来西亚吉隆坡医学研究所(IMR)。在它们适应当地动物之家5天后，它们被随机地安置成6只一组，按性别分开，自由地给予食物和水。在本实验中，青春期初期的小鼠每天暴露在50 μg/kg体重(BW)的BPA中，对照组小鼠则接受0.01%乙醇作为对照。这些物质(BPA或乙醇)通过微量吸管口服，直到献祭前一天。选择这种接触途径是因为它与人类接触更相关。之所以选择这一剂量的BPA，是因为它远低于已公布的“无观察到的不良有效水平”(NOAEL)剂量，即5毫克/公斤体重/天[24]，而现时BPA的每日容许摄入量(TDI)是多少[25，26］．此外，大量研究报告了BPA暴露剂量远低于5毫克/公斤体重/天，有时仅为几μg/公斤体重/天的影响[27］．动物在出生后50日或出生后100日被处死;此外，雌性在发情周期的发情阶段被牺牲。因此，暴露小鼠分别鉴定为BPA50 (PND50)或BPA100 (PND100)和Control50 (PND50)或Control100 (PND100)。所有的动物实验都经过了国际医科大学研究和伦理委员会的审查和批准。这些程序符合美国国立卫生研究院(NIH)关于人道对待实验动物的指导方针。

组织收集和准备

在每个处理后的大脑中，用显微刀在冠状面5 μm的正面切片上切开两个部分，安装在硅烷涂层载玻片上，在低温下干燥24小时室温．采用标准免疫组化技术(亲和素-生物素过氧化物酶)观察免疫染色的分布。简单地说，样本经过预处理以获取抗原，然后阻断内源性过氧化物酶活性和非特异性结合位点。然后将样品与一抗(抗雌激素受体α抗体来自Abcam)以1:100的稀释率在室温下孵育1小时，随后与生物素化的二抗孵育30分钟。该反应采用3,3 '二氨基氨基四盐酸盐(DAB)作为显色底物，得到棕色反应产物。样品脱水后用永久安装介质安装。

组织学分析

取子宫和睾丸横切面，5 μm切片，载玻片，室温干燥。切片用苏木精和伊红(H&E)染色，并用DPX(一种用于治疗的非水安装介质)安装显微镜含二甲苯和邻苯二甲酸二丁酯混合异构体的。

图像分析的量化

在每个实验组(n=6)中，研究人员对大脑进行分析，并在每个领域中计数带有清晰棕色染色的ERα免疫反应细胞，该研究人员不了解性别和治疗条件。对每一节的阳性细胞数量进行评分和平均，每只动物得到一个数字。手动计数细胞使用尼康显微镜和相机，使用×20物镜。评分是根据表达棕色的细胞百分比进行评估的，使用的方法已在以前的研究中描述[28，29]，其中的分数是根据在一个高倍场中占据污渍的细胞数量来计算的。根据高分辨率小鼠脑地图集，选择的大脑部分包括下丘脑区域(ARC和VMH) [30.］．组织病理学评估进行了睾丸和子宫在所有治疗组中。

激素测定

在牺牲时采集的全血使其凝固，然后在4℃下以3000rpm离心15分钟。将血清移液并储存在-80℃的干净试管中，直到使用。血清睾酮和雌二醇浓度由竞争性ELISA检测，使用开曼化学公司生产的市售试剂盒。在进行睾酮分析的ELISA程序之前，按照生产商提供的说明，用乙醚提取小鼠血清。

数据分析

对于组织学分析，我们使用单边Fisher精确检验比较了每个剂量组与对照组的发生率。对免疫组化和激素结果进行单因素方差分析以获得总体显著性，并使用Bonferonni事后检验来确定治疗组之间的差异。在所有病例中，p<0.05被认为是显著的。所有数据均以均数±S.E.M.表示

结果

免疫组织化学

在实验动物ARC中，BPA50雄性小鼠ERα表达显著增加近2倍(p<0.05) (图1)，而BPA50组雄性动物VMH中ERα的表达增加了3倍(p<0.001)。在对照组雄性小鼠的ERα表达在50天和100天时均无差异，而BPA暴露小鼠的ERα表达在100天时均无差异。BPA50雌性小鼠在ARC中ERα表达略有增加，而在VMH中ERα表达显著增加(p<0.001)。在BPA100组的女性中也观察到了同样的趋势。在ARC (p<0.001)和VMH (p<0.005)两个区域，年轻对照组雌性小鼠中表达ERα的细胞数量分别显著低于对照组老年雌性小鼠(图1)．ERα在雄性和雌性动物的VMH和ARC中所选显微照片的表达在(图2)．

组织病理学

在研究的雄性动物的生殖道中没有观察到宏观缺陷。与对照组相比，治疗组中的大多数雄性小鼠确实显示出一些形态学变化或睾丸组织学差异的证据(图3)．对照组小鼠生精周期正常。在处理组，输精管显示正常的结构，有足够的细胞，各种形式的细胞都存在。也有健康数量的支持细胞和间质细胞存在。但治疗组大部分动物小管基底膜轻度增厚，生殖细胞的分布相应较低。这种增厚是通过形态学方法确定的，与正常组织进行比较，根据以往研究中描述的既定方法，可以定性地分为轻度、中度和重度[31］．与其他分析一样，在两个BPA处理组之间没有观察到差异。组织学分析显示一薄的肌肉肌壁包围子宫内膜在子宫里。子宫内膜显示大量腺体排列在细胞致密间质中，对照组小鼠的腺体无异型性。然而，两个月后，两个BPA处理组的动物的腺体都显示出伸长和增大，由基底核突出的拥挤细胞和适量的细胞质(图3)．

在子宫异常方面，我们观察到BPA50组和BPA100组子宫内膜腺体单纯增生，BPA50组和BPA100组无差异，对照组无增生发生(表1)．在两个BPA组之间没有剂量相关的变化，根据Fisher精确检验，对照组和BPA组之间的差异具有统计学意义(p = 0.033)。

激素测定

与对照组50相比，BPA50组男性睾酮血清水平显著降低。在100天队列的男性中，对照组和BPA暴露组之间没有观察到显著差异。在女性中，所有治疗组之间无显著差异。方差分析揭示了性别的重要性，因为男性的水平高于女性。BPA50雄性小鼠血清雌二醇水平显著升高。虽然在BPA100雄性小鼠中没有观察到明显的雌激素变化，但有明显的上升趋势。在雌性小鼠中，显著增加血清观察BPA100组成年小鼠雌二醇水平。BPA处理后男性和女性的睾酮和雌二醇浓度显示在(图4)．

讨论

ERα表达

在实验动物身上进行的研究相对较少，以评估它们在青春期等敏感时期对中枢神经系统的影响。我们观察到ERα在ARC和VMH不同区域的表达变化。BPA暴露组中表达ERα的下丘脑细胞数量发生了改变，这些细胞数量在短期和长期内具有性别依赖性，且不相同。在本研究中，对照组50名男性在VMH中显示出高于对照组女性的ERα水平，而在ARC中没有观察到差异。在对照组100的男性和女性的VMH中没有这种差异，而作为激素启动的反应，ARC的水平在女性中高出一倍，在男性中低一倍。有趣的是，我们的研究结果显示，与对照组相比，青春期BPA暴露对ARC和VMH有整体影响，在短期内显示出更高的ERα水平，与性别无关。因此，ERα在大脑区域的表达有活跃的变化，这取决于生长的时期和受试者的性别[32］．

产后早期BPA暴露已被证明可诱导ERα总mRNA水平上调，这是通过下丘脑ERα转录物变体和蛋白质[33］．此外，在新生儿早期，研究表明女性ERα水平升高[34]以及成年VMNvl中er α免疫反应细胞数量的增加[35] BPA暴露后。在新生儿BPA暴露后，幼鼠ERα和ERβ的表达也有所增加[36］．

这些发现表明，在青春期短期接触雌激素物质可以调节下丘脑中的雌激素受体。在PND100上牺牲的动物中，在ARC和VMH区域，雌性的ERα水平高于雄性。BPA暴露没有改变男性ARC和VMH中的ERα水平，但显著增加了女性VMH中的ERα水平。成年期男性和女性的VMH存在根本差异，导致雌二醇诱导的VMH变化女性比男性更强烈[37］．目前的结果表明，在青春期早期，BPA暴露对雄性和雌性小鼠的影响相似，但在成年期的影响有所不同。本研究的目的是评估青春期暴露于BPA是否会在短期和/或长期影响ERα。从短期来看，BPA暴露的一个主要影响是ARC和VMH中ERα表达的增加，与性别无关。从长期来看，BPA只对女性的VMH有影响。因此，在青春期和整个成年期给予BPA似乎永久性地改变了雌性小鼠VMH中ERα的水平大脑．

激素变化

在本研究中，我们旨在评估下丘脑ERα表达水平是否与生殖系统影响和血清中激素平衡破坏有关。BPA的影响是中等的，因此我们观察到BPA50男性的睾酮水平显著降低，而雌二醇水平显著升高。在雄性小鼠中观察到的睾丸激素浓度的急剧下降(BPA50)表明睾丸可能是BPA暴露的主要靶器官。在其他研究中，给雄性大鼠注射双酚a的结果是减少睾酮水平(38，39]以及雄性激素和Leydig细胞活性的下降[39-41］．这与我们对血清睾酮水平低而雌二醇水平升高的男性的观察相一致。虽然雌激素对男性的正常生育能力至关重要，但这些激素的过量产生可能会产生不良后果，影响男性生殖系统的发育和功能。我们假设BPA刺激性腺激素的生成导致雌激素的增加，与其他研究表明内分泌干扰化学物质可以通过直接抑制睾酮生物合成途径中的酶或间接改变垂体功能来干扰雄激素的合成和分泌相似[42，43］．

在BPA100的女性中，血清雌二醇水平升高，提示雌二醇合成增加的外周效应。各种研究表明，暴露于BPA会增加雌二醇和芳香化酶活性，同时芳香化酶mRNA水平也会增加。43，44］．其他研究报告BPA暴露通过下丘脑-垂体早熟改变HPG轴，导致新生儿和成人GnRH脉动性改变，并严重影响垂体中的GnRH信号传递[45］．目前还不清楚为什么BPA暴露对BPA100组成年雄性小鼠的雌二醇和睾酮水平没有影响。这些发现反映了内分泌系统的复杂性、众多的循环以及研究不同终点水平的必要性[43］．已经假定ERα对生殖组织至关重要神经内分泌然而，ERα在下丘脑中所起的作用尚未完全阐明[46］．然而，对于男性和女性来说，很难断言在下丘脑ERα表达水平中观察到的差异是导致激素血清水平变化的原因。

组织病理学

在BPA50和BPA100动物的睾丸和子宫中都发现了治疗的病理效应。镜下观察，50 μg/kg BW的剂量对睾丸形态无不良影响;然而，观察到生殖细胞减少。先前也有报道称，500 μg BPA和17-β-雌二醇处理大鼠睾丸后，生殖细胞减少[47］．实验证据表明，BPA对男性生殖系统，尤其是睾丸[48]有不良影响，会中断正常的睾丸功能，抑制精子发生和睾丸睾酮分泌[27］．也有报道称BPA可能刺激一些类似雌二醇的细胞反应，并影响多种内分泌相关通路。

在雌性动物中，BPA的长期影响，包括卵巢囊腺瘤、鳞状化生、子宫腺肌症、平滑肌瘤、不典型增生、子宫间质息肉和癌变，可能是由于间质中ERα间接介导的增殖增加[49，50］．在目前的研究中，我们观察到BPA暴露的女性子宫内膜腺体轻度增生。此外，BPA已被证明可引起腔内ERα表达的增加，这是子宫超雌激素反应的典型特征[51］．虽然我们没有研究ERα在子宫中的表达，但在成年雌性小鼠中观察到ERα在VMH中的表达增加和血清雌二醇水平升高。因此，我们认为单纯增生的发生可能是后两者相互作用导致内分泌信号通路失调的结果。然而，我们没有发现任何恶性肿瘤的病例，因为我们实验环境中的动物暴露在极低剂量下。这些动物也是在三个月大的时候被宰杀的，可能没有足够的时间来完全发育生殖道肿瘤。我们目前的啮齿动物研究已经证明，在生殖发育和成熟的青春期暴露于即使低剂量的BPA也会导致雄性和雌性小鼠微妙的生殖结果。

结论

这些结果支持了一种假说，即在青春期暴露于BPA会影响神经元环境，导致生殖功能的改变。性别分化和成人生殖功能的过程是在基因控制和激素介导的反馈机制下进行的。最重要的是，这些过程对内源性和外源性因素的调节敏感，包括一系列环境内分泌干扰物。因此，这些发现应引起公众健康方面的关注，证实在性成熟阶段暴露于低剂量的弱环境雌激素可影响成人的生殖性能。这些发现强调有必要进行进一步研究，以揭示暴露于破坏环境的化学品对不同发展阶段受影响个人健康的影响机制。此外，在动物暴露于低剂量BPA环境中所观察到的一些长期影响，被美国环境保护署认为是可以接受的[52，53]及欧洲委员会食品科学委员会[54，55］．进一步的研究是必要的，以阐明BPA的确切作用，有助于这些异常在青春期期间。

确认

这项研究得到了马来西亚国际医科大学(IMU)的资助(IMU 236-2011)。内容完全是作者的责任。

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