黑豆对四氯化碳所致大鼠肝损伤具有保护作用

摘要

黑豆种皮(Glycine max (L.))含有丰富的花青素。Merrill)，有助于抗氧化和抗炎症活动。这使我们研究了BS对强氧化剂四氯化碳(CCl4)诱导的大鼠肝损伤的保护功能。将BS在130°C下烘烤5分钟，然后在100°C热水中浸泡20分钟，生成花青素富茶/汤(BST)。采用6个实验组:对照组、高BST (1 g BS/kg bw)、CCl4 (0.5 ml 20% CCl4)、CCl4 +水蓟素(0.2 g/kg bw)、CCl4 +低BST (0.1 g BS/kg bw)和CCl4 +高BST (1 g BS/kg bw)，研究BST对CCl4诱导的sd大鼠肝损伤的保护作用。BST可提高正常大鼠肝组织中GSH、GSSH含量及抗氧化酶活性(超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、谷胱甘肽还原酶(GR)活性)。BST还可减弱CCl4处理大鼠血清谷氨酸草酰乙酸转氨酶(GOT)和谷氨酸丙酮酸转氨酶(GPT)水平的升高。肝脏组织病理学显示BST可减少CCl4引起的脂肪肝和肝纤维化。由此推测，黑豆种皮中的花青素是造成这种肝保护作用的原因之一。

关键字

黑豆，茶叶，抗氧化，保肝，四氯化碳。

介绍

黑豆(大豆(l)梅)是东方国家常用的药用食品和草药。它具有抗炎活性，抗增殖作用，抗氧化能力，以及降低癌症风险的能力[1-4］．黑豆的生物学功能主要与其花青素类化合物有关，这些化合物在黑豆种皮中含量丰富[5-8］．黑米糠花青素提取物对四氯化碳诱导的小鼠肝损伤有保护作用，黑米提取物对酒精诱导的大鼠慢性肝损伤有抑制作用[9，10］．此外，研究发现，在许多天然植物中常见的花青素-3- o -葡萄糖苷(C3G)在四氯化碳处理的小鼠中显示出保护肝脏的功能[11］．由于黑大豆种皮中花青素含量较高，且种皮中主要花青素为C3G，因此我们认为黑大豆也可能具有这种护肝功能。因此，本研究以SD大鼠为动物模型，评价了黑豆对四氯化碳诱导的肝损伤的保护作用[5］．

四氯化碳(CCl₄)是产生化学肝损伤的强氧化剂[12，13］．创新领导力₄转化为三氯甲基自由基，这些活性自由基能够攻击细胞大分子，如脂质、蛋白质和DNA [14，15］．据报道，CCl₄可降低大鼠肝脏中抗氧化酶的活性，包括超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶和谷胱甘肽还原酶的活性[16，17］．氯化铬中毒₄引起细胞坏死、氧化应激和炎症，从而导致肝脏损伤，如纤维化、肝硬化和萎缩[18］．

研究发现预热处理可以提高黑豆提取物的抗氧化活性。在130°C烘烤5 min的黑豆水浸提液中，总花青素含量和抗氧化活性均高于未加热的黑豆水浸提液[19］．认为这种预热工艺可以提高黑豆花青素的提取率。在本研究中，将预焙(130°C 5分钟)的整个黑豆浸泡在100°C的热水中20分钟，以产生煎剂。采用四氯化碳处理SD大鼠，评价黑豆汤的保肝作用。

材料与方法

化学物质

四氯化碳(CCl₄)和水飞蓟素是从西格玛公司(圣路易斯，密苏里州)购买的。谷胱甘肽二硫化物(GSSG)、谷胱甘肽还原酶(GR)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)、谷胱甘肽(GSH)和n -乙基马来酰亚胺购自Wako纯化学工业(日本大阪)。过氧化氢和过氧化氢异丙烯购自Alfa Aesar (Heysham, UK)。总蛋白双缩脲试剂购自thermo (Rockford, IL, USA)。

黑豆茶(BST)的制备

黑豆(大豆(l)美林，台南3号)是从中华民国台湾嘉义县的一位当地农民手中购买的。洗净后，将整个黑豆放入20*15*1.5 cm的铝锅中，放入烤箱(型号SO-1199，台北市Sunpentown) 130℃预热5分钟。使用数字袖珍温度计(型号DGS-A9SA-ST9215C，台北市道格株式会社)监测黑豆周围的环境温度。将预热好的黑豆浸泡在100°C热蒸馏水中10倍(w/v)浸泡20 min，取出豆子后，作为动物处理样品。

实验动物

6月龄雄性SD大鼠购自Biolasco台湾有限公司(I-Lan, Taiwan)。大鼠被关在环境控制的房间(22±2°C, 65±5%相对湿度)的不锈钢丝底笼中，夜间和黑暗周期为12小时。在实验过程中，大鼠喂食常规食物(台湾台中市的Fu-So颗粒饲料)和自由饮水。每周记录体重。本研究方案经台中普罗维登斯大学动物研究伦理委员会批准。

48只大鼠随机分为6组，每组8只。它们是:对照组(正常饮食)，高BST (1 g BS/ kg bw)， CCl₄(0.5 ml 20%覆铜板₄/橄榄油)，CCl₄+水飞蓟素(0.5 ml 20% CCl₄/橄榄油+ 0.2克水飞蓟素/公斤体重)，氯化铬₄+低BST (0.5 ml 20% CCl₄/橄榄油+ 0.1 g BS/kg bw的BST)和氯化铬₄+高BST (0.5 ml 20% CCl₄/橄榄油+ BST, 1g BS/kg bw)。对于CCl的组₄是必需的(CCl₄+水飞蓟素₄+低BST和CCl₄+高BST)，腹腔注射0.5 mL CCl₄CCl (20%₄/橄榄油)每周两次，持续9周。控制和CCl₄对照组每天接受蒸馏水，连续9周;而高BST, CCl₄+水飞蓟素₄+低BST和CCl₄+高BST组每天分别摄入BST (1 g BS/kg bw)、水飞蓟素(0.2 g/kg bw)、BST (0.1 g BS/kg bw)和BST (1 g BS/kg bw)。

第1周、第3周、第6周、第9周于血管中采集血样，4℃离心10 min，离心后收集上清用于血液生化分析。9周后，大鼠禁食24 h，颈椎脱位处死。肝脏立即被收集起来，清洗并称重。测定抗氧化酶活性，取1 g肝组织与1 ml 0.05 M磷酸盐缓冲液(pH 7.4)均质，4℃，13000 rpm, 10 min。解剖后的肝脏立即固定于6%甲醛中，进行标本制备和组织化学染色分析。

超氧化物歧化酶(SOD)活性测定

超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定采用Marklund和Marklund报道的方法，并对[20.］．将100微升肝脏上清与1 mL 0.05 M Tris-HCl和7 μl l50 mM苯三酚混合，在25℃下孵育10 min，然后用分光光度计(型号U-2800，日立)在325 nm处测定活性。一个单位被确定为抑制邻苯三酚氧化50%的酶的量。

过氧化氢酶(CAT)活性测定

CAT测定采用Aebi [21］．所有组的肝脏匀浆均加入1.9 ml磷酸盐缓冲液(pH 7.4)，并通过添加1 ml H开始反应₂O₂(30毫米)。用2.9 ml磷酸盐缓冲液和1 ml H制备无肝匀浆的空白₂O₂．由于H的分解而导致光密度的降低₂O₂1分钟后对照空白在240 nm处进行测量。

谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)活性测定

用Paglia和Valentine方法的改进方法测定谷胱甘肽过氧化物酶活性[22］．用分光光度计(型号U-2800，日立)记录NADPH的氧化为340 nm处吸光度的下降。检测液中含有620 μl 0.25 M磷酸盐缓冲液(pH7.4)、200 μl 5 unit/ml GR、50 μl 40 mM GSH、100 μl肝脏上清液、10 μl 20 mM NADPH和20 μl 15 mM异丙二氢过氧化氢。

谷胱甘肽还原酶(GR)活性测定

GR活性的测定采用Paglia和Valentine方法的改进[22］．将30 μl肝匀浆、750 μl GSSG和150 μl NADPH混合，用分光光度计(型号U-2800，日立)在340 nm处测定活性。

谷胱甘肽和谷胱甘肽含量的测定

GSH含量的测定采用Hissin和Hilf方法的改进[23］．在10000 g上清液的0.5 ml中，加入4.5 ml pH 8.0的磷酸盐- edta缓冲液。最终测定液(2.0 ml)中加入稀释后的组织上清液100 μl、磷酸盐- edta缓冲液1.8 ml、OPT溶液100 μl，其中OPT溶液100 μg，充分混合，室温孵育15 min后转移到石英比皿中。荧光波长为420 nm，激活波长为350 nm。

GSSH含量的测定也采用Hissin和Hilf [23］．取原10,000 g上清液的0.5 ml部分，在室温下用200 μl 0.04 M NEM孵育30分钟，与组织中存在的谷胱甘肽相互作用。向该混合物中加入4.3 ml 0.1 N NaOH。取该混合物的一部分(100 μl)用于GSSG测定，使用上述GSH测定程序，但使用0.1 N NaOH作为稀释剂而不是磷酸盐- edta缓冲液。

丙二醛(MDA)含量测定

MDA测定参照Tatum等方法[24］．向肝脏匀浆中加入0.4% TBA和75 μl 0.2% BHT，旋涡剧烈搅拌，置于沸水浴中浸泡45 min。冷却后，在10000 g上清液中加入1000 μl正丁醇。充分混合并在室温下孵育10分钟后，以10,000 g离心10分钟。将上清液转移到石英比色皿中。在515 nm处进行活化，在550 nm处进行荧光测定。

组织蛋白浓度的测定

以牛血清白蛋白为标准，参照Lowry等方法估算组织蛋白浓度[25］．

组织病理学分析

肝脏标本石蜡包埋进行组织学分析。行苏木精-伊红(HE)染色。

统计分析

使用包(SAS Institute Inc.， Cary, NC)进行单向方差分析(单向方差分析)。采用Duncan多区间检验来确定不同处理间的显著性差异。

结果与讨论

CCl的影响₄和BST对SD大鼠体重和肝脏重量的影响

图1一个示9周实验期间SD大鼠体重的变化。人们发现，CCl₄治疗3周及后实验组体重显著低于对照组。在本研究中，CCl₄作为强氧化剂诱导SD大鼠肝损伤。因此，体重的下降被认为是CCl引起的损伤₄．Hsu等人使用8%的CCl₄(1毫升覆铜线₄/kg bw)诱导雄性Wistar大鼠肝脏损伤，他们发现两种CCl在体重上没有显著差异₄治疗大鼠和正常大鼠[18］．然而，Li et al.和Lin et al.认为CCl₄显著降低雄性Wistar大鼠的体重[26，27］．在我们的案例中，我们发现了CCl₄处理后的SD大鼠出现腹泻问题，可能导致体重下降。单独施用1g BS/kg bw的BST或以0.1 g BS/kg bw的BST或与CCl联合施用1g BS/kg bw的BST₄结果与对照组体重相似，说明联合BST治疗可以减轻CCl造成的损伤₄．

9周实验结束后处死SD大鼠，采集肝组织进行实验。加药后SD大鼠肝脏重量明显增加₄治疗。结果表明，肝重明显降低₄大约是对照组的两倍图1 b)。我们的数据表明，BST以0.1 g BS/kg bw或1 g BS/kg bw与氯化铬联合处理₄肝重降低，与对照组无显著性差异。

CCl的影响₄BST对SD大鼠GOT和GPT水平的影响

肝损害的直接证据与CCl中血清GOT和GPT水平的升高有关₄处理的SD大鼠。与对照组比较，CCl组的GOT水平₄组在第1周、第3周、第6周和第9周分别增加26%、66%、223%和402% (表1)。GPT水平在CCl₄组在第1周、第3周、第6周和第9周也分别增加了26%、74%、275%和805%。数据表明，CCl₄在第6周和第9周诱导SD大鼠严重肝损伤。0.1 g BS/kg bw和1 g BS/kg bw的联合处理完全恢复了GOT和GPT水平;联合治疗组与对照组比较差异无统计学意义(p>0.05)。BST的恢复效果与著名的肝脏保护剂水飞蓟素相似，在CCl中为0.2 g/kg bw₄处理的SD大鼠。

表1:BST对CCl血清GOT和GPT活性的影响₄在第1、3、6和9周时。

CCl的影响₄BST对SD大鼠血脂的影响

CCl的作用₄和BST对SD大鼠血清甘油三酯和胆固醇水平的影响见表2．与对照组相比，CCl₄导致第9周甘油三酯水平下降32%有可能是CCl₄减少肝脏内质网极低密度脂蛋白(VLDL)的形成，从而阻止甘油三酯向血液转移，导致血液系统血清甘油三酯水平降低[28］．0.1 g BS/kg bw或1 g BS/kg bw的BST联合处理可恢复CCl中的甘油三酯水平₄处理的SD大鼠。Hsu等人还发现，CCl₄使雄性Wistar大鼠甘油三酯水平降低28% [16］．然而，我们的数据显示，CCl₄对SD大鼠胆固醇水平无显著影响。BST对正常或CCl的胆固醇水平也无显著影响₄处理的SD大鼠。

表2:BST对CCl血清胆固醇和甘油三酯活性的影响₄在第1、3、6和9周时。

CCl的影响₄BST对SD大鼠抗氧化能力的影响

SD大鼠肝组织SOD、GPx和GR活性均高于对照组，但过氧化氢酶活性无显著差异(图2 a-2d)。然而,同₄处理后肝脏组织SOD、GPx、GR和过氧化氢酶活性下降。0.1 g BS/kg bw或1 g BS/kg bw的BST联合处理提高了CCl肝组织中所有抗氧化酶的活性₄处理的SD大鼠。结果表明，BST能提高正常和CCl的抗氧化酶活性₄处理后的SD大鼠肝组织。

SD大鼠肝组织中GSH和GSSH含量见图3一和3 b分别。与对照组相比，单独给予1 g BS/kg bw的BST显著提高了肝组织中GSH和GSSH的含量。GSH和GSSH的增长率分别为77%和72%。CCl使用₄结果表明，CCl中GSH和GSSH含量均较高₄只有对照组的31%左右。与CCl相比₄结果表明，无论是0.1 g BS/kg bw还是1 g BS/kg bw，联合BST均能显著提高肝脏GSH和GSSH水平。这些数据表明，BST单独给药可以提高肝脏中GSH和GSSH的含量，BST也可以提高CCl肝脏组织中GSH和GSSH的含量₄处理的SD大鼠。众所周知，GSH和GSSH都在氧化应激防御系统中发挥重要作用;结果表明，BST可增强SD大鼠肝组织的抗氧化能力。

自由基来源于氯化铬₄可能导致膜脂过氧化，进而破坏膜的完整性[19］．在细胞或动物模型中，丙二醛含量的测定常被用作脂质过氧化的指标。氯化铬中丙二醛的含量₄组为对照组的两倍(图3 c)。同时，以0.1 g BS/kg bw或1 g BS/kg bw联合处理BST显著降低了CCl肝组织中的丙二醛水平₄处理的SD大鼠。

CCl的影响₄BST对SD大鼠肝脏组织病理学的影响

肝脏组织病理学显示，对照组和BST处理大鼠的肝脏切片结构正常，但出现了CCl₄诱导SD大鼠严重脂肪肝和肝纤维化(图4)。以0.1 g BS/kg bw或1 g BS/kg bw联合处理BST可阻止CCl诱导的组织病理学变化的发展₄．对照组和BST单独组肝脏脂肪渐增的百分比为0%₄水飞蓟素或BST以0.1 g BS/kg bw或1 g BS/kg bw联合处理时，差异均小于10%。数据表明，CCl₄水飞蓟素组和BST组脂肪肝轻，水飞蓟素组脂肪肝轻。Metavir评分显示CCl肝纤维化程度₄处理后的SD大鼠僵硬，而其他组没有表现出任何纤维化迹象。

我们的结果表明，联合BST可降低脂质过氧化，提高抗氧化酶活性，恢复血清GOT和GPT水平，减轻肝脏重量，增加体重₄处理的SD大鼠。组织病理学分析还显示，联合BST治疗可明显恢复CCl的脂肪肝和肝纤维化₄处理的SD大鼠。首次证实BST可减轻CCl引起的肝损伤₄．单用BST可提高肝组织中GSH、GSSH含量及抗氧化酶活性(SOD、GPx、GR活性)，维持正常的肝重、体重、正常的GOT、GPT水平和正常的肝脏结构。总体而言，在0.2 g/kg bw水平上，BST的保护作用与水飞蓟素相当。因此，BST可作为一种潜在的肝脏保护剂。

值得一提的是，BST的制备方法是将预热好的黑大豆浸泡在100°C的热水中浸泡20分钟。本研究中BST的浓度分别为0.1 g BS/kg bw和1 g BS/kg bw, BST的用量以整个黑大豆的重量为基础，而不是以黑豆提取物的重量为基础。黑豆提取物可能比BST具有更好的护肝功能;换句话说，较低的浓度可能足以使提取物达到与BST相同的效果。因此，应用合适的提取工艺来获得黑豆中的活性成分具有重要意义，需要进一步研究。

花青素是黑豆种皮中的主要生物化合物，目前受到广泛关注。而黑豆种皮中的主要花青素是C3G [12］．据报道，纯C3G可降低血清天门冬氨酸转氨酶和丙氨酸转氨酶的水平，并降低CCl中肝脏病变的发生率₄治疗的老鼠。C3G显然可以保护肝脏免受CCl的侵害₄-通过抗氧化和抗炎机制引起的肝损伤[11］．在本研究中，BST对CCl有显著的保护作用₄诱导大鼠肝损伤。BST可以释放CCl₄通过增强抗氧化酶活性诱导氧化应激。这可能与C3G的抗氧化活性有关。

确认

本研究由中华民国台湾科技部部份资助。102 (NSC - 2313 - b - 415 - 009)。

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