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e-ISSN号:2581 - 3897
孟德尔米1*Chlopecka米1Dziekan N1Sobczak-Filipiak米2,Bielecki W2和W Karlik1
1药理学和分工毒理学华沙大学兽医学院,生命科学,8日Ciszewskiego圣。02 - 786年华沙,波兰
2病理学和兽医诊断,兽医学院,华沙大学生命科学、8日Ciszewskiego圣。02 - 786年华沙,波兰
收到日期:09/11/2015接受日期:15/03/2016发表日期:18/03/2016
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获得可重复的和可靠的结果在临床前研究中基于牛孤立皱胃标本,有必要确定模型的稳定长期的实验当天组织收集和后冷藏。
组织样本的实验包含皱胃纵向和环形平滑肌定期收集来自屠宰动物。乙酰胆碱和氯化氨甲酰胆碱的剂量反应曲线确定。回应的皱胃条乙酰胆碱的稳定性验证了在长期的孵化和24和48 h后冷藏。分析了标本的形态稳定性与苏木精和伊红染色后显微镜下。
乙酰胆碱和氯化氨甲酰胆碱浓度产生纵向收缩和圆形abomasal准备。参考收缩物质的反应性,乙酰胆碱,稳定通过4.5 h(孵化后的组织收集和冷藏24或48 h。后平滑肌只有轻微影响的形态长期孵化和24小时冷藏后仍不受影响。
进行研究的结果表明,牛的模型分离肌肉标本皱胃可以在体外临床前研究中是一个有用的工具。
皱胃,长期稳定、牛。
有许多尝试使用牛胃肠道(GI)平滑肌条作为替代体外模型来研究不同因素对活性的影响。牛平滑肌标本用于这些目的来源于前胃(1]皱胃[2- - - - - -4],十二指肠[2,3),空肠(5],回肠[6],盲肠[7)和结肠(8]。有各种各样的应用胃肠道准备来自奶牛。Abomasal带主要是用于临床前研究旨在了解各种代理的机制负责皱胃位移和其他蠕动障碍(9- - - - - -11]。此外,孤立皱胃准备参与药理研究为了确定内源性物质的影响(4,8)和外源性物质(8,12他们的肌肉运动的活动。收获的方法和皱胃平滑肌标本是有据可查的准备和认识8,11,13]。作者同意一般,肌肉运动的活动应评估在圆形和纵肌层。abomasal平滑肌准备发表的分析研究表明,组织大多是来自健康的奶牛经常屠杀,不久动物惊人。实验开始总是在马克斯。2 h后隔离和最大持续几个小时。然而,实验的具体时间通常是没有提到过的。一些研究包括参考物质的应用程序开始时和/或最终控制平滑肌的反应性研究[10,13]。使用参考物质显示一些差异在皱胃标本的反应经过几个小时的潜伏期(13),但作者也分析了平滑肌条的反应在整个实验过程和形态的组织。在长期的实验似乎合理的验证和形态学的孵化平滑肌条肌肉运动的活动。
据我们所知,没有研究评价完全牛皱胃条执行长期的有效性实验当天收集和存储后冷却介质。因此,这项研究的目的是评估一个替代的时间稳定性模型基于新孤立和冷储存牛圆周和纵向平滑肌条。
化学品和孵化中
氯化乙酰胆碱(ACh),碳酰胆碱(CCh),(美国圣路易斯西格玛化工有限公司),盐制备所需的孵化媒体:氯化钠,氯化钾,CaCl2,NaHCO3,MgSO4,不2阿宝4葡萄糖和(Avantor性能材料,格利维策,波兰)被用于准备和开展药理实验。苏木精(Avantor性能材料,格利维策,波兰),伊红和Paraplast +(美国圣路易斯西格玛化工有限公司)是用于组织病理学检查。
修改Krebs-Henseleit解决方案(M K - HS)含有氯化钠(123.76毫米),氯化钾(5毫米),CaCl2(2.5毫米),MgSO4(1.156毫米),NaHCO3(14.5毫米),KH2阿宝4(2.75毫米)和葡萄糖(12.5毫米)采用作为孵化中进行实验。M K - h保持pH值7.35 - 7.45的长期实验,而冒气泡不断carbogen(95%啊2+ 5%股份有限公司2)和加热到37°C。氯化乙酰胆碱和氯化氨甲酰胆碱溶解在M K - h。
Abomasal带隔离和准备
实验进行了组织从成人,获得健康的奶牛在一个屠宰场。标本的abomasal腔是收获20分钟- 30分钟后,动物惊呆了。整体厚度与粘膜肌肉准备从皱胃幽门窦,大约20厘米幽门口部。后立即隔离,样本切割和网膜切除。组织样本被冲洗,然后沉浸在冷却Krebs-Henseleit修改解决方案(4°C)。接下来,样本运送(约。60分钟)到实验室。在实验室条件下组织逐渐升温,固定在解剖盘包含M K - h。Abomasal黏膜和浆膜被移除。准备被削减平行于纵向肌肉纤维(皱胃纵向平滑肌条- AL)或平行于圆形纤维(皱胃环形平滑肌条- AC)。 The majority of circular or longitudinal muscular layer was always dissected in order to secure oxygen supply to AL or AC tissue, respectively. The final size of the muscle strips was 5 mm in width and 20 mm - 25 mm in length. In case of experiments carried out 24 h or 48 h after collecting the tissue, the abomasal strips were stored in pre-oxygenated M K - HS at 4°C.
登记的平滑肌活动
每一块肌肉,交流或半岛,是悬浮在5毫升容量的分开的器官浴室(器官舒勒浴,雨果•萨克斯Electronik March-Hugstetten,德国)。孵化室满心温暖M K - h,不断充斥着carbogen(95%啊2和5%的公司2)。准备是远侧地连接到一个钩,检查一个等距测力传感器(+ 30,372型,雨果•萨克斯Electronik March-Hugstetten,和德国)。所有实验0.01 n的负载下进行等距传感器连接到一个模拟数字注册组(PowerLab ADInstruments,澳大利亚悉尼)桥放大器(DBA、660型、休•萨克斯Electronik March-Hugstetten,德国)。孤立的录音AL和AC条肌肉运动的活动被图表v7.0注册程序(ADInstruments,悉尼,澳大利亚)。所有的计算和分析图表v8.1.1完成项目和Excel (MS Office XP专业)。
实验的顺序
pre-incubation的每个实验之前是75分钟。整个pre-incubation时期钱伯斯被冲毁每15分钟- 20分钟新鲜、温暖的M K - h。平衡包括45分钟内没有张力,紧随其后的是一段时间的15分钟和0.005 N紧张和另一个15分钟的额外0.005 N紧张。接下来,组织进行了多个与乙酰胆碱(10μM)治疗。如果响应AC和艾尔ACh应用程序是可重复的和如果带表现出有规律的自发肌肉运动的活动,准备用于进一步检查:(i)累积剂量反应曲线的ACh和CCh(0.001μM - 100μM)获得在不同实验;(2)反应性AC和铝条ACh(10μM)应用在长期孵化后评估1.5 h M K - h的孵化和每小时之后在接下来的4.5 h,刷新了条新的M K - HS每15分钟- 20分钟中间,自发收缩的频率测量5分钟后1.5 h和4.5 h M K - h的孵化;(3)反应性AC和铝条ACh(1μM和10μM)应用程序执行在M K - 1.5 h的孵化后当天海关比较孤立的组织和准备(1天),24小时后(2天),48 h后(3天)。每个实验涉及组织5 - 6条的复制,而一种动物作为供体的只有一个空调和一个标本。
数据计算和统计分析
平滑肌活动的登记表示为带的张力的变化表现在整个实验。检查所有的物质的影响是基于平滑肌条的张力变化记录之前和之后的任何物质的应用和计算AUC(曲线下的面积)。碱的剂量反应曲线,CCh AC和n的所有数据表达。平滑肌条的反应的应用纯M K - h在相同的体积测试物质(50μL)表示为“控制”。如果计算结果是积极的(值高于0)和收缩反应是评估,如果结果是负数(价值低于0)与myorelaxant反应是评估。然而,在其他情况下,例如,comparison of smooth muscle reactivity during long-term incubation and after 24 h and 48 h storage the results were expressed as the percent of the reaction caused by the reference substance, ACh, applied in the optimal dose (10 μM) at the beginning of the experiment. The contraction provoked by acetylcholine in the reference dose was defined as 100% (control). All data was analyzed using Statistica PL for Windows (v10.0). Results were expressed as mean values ± SD. Values of p ≤ 0.05 were considered to be significant. The following tests were employed in the statistical analysis: t-Student test, a one-way analysis of variance (ANOVA) with post-hoc LSD Fisher test.
组织病理学检查
Abomasal圆周和纵向平滑肌条收集:(i)后直接制备;(2)存储在24 M K - h (4°C),(3)实验结束时在1圣或2nd的一天。准备在10%中性缓冲福尔马林固定和嵌入在石蜡(Paraplast +),在旋转切片机切片。准备4μm厚度的自动与苏木精和伊红染色(Varistain双子座热科学、Runcom柴郡,英国)。细胞核和细胞质的形态变化包括核溶解或karyopycnosis,细胞核和细胞质vacuolisation,和程度的细胞结构被伊红染色和苏木素的测定(14]。微观分析是由奥林巴斯光学显微镜BX 43(奥林巴斯光学有限公司,日本东京)连接到相机电脑SC30和图像分析计算机程序(CellSens进入2011年,奥林巴斯光学有限公司,东京,日本)。严重受损细胞表面的计算(μm2相比),检查了带钢表面的表面。最终结果表示为百分数的受损细胞表面的地带和代表平均值±SD。数据分析使用Windows v.10.0 Statistica PL (t-Student测试,单向方差分析(方差分析)与事后LSD费舍尔测试了)。p≤0.05的值被认为是重要的。
氯化氨甲酰胆碱和乙酰胆碱在皱胃收缩的影响
所有检查胃平滑肌条表现出明显的自发性活动75分钟后孵化M K - h。自发运动的频率保持稳定在孵化的时间和之后4.5 h M K - h达到90.18±18.99和110.09%±22.54%的频率测量的AL和AC的平衡时间。然而,自发运动的振幅逐渐下降,特别是在AC标本。CCh和空调采暖产生了巨大的收缩反应纵向和圆真胃平滑肌条(图1 a、1 b和2)。包含纵向肌肉纤维的反应通常更强的准备工作都比圆形纤维收缩剂的应用。CCh简约AL和AC如果是用于浓度范围0.01μMμM - 100和0.1μM - 100μM,分别。然而,没有收缩强度的显著增加和AC,如果CCh是应用于高剂量的1,10和100μM(图1 b)。的乙酰胆碱浓度的范围的物质诱导显著收缩达到0.1μM - 100μM和1μM AL和AC - 100μM,分别。虽然诱发反应摄入量有关,产生收缩的力量逐渐增加,最大收缩,如果空调采暖管理100年集中μM,来到5.96±1.86,2.07±0.76 N。艾尔和交流(图1),分别。回应的皱胃条ACh 10μM浓度稳定,其力量并没有改变在几小时孵化(4.5小时)(图3)。在AL ACh-generated反应摇摆不定的力量97.12±8.05(4.5小时),106.56%±8.88%(3.5)后ACh-induced 1.5 h的孵化后收缩。在AC ACh-evoked收缩的强度范围在99.37±8.67(4.5小时)和104.08%±9.35%(3.5)后ACh-induced 1.5 h的孵化后的反应。此外,艾尔和AC条相同的反应力ACh(1μM和10μM)应用程序1圣,2nd和3理查德·道金斯天的实验(图4 a和4 b)。无统计差异在寒冷收缩力量组织存储时24小时和48小时。
图1:牛的反应孤立皱胃纵向和圆形平滑肌条乙酰胆碱,乙酰(A)和碳酰胆碱- (B)的应用程序。
图2:样本唱片的孤立皱胃圆形(A和C)和纵向(B和D)平滑肌准备应对应用乙酰胆碱和氯化氨甲酰胆碱。与M K - h F -冲洗,呵——乙酰胆碱,氯化氨甲酰胆碱。
图3:牛的反应孤立皱胃纵向和环形平滑肌条乙酰胆碱(10μM)应用在长期孵化M K - h。
图4:牛的反应孤立皱胃纵向(A)和循环(B)平滑肌条乙酰胆碱(1μM和10μM)应用程序准备当天(1天)24(2天)后48小时(第三天)存储在M K - h (4°C)。
结果表示为带张力的变化(n)。平滑肌条的反应到M K - h表示为一个控制。5 - 6的结果表示为均值独立实验(±SD) * p≤0.05与控制。
结果表示为%的收缩引起的乙酰胆碱应用于参考剂量的1.5 h(孵化后10μM M K - h。5 - 6的结果表示为均值独立实验(±SD) * p≤0.05 vs ACh(10μM) 1.5 h的孵化后应用
结果表示为%的乙酰胆碱引起的收缩在组织准备。5 - 6的结果表示为均值独立实验(±SD) * p≤0.05与空调采暖应用于1圣的一天。
长期的孵化和冷藏的影响在M K - h形态结构
皱胃平滑肌条检查后直接制备、0 h(孵化,组织收集当天宰杀牛(控制)包含9.38%±7.25%和8.66%±3.00%的明显受损的细胞(凋亡、坏死和自溶的细胞数)AL和交流(表1和图5)。4.5 h孵化的收集的动物一样“控制标本”导致了轻微的但不显著增加严重受损平滑肌细胞的百分比。长期潜伏在年底M K - h的受伤比例纵向平滑肌来到14.91%±5.87%和圆形纤维15.11%±9.21%。艾尔的存储和交流准备在4°C M K - h 24 h没有导致任何显著增加的百分比明显受损的细胞相比,受损细胞的百分比衡量第一天(控制)。严重受损细胞的百分比在带存储24小时(4°C、M K - HS)然后孵化为4.5 h达到15.45%±6.60%和14.20%±12.13%艾尔和交流的情况下,分别(表1)。
表1:组织操纵的影响,制备(第一天,0 h(孵化),冷藏(第二天,0 h(孵化)和孵化时间在M K - h(第一天,4.5 h(孵化,第二天;4.5 h(孵化)abomasal平滑肌形态。
图5:样品的照片皱胃标本的形态(他染色,obj。放大4倍)。A -皱胃纵向平滑肌标本:第一天的实验中,0 h孵化的M K - h;B -皱胃纵向平滑肌标本:第二天的实验中,4.5 h M K - h的孵化;C -皱胃环形平滑肌标本:第一天的实验中,0 h孵化的M K - h;D -皱胃环形平滑肌标本:第二天的实验中,4.5 h M K - h的孵化。
结果表示为百分数的受损细胞的表面(的总和坏死、凋亡和自溶的细胞)的地带。整条的表面被定义为100%。5 - 6的结果表示为均值独立组织病理学检查(±SD) * p≤0.05与控制(第一天;0 h(孵化)。
本研究的主要结果是,牛孤立皱胃标本进行原状活动长期孵化期间修改Krebs-Henseleit解决方案后当天收集和存储在冷却条件下(4°C) 24小时和48 h
这个观察是基于分析半岛和AC响应ACh和形态的照片证实了准备存储24 h。此外,结果表明,CCh和空调采暖导致剂量依赖性收缩AL和交流。然而,诱发反应的力量取决于应用物质和平滑肌纤维取向的准备。
总的来说,这项研究揭示几个差异平滑肌条包含纵向和环形平滑肌。介绍了实验中使用的所有标本在一个肌肉层为主,纵向或圆形。解剖的大多数其他肌肉层保证适当的氧供研究组织(9]。氧气和营养物质的扩散通过胃肠壁被认为是足够的只有通过第一个150μm层细胞,以获得的结果在心脏组织15,16]。因此,为了保持合理条件条用于我们的研究没有包含完整的肌肉层的厚度。同时,一个不完整的解剖的平滑肌层保证控制子宫收缩的肌间神经丛和计划生育政策放宽的胃肠道平滑肌细胞(17),确保标本展览自发活动的能力。然而,艾尔和AC的自发收缩性是不相同的。发现AC条是自发活性低于AL准备是根据观察羊皱胃腔带(18]。总的来说,结果表明高反应性的皱胃准备面向纵向肌肉纤维比圆条。这个发现支持以前的观测,腔纵向准备对毒蕈碱的受体激动剂反应更明显比腔圆条[应用程序2]。相等的结论是换到更高的响应的大小在纵向比在圆形肌肉所空肠(5和近端结肠标本循环8]。相反,氨甲酰甲胆碱在圆形皱胃标本的收缩效果更明显相比,纵向方向的准备工作12]。然而,在牛小肠标本,在纵向氨甲酰甲胆碱的收缩效应高于圆形肌肉准备(7]。对胆碱能受体激动剂的敏感性更高(ACh和CCh)纵肌比圆形肌肉中观察到这里的研究报告可能会导致神经支配的差异。胆碱能兴奋神经支配主导皱胃的肌肉层,但只有圆形肌肉也收到抑制nitrergic神经支配(19]。毒蕈碱的受体M5型(旁边M1, M2和M3)检测在平滑肌细胞表面的肌肉层皱胃和假定调节肌肉收缩和放松。因为M5受体与更强的染色比圆形纵肌层中的一个(20.),这也可以解释的更明显反应AL毒蕈碱的受体激动剂的应用程序相比,交流。交流收缩药物反应的不太突出,也可以解释为平滑肌含量略高,成为严重损坏(在坏的情况下受伤的表面的比例达30.33%)在长期孵化M K - h(表1)如果比较。结果显示提出的相似之处和差异数据Zulauf et AL。13]。在这两项研究都采用标本反应充分参考收缩剂(10μM ACh或0.5μM CCh)后平衡期和后3小时以内。然而,只有本文提供的数据表明,收缩的强度记录后4.5 h孵化的M K - h不降低相比,第一个应用程序的课时(图3)。有趣的是,不断回应ACh应用确认条保存在冷却M K - h (4°C) 24 h或48 h。同样,艾尔和AC的自发活动的频率测量在我们的研究中没有差别在整个实验过程中,虽然Zulauf et AL。13)观察宫缩的频率明显下降。令人惊讶的是,Zulauf等人没有注意到任何差异在纵向收缩频率和圆形标本,而根据所述研究自发收缩的频率以及振幅的诱发宫缩总是更高的艾尔和交流。在此获得的相对高值的标准差确认其他引用作者声称的观测高度的可变性在abomasal壁的收缩性模式标本组织获得的异质群体屠杀动物。因此,假定使用参考物质在参考/最优浓度为了身上的结果在未来当使用牛孤立胃肠道平滑肌模型准备。以来,就像在其他动物物种,在奶牛真胃收缩控制主要由胆碱能神经传递涉及毒蕈碱的受体亚型的M1、M2、M3和M5 (10,20.,21)选择像碳酰胆碱和乙酰胆碱的毒蕈碱的受体激动剂作为参考物质是毋庸置疑的。相比之下,标准为参考浓度的选择应该明确定义。最优浓度既不是第一个也不是最后一个有效剂量量效曲线上。它应该保存平滑肌检索自发活动的能力;它应该证明重现性和可重复性。考虑第一个标准似乎不可能选择一个最优的浓度,特别是在环形平滑肌的准备。尽管碳酰胆碱产生显著收缩浓度范围宽,即。,0.01 μM - 100 μM and 0.1 μM - 100 μM for AL and AC, respectively, the strips develop tachyphylaxis rapidly. The application of CCh in a dose of 1 μM or higher resulted in contractions of AL and AC, which sizes were comparable(图1 b)。乙酰胆碱的使用剂量的增加引起足够的加强引起收缩的力量。这个观察与发现协议中描述之前的研究(9]。因此,10μM的浓度满足第一个标准为参考浓度AL和AC标本(图1)。除此之外,管理ACh的剂量10μM诱导可再生的和可重复的收缩带ACh在这集中回收处理后立即冲洗用新鲜M K - h。
在反应性的评估,模型的时间稳定性的牛孤立皱胃条包括自发肌肉运动的分析活动。振幅的自发收缩性纵向条仍在长期影响孵化M K - h,但逐渐减少的环形平滑肌纤维。4.5 h的孵化后收缩的频率相当与频率测量经过平衡段平滑肌纤维的取向。这些发现在与前所述研究报告的频率降低AL收缩(13)和收缩活动交流的增加11随着时间的推移)。艾尔和AC的保存自发收缩性,不受干扰的反应哦(图4 a和4 b)和形态图(表1)的肌肉条皱胃24小时和48小时后冷却存储(4°C) M K - h不意外。就在1914年,耿氏,昂德希尔发现兔子和猫肠道平滑肌仍能产生有节奏的自发运动和对胆碱能和肾上腺素能刺激后5天的存储3°即°C (16]。根据获得的结果在豚鼠孤立的猪盲肠,假设抗胆碱能神经药理刺激的响应能力是长期冷藏(22]。冷藏50 h并没有改变的反应豚鼠空肠纵向平滑肌膜的重复性刺激(23]。相比之下,犬结肠准备的圆形肌肉显示减少持续时间的慢波对透壁的神经刺激的持续时间和减少反应24小时后存储在4°C (24]。冷藏后的标本收缩性的差异可能观察到桑德斯和史密斯24]引起平滑肌方向自圆肌条通常发现少显示明显的收缩性,如前所述。老鼠隔离膜食管肌层条仍对毒蕈碱的cholinoreceptor刺激后48 h(冷藏(25]。
总结,提出了研究的结果表明,牛孤立纵向和圆形肌肉标本皱胃可以作为另一种实验模型在生理和药理研究。实验过程中获得的结果,持续4.5 h的组织收集、以及24 h后的组织冷藏(4°C、M K - HS)是可重复的和可靠的自形态照片和平滑肌收缩性所描述的条件下是不受干扰的。此外,48小时长冷藏皱胃标本不会改变平滑肌反应。
