碱法提取蛹虫草多糖的工艺研究

摘要

采用氢氧化钠萃取法从蛹虫草子实体中分离得到两种新的多糖(A-WSCBP50I和A-WISCBP50I)。根据各自的IR和1H NMR谱，两种化合物均以α型糖苷键为主。a - wscbp50i分子量为8.17 kD，主要由葡萄糖、甘露糖和阿拉伯糖组成，含量分别为38.67%、27.22%和21.96%。另一种多糖A-WISCBP50I主要由葡萄糖(69.06%)和甘露糖(27.80%)组成。此外，粗多糖A-WSCBP具有体外清除DPPH自由基的能力，IC50为0.068 mg/mL。A-WISCBP对nbt -核黄素体系产生的超氧自由基具有清除作用，IC50为1.608 mg/mL

关键字

蛹虫草碱提多糖，水不溶性多糖，结构表征，抗氧化。

简介

多糖来源广泛，因其具有多种药理活性而受到越来越多的关注[1-4，可用热水、碱、酶等提取。传统观点认为多糖因其羟基而溶于水，其溶解度是其生物活性的基础，而不溶性多糖的生物活性低或无生物活性。由于生产效率低和其他方法研究技术的限制，目前主要的提取方法是热水提取。但该方法存在提取温度高、操作时间长等缺陷，容易导致多糖降解。此外，大量可能含有活性成分的残渣在热水萃取后被丢弃。碱提法是另一种常用的多糖提取方法，其产物通常具有生物活性[5-8］．然而，大多数研究人员关注的是热水提取的多糖。因此，对碱提多糖及其生物活性的研究较少，对水不溶多糖的研究更少。

多糖的蛹虫草，是替代著名中药虫草的有力候选，具有多种药理活性[9-11]，包括免疫刺激[12-14]，抗氧化剂[12，14，15]和抗肿瘤活性[14］．部分多糖的结构已被阐明，但碱提多糖除少数报道外，几乎未被阐明[16，17］．

我们报道了一种热水提取的具有较强抗氧化活性的多糖在体外［18］．本研究探讨了两种碱法提取的新多糖的结构特征和潜在的抗氧化活性蛹虫草．

材料与方法

材料及化学品

的培养c .曾C19子实体来自深圳鹏源生物科技有限公司(深圳，中国)，经研磨筛选提取多糖。从Sigma有限公司购买了几种化学品，包括核黄素、硝基蓝四唑(NBT)、蛋氨酸(Met)和1,1 -二苯基-2-辛基肼(DPPH)，而Sephadex G-100则来自GE医疗生命科学公司。

碱法提取多糖

用热水从子实体中充分提取多糖后，用0.7 mol/L氢氧化钠(NaOH)以1:8 (W: V)的比例混合提取多糖，提取0.5 h，分3次。然后将组合提取物用乙酸中和至pH 6.7，离心(10000 rpm, 10 min)。取上清液为碱提水溶性多糖(A-WSCBP)，沉淀为碱提不溶性多糖(A-WSCBP)，用NaOH (0.5 mol/L)溶解备用。用95%乙醇再次沉淀，然后依次用丙酮和乙醚脱脂30分钟。采用Sevag法对A-WSCBP进行脱蛋白[18］．a - wisbp沉淀用氢氧化钠溶解，与Sevag剂量混合，搅拌1 h，离心(11000 rpm, 20 min)去除蛋白，重复3次。用Bradford法和苯酚-硫酸法分析蛋白质和多糖的含量[19］．

多糖的分离纯化及纯度评价

以A-WSCBP为原料，用无水乙醇分离沉淀至50%，得到A-WSCBP50。用足量水溶解，离心(10000 rpm, 10 min)，上清液经Sephadex G-100凝胶过滤层析(柱2 cm × 60 cm)纯化，流速0.4 mL/min。另一种多糖A-WISCBP，将透析后的多糖溶液加入无水酒精至浓度50%，4℃沉淀过夜，离心(10000 rpm, 10 min)得到沉淀，命名为A-WISCBP50。用0.5 mol/L NaOH溶解a - wiscbp50，喷射到Sephadex G-100色谱柱(2 × 60 cm)中，与0.1 mol/L Na平衡₂HPO₄流速0.5 mL/min。

然后分别采用凝胶渗透色谱法(GPC)和190 ~ 700 nm紫外光谱法测定A-WSCBP50I和A-WISCBP50I的均匀性。

多糖的理化性质

A-WSCBP50I的分子量采用GPC测定，A-WSCBP50I和A-WSCBP50I的单糖组成采用GC-MS测定，如先前报告所述[18］．

在4000 ~ 400 cm范围内，采用KBr球团法进行红外光谱分析⁻¹并通过¹H核磁共振谱与D₂根据之前的报道，以O为溶剂(加入部分0.5 mol/L NaOH以提高a - wisbp50i的溶解度)[18］．

自由基清除试验

根据我们之前的报告，在3.0 mL DPPH乙醇体系中进行DPPH清除实验[18］．计算公式表示为:

清除率(%)=[(Ac-As)/Ac] × 100%(式1)，其中Ac和As分别为对照和样品的吸光度。

根据文献[a - wisbp对超氧自由基的清除能力分析]18]，反应体系中0.5 mol/L NaOH取代PBS。

结果与讨论

分离、提纯和纯度

A-WISCBP50的脱蛋白率为60.63%，多糖损失率为32.34%。在Sephadex G-100色谱柱上分离时，两种粗多糖均有一个多糖峰和一个蛋白质峰重叠(图1)。收集、浓缩、冻干多糖峰的主要部分，分别命名为A-WSCBP50I和A-WISCBP50I。根据GPC (表1)，共洗脱4个峰(相对含量分别为0.37%、0.46%、0.23%和98.94%)。后者A-WISCBP50I在紫外光谱上表现出多糖的特征吸收峰，最大吸收峰为224 nm (图2)。454 nm处吸收峰很弱，有少量色素，260 nm处未出现吸收峰，无核酸。

表1:A-WSCBP50分子量测定结果I。

分子量

GPC测定A-WSCBP50 I主要成分分子量为8.17 kD (表1)，说明其主要含有低分子量成分。

化学成分

GC-MS结果显示，A-WSCBP50I主要含有Glc(38.67%)、Man(27.22%)和Ara(21.96%)，少量Gal(6.90%)、Rib(3.13%)、Rha(1.38%)和Xyl(0.75%)，单糖含量与W-CBP50Ⅱ有显著差异[18］．A-WISCBP50 I主要由Glc和Man组成，含量分别为69.06%和27.80%。此外，还含有少量Ara(1.81%)、Gal(0.24%)、Rib(0.43%)、Rha(0.39%)和Xyl(0.28%)。

红外光谱和¹H核磁共振谱

A-WSCBP50 I和A-WISCBP50 I的红外光谱如图图3两者均表现出4000 ~ 400 cm范围内多糖的共同特征^－1．吸收带以842厘米为中心^－1A-WSCBP50 I的α-异位结构[20.］．A-WSCBP50 I的特征与W-CBP50 II相似，只是特征峰强度和峰位置有一定变化，多出3个吸收峰，范围在1654-2888 cm^－1（图3一)。但a - wisbp50i与水溶性多糖(图3 b)。综合单糖的红外光谱不能判断其构型，在891±7 cm附近均无吸收峰^－1也不是844±8厘米附近^－1．

在5.33/5.07 ppm浓度下的异位信号¹a - wscbp50i和a - wscbp50i的H NMR谱表明，它们都含有α型糖苷键(图4)。4.70/4.72 ppm的强信号同时表现为溶剂共振或β型糖苷键的共振，表明A-WSCBP50I和A-WSCBP50I中可能同时存在α型和β型糖苷键¹H核磁共振谱。

因此，根据IR和α型糖苷键可以推断A-WSCBP50I主要含有吡喃糖和α型糖苷键¹H核磁共振谱。GC-MS、IR和分析结果表明，A-WISCBP50I主要含有α- d -吡喃糖和少量呋喃糖，可能同时含有α和β糖苷键¹H NMR。

虽然A-WSCBP50I与我们之前报道的W-CBP50II有一些相似之处，但它们是两种不同的多糖。首先，A-WSCBP50I主要由葡萄糖、甘露糖和阿拉伯糖组成，W-CBP50II主要由葡萄糖、甘露糖和半乳糖组成。二是在1H NMR谱中存在不同的信号区。此外，两者在红外光谱上也有显著差异。A-WSCBP50I的2888 cm-1强度高于W-CBP50II。此外，前者的指纹区域强度高于后者，这意味着两者在结构上存在较大差异。第三，A-WSCBP50 I对DPPH自由基的清除能力明显低于W-CBP50II。

此外，A-WSCBP50I也不同于用碱性提取的多糖CBP-1c .曾在组成、分子量和糖苷键上[16］．如上所述，A-WSCBP50I主要含有Glc、Man和Ara，含有少量Gal、Rib、Rha和Xyl，而CBP-1主要由Man、Gal和Glc组成。CBP-1的891 cm和840 cm同时含有α和β糖苷键^－1吸收带。A-WSCBP50I与CBP-1不同在于其α构象，峰在842 cm处^－1在红外光谱中。原因可能是我们在提取、分离和纯化时采用了不同的方法。

多糖的抗氧化活性

a - wscbp对DPPH的清除具有浓度依赖性，IC50为0.068 (图5一个)。A-WSCBP50I对同一自由基的清除能力要弱得多，浓度为0.254 mg/mL时，A-WSCBP50I的清除率为24.92%。可能的原因是在提纯过程中丢失了一些活性成分。此外，A-WSCBP50I的抗氧化活性远低于W-CBP 50II。这可能是因为氢氧化钠溶液作为提取溶剂对多糖进行了部分分解，导致多糖结构退化和活性下降。另一个证据是CBP-1(碱性提取多糖)和P70-1(水提取多糖)的IC50分别为0.638和0.548 mg/mL。但A-WSCBP50I本身抗氧化活性并不低，具有潜在的应用价值。

A-WSCBP和A-WISCBP均能清除超氧自由基(图5 b)。前者在低浓度范围内具有清除活性，当浓度为0.067 mg/mL时，清除率为53.67%;后者多糖a - wisbp在较高的浓度范围内表现出剂量依赖性清除活性，IC50为1.608 mg/mL。当a - wisbp浓度为3.233 mg/mL时，多糖的清除率为99.20%，具有较强的抗氧化活性在体外．A-WSCBP和A-WISCBP清除活性差异的原因可能与它们的结构性质有关，但仍需进一步研究。

结论

碱提水溶性多糖A-WSCBP50I主要由Glc、Man和Ara组成。IR和1H NMR结果表明，A-WSCBP50 I的糖苷连锁为α型，分子量为8.17 kDa。A-WSCBP和A-WSCBP50I均能清除DPPH自由基，A-WSCBP也能清除超氧自由基，具有抗氧化活性在体外．

水不溶多糖a - wiscbp50i是一种杂多糖，主要由Glc和Man组成。其糖苷键主要为α型;但也可能含有β型糖苷键。除了建立了合适的分析方法外，我们还发现水不溶多糖对超氧自由基有很强的清除能力在体外．

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