阿司匹林蛋白质结合细节的化学生物学解读

摘要

荧光猝灭和荧光共振能量转移(FRET)理论被广泛应用于药物-蛋白质结合的研究，但内部过滤效应并不总是得到修正，这可能导致结果不准确。鉴于此，采用三维荧光光谱、紫外光谱、圆二色光谱和分子建模方法研究了阿司匹林(ASP)与人血清白蛋白(HSA)的相互作用。在评估结合位点数量、平衡常数和热力学参数时，从荧光原始数据中减去内部效应。结果表明，HSA上只形成了一个结合位点，且随温度升高而明显受损。的负吉布斯自由能变化(Gθ)表明结合是自发的。同时，负焓变(Hθ)和熵变(Sθ)表明氢键对ASP-HSA配合物的形成有重要影响。利用校正后的荧光数据，根据Förster的非辐射共振能量转移理论计算供体和受体之间的距离。同步光谱显示色氨酸残基极性增加，这为结合位置的确定提供了线索。采用CD光谱检测HSA的二级结构变化。在实验结果的基础上，进行分子建模，计算出全景和细节同时参与的最优对接模式。

关键字

阿司匹林，人血清白蛋白，能量转移，内过滤效应，分子模型。

简介

对药物的药理作用要考虑的一个重要因素是它们的结合倾向血浆蛋白［1］．蛋白质在血浆或组织中的结合程度控制着其分布量，并影响肝脏和肾脏的清除率[1，2］．人血清白蛋白(Human serum albumin, HSA)是一种单体多结构域大分子，通常被认为是一种非特异性转运蛋白血浆瘤压以及身体各室间流体分布的主要调节器[3.]，主要是药物-蛋白质结合研究中的蛋白质模型[4］．阿司匹林，又称乙酰水杨酸(ASP;公式:C₉H₈O₄；CAS注册号:50-78-2)，是一种水杨酸类药物，临床上用于治疗多种疾病，包括发烧、疼痛、风湿热和炎症性疾病，如类风湿关节炎、心包炎[5］．ASP还通过抑制血栓烷的产生具有抗血小板作用，在正常情况下，血栓烷将血小板分子结合在一起，在受损的血管壁上形成一块斑块，血小板斑块可以变得足够大，在局部和下游阻断血液流动[6］．低剂量的ASP也显示在某些情况下可降低心脏病发作死亡风险或中风风险[7］．有证据表明ASP可有效预防结直肠癌，特别是结直肠癌，但其作用机制尚不清楚[5，8］．

对于如此重要的药物，发现其与血清白蛋白相互作用的文献并不奇怪[9，10］．一些文献采用荧光法研究结合平衡和结合几何[11-13]，但计算中没有修正内滤波效应，可能会影响部分结果的准确性[14，15］．此外，以前的工作没有给出相互作用的热力学，这使得很难评估的性质绑定的力量。

研究了ASP在模拟生理条件(离子强度为0.1 mol·L)下与HSA的结合反应⁻¹；pH值7.40;采用多种光谱方法，计算结合常数，结合位点的数量和结合位置，利用减去内滤效应的数据，从热力学参数分析结合力的性质，检测HSA的结构变化，并根据实验数据对新配合物的分子结构进行建模。

实验

材料

HSA购自Sigma(美国，99%)。ASP、Tris、HCl、NaCl购自中国上海化学试剂公司。其他所有化学品均为分析级。HSA原液(10-5 mol·L^－1)， ASP (10-3 mol·L^－1)， NaCl (0.5 mol·L^－1)和Tris-HCl缓冲液(0.05 mol·L^－1Tris, 0.15 mol·L^－1直接溶解原试剂制备pH为7.40的HCl)。用于制备溶液的水是二次蒸馏水。

仪器的方法

所有荧光光谱都记录在F-4600上荧光Spectrofluorimetry(日立，日本)配备1.0厘米的石英电池和恒温浴缸。为了获得中等强度的平滑发射光谱，激发狭缝和发射狭缝宽度均设置为5 nm。扫描速度设置为2400nm / min。选取275nm的激发波长，减去相应缓冲液的空白以校正背景。在装有1.0 cm石英单元的TU-1901分光光度计(Purkinje General, China)上记录不同温度下的紫外光谱。圆二色(CD)测量是在311 K的J-810分光偏振仪(Jasco，日本)上进行的，配备1.0 cm石英单元，波长范围为260-200 nm，扫描速度为200 nm / min，在恒定的氮气冲洗下进行。pH测量是用pH- 3数字pH计(中国上海)进行的。所有重量测量均使用AY-120电子分析秤(日本岛津)进行。

内滤镜效应

内滤波效应是指吸收的辐射向(激发)或从(发射)。荧光团，从原始荧光数据中减去这种效应是很重要的[14］．为了校正HSA和ASP的内滤效应，测量了激发波长和发射波长的吸光度。的荧光用公式(1)对强度进行修正:

(1）

F_天哪和F_{奥林匹克广播服务公司}分别对荧光强度进行校正和观察，A_前女友和一个_新兴市场分别是系统在激发波长和发射波长处的吸收。除三维荧光光谱外，本文所用的荧光强度均为校正后的荧光强度。

分子建模

分子模型计算使用Sybyl 8.1进行。HSA的晶体结构来源于Brookhaven protein data bank (PDB)数据库(输入代码:site I为1h9z, site II为2bxg)，分析前去除所有配体和水分子。加入H原子，采用AMBER7 FF99法对生物聚合物进行充电。用配体确定蛋白的位点(位点I为A/WRR2001，位点II为A/IBP2001);用Sybyl 8.1软件分析配体与HSA结合的主要区域。利用sybyl 8.1包生成ASP的结构，采用Gasteiger和Marsili法对分子进行充能后，利用Tripos力场对分子进行优化(能量最小化)。ASP与HSA的对接模式由aSurflex-Dock程序在Sybyl 8.1软件包中。

结果及讨论

三维荧光光谱

荧光是一种非破坏性的追踪或分析生物分子的方法[16，17]并已广泛应用于生命科学，因为它存在于自然界的各种生物系统中[17，18］．荧光是激发波长和发射波长的函数，因此荧光体的完整荧光信息只能通过三维荧光光谱来描述，其中记录了包含激发波长、发射波长和荧光强度的立体视觉。根据实验程序，记录了在ASP存在和不存在时HSA的三维荧光光谱图1荧光峰信息列于表1．

表1。三维荧光峰的特征参数。

两个典型的HSA荧光峰图1分别标记为峰1和峰2。峰3(235.0/340.0,71.54)和峰4(290.0/ 4100,366.1)是ASP的典型荧光峰。峰2的强度明显高于峰1，因此在后续实验中选择峰2的激发频率(275 nm)作为最佳激发波长。加入ASP后，这两个峰的强度明显降低，即俗称的荧光猝灭。

紫外吸收光谱

荧光猝灭可由许多物理和化学过程引起[19]，但可分为动态机构和静态机构[20.］．静态机制是指基态络合物的形成导致辐射降低，在此过程中，由于HSA的吸收光谱对发色团周围的微环境很敏感，因此荧光粉和猝灭剂的吸收始终发生变化[21］．图2显示HSA的紫外吸收光谱，ASP, HSA-ASP系统．在图2，曲线b’为HSA与ASP吸光度的物理叠加。与HSA-ASP体系的光谱有明显不同(曲线b)，提示形成了新的化合物。如图2， HSA在275 nm处有一个吸收峰，与三维光谱中HSA的典型荧光峰重合。同时，ASP还能吸收275 nm处的辐射，这意味着它的内滤作用不可忽视[22］．

淬火机理分析

为了确定猝灭机理，当激发波长稳定在275 nm时，记录了不同数量ASP存在时HSA的发射光谱，如图所示图3．假设淬火为动态淬火，不同温度下的荧光数据可以用著名的Stern-Volmer方程[23，24]：

（2）

在哪里F₀、F分别为不存在猝灭剂和存在猝灭剂时的荧光强度，K_SV为Stern-Volmer淬火常数，[Q]为淬火剂浓度。K_问生物大分子的猝灭速率常数和K_问= K_SV/τ₀,τ₀在没有猝灭剂的情况下，荧光团的寿命和生物聚合物的寿命是否等于10⁸年代(25］．方程2可用于确定K_SV的线性回归图F₀/F对[Q]。图4显示ASP在四种不同温度下对HSA荧光猝灭的Stern-Volmer图，计算各温度下对应的KSV，列于表2．

表2。Stern-Volmer常数。

动态淬火由碰撞引起[26，27]，各种淬灭剂与生物聚合物的最大散射碰撞猝灭常数为2.0 × 10¹⁰L·摩尔^－1·年代^－1［28]，但很明显，速率常数K_问所示表2大于2.0 × 1010 L·mol^－1·年代^－1．这些结果表明，猝灭不是由动态碰撞引起的，而是由新配合物的形成引起的[21］．

结合平衡和热力学

血液中大约50-80%的ASP与白蛋白结合，而其余的仍处于活性电离状态

状态。对于静态淬火过程，结合平衡可由以下公式3 [15，29]：

（3）

在哪里F₀， F，和[Q]与eq 2相同，Kb为观察到的结合常数，n为每个HSA分子的结合位点数。log (F₀/F−1)与log [Q]的值成线性关系，其中斜率为结合位点的个数(n)，截距(原点纵坐标)为的对数值K_b(日志K_b）．回归曲线和方程见图5．相应的K_b并计算结合位点的数量(n)表3．观察到的结合常数随温度的升高而降低，表明温度对新配合物的稳定性有显著影响。

表3。观察结合常数、结合位点和热力学参数。

为了判断ASP与HSA之间的亲和类型，相互作用的焓变和熵变是重要的[30.，31］．因此，结合常数对温度的依赖关系由式(4,5)研究:

（4）

（5）

在H^θG^θ和S^θ分别为焓变、吉布斯自由能变和熵变。logK与1/T的关系图(范霍夫图)可以确定H^θ,年代^θ等压过程和G^θ可由式(5)计算。范霍夫图示于图6热力学参数列于表3．负G^θ在表3说明在生理条件下，ASP与HSA的相互作用是自发的。负H^θ说明结合反应是放热过程，这可以为的值下降提供合理的解释K_bn加上温度表3．负S^θ表明相互作用是熵驱动的。

基于Ross和Subramanian的观点[32]， Sθ为正值表示疏水相互作用的存在。负的Sθ和Hθ总是反映范德华力或氢键的形成。Hθ≈0可能是静电力的一个线索。根据这些规律，可以推测氢键和范德华能是稳定HSA-ASP配合物结构的主要因素。

构象的调查

当激发波长和发射波长之间的波长位移(Δλ)分别稳定在60 nm和15nm时，同步荧光光谱可以给出色氨酸残基和酪氨酸残基的特征信息[25］．如图7时，色氨酸残基的同步荧光光谱出现红移(Δλ=60 nm)，表明由于ASP的结合，色氨酸残基周围的环境极性增加。24，33］．

为了确认ASP结合对HSA二级结构的具体影响，使用了圆二色(CD)光谱，该光谱已用于检测蛋白质、多肽和肽结构。CD谱在远紫外(UV)区域由酰胺基团的n→π*和π→π*跃迁主导，并受多肽骨架几何形状的影响[34，35］．HSA的CD谱在208和222 nm处有两条负谱带，反映了蛋白质高级结构中α-螺旋的特征，这两个负谱峰都参与了α-螺旋肽键的n→π*转移[34］．CD结果可用平均残余弹性(MRE)表示，单位为℃cm²d摩尔¹可得如下式6:

(6）

在哪里C_p为蛋白质的摩尔浓度，n为氨基酸残基数，l为路径长度(0.1cm)。根据208 nm处的MRE值计算游离和组合HSA的α-螺旋含量(式7)[36，37］．

(7）

在绝笔₂₀₈为208nm处观察到的MRE值，4000为208nm处β-型和随机线圈构象交叉的MRE值，33000为纯α-螺旋在208nm处的MRE值。

在没有ASP和有ASP的情况下进行CD测量(图8)．使用SELCON3软件对二级结构构件的估计列于表4．当ASP: HSA的浓度比为10:1时，α-螺旋从59.8%(游离HSA)降至54.6%。这可能是由于ASP与氨基酸残基结合，导致HSA主多肽链上的氢键网络发生变化新的氢键［38］．此外，还涉及到更详细的二级结构变化，包括规则的α-螺旋、扭曲的α-螺旋、规则的β-链、扭曲的β-链、β-转弯和无序结构表4．

表4。SELCON3测定的不同二级结构的组分^一个．

ASP与HAS之间的能量传递

根据Forester的非放射性荧光共振能量转移理论[39]，当(i)供体能产生荧光时，可以通过直接电动力学相互作用进行能量转移;(ii)供体的荧光发射光谱与受体的紫外-可见吸收光谱重叠较多;(iii)供体与受体之间的距离不超过8纳米[40］．具体可描述为(式8-10)[33，41，42］．

（8）

（9)

（10）

E为供体与受体之间的转移效率，R₀转移效率为50%时的临界距离，r为受体与供体之间的距离，K²取向空间因子，N为介质折射率，ђ为供体的荧光量子产率，J为供体发射光谱与受体吸收光谱的光谱重叠效应，FD(λ)为在λ波长范围内供体校正后的荧光强度₀λ和ε_一个(λ₀) λ处受体的消光系数₀．

ASP的吸收光谱和HSA的荧光发射光谱重叠在图9．重叠积分，J，可以通过积分光谱来计算图9根据式(10)。在目前的实验条件下，K²=2/3, N=1.336， Ã【Â】17］．最后得到这些参数的值为:J=1.976×10¹³L摩尔⁻¹厘米^－1纳米⁴，R₀=1.87 nm, E=0.016, r=3.71 nm因此ASP与供体(HSA中的色氨酸)之间的距离为3.71 nm。

分子建模

结晶学分析显示HSA结构中有585个氨基酸残基，这些残基分为三个同源a-螺旋结构域，分别为结构域I(残基1-195)、结构域II(残基196-383)和结构域III(残基384- 585)[43，44］．每个结构域包含10个螺旋，又分为反平行的六螺旋和四螺旋子结构域，分别用A和B标记[4，45］．芳香配体和杂环配体结合在IIA和IIIA子结构域的两个疏水口袋中[46］．在表3，结合位点数n接近于1，说明在一定条件下HSA分子对ASP只有一个结合位点。以往的研究[11]证明ASP结合在HSA的IIA子域，根据Sudlow的命名法，也称为Sudlow的I位点[47］．这也得到能量转移计算的支持，因为在HSA中只有一个色氨酸残基位于子域IIA [43，48］．

为了直观地呈现ASP与HSA的结合方式，分子建模方法被雇佣。在我们的工作中，选择Sybyl 8.1软件来评估最合理的交互方式。得分最高的结合位点为。为了进一步揭示结合细节，在Sybyl 8.1中使用Suflex-dock程序进行分子对接，并将最佳能量排序结果放大显示在图10，其中与ASP相邻的残基以线表示。

结果表明，ASP分子位于IIA亚结构域，与LEU219、LEU238、TRP214、ALA291和PHE223等疏水氨基酸残基相邻。这表明疏水力促成了相互作用[49］．此外，ASP与HSA残基之间存在氢键，用黄色虚线标记图10(O12的O-H-N与LYS199结合，O20的O-H-N与ARG222结合)，符合热力学分析中基于Ross和Subramanian规则提出的结合模式。

ASP与残基的原子距离在5 Å以内表5．结果表明，ASP与色氨酸(TRP214)的距离为3.65 nm, r值与能量传递计算值无显著差异，证明了分子建模结果的合理性。

表5所示。ASP的原子与残基原子之间的距离(5 Å以内)。

注意:a) ASP在HSA上的结合位点(HSA如漫画所示。ASP用球体表示，省略了氢原子。ASP原子的颜色编码如下:C白色;阿红);b) ASP邻近残基;c) 5 Å以内的残基(HSA残基以线表示，ASP残基以骨架表示，b和c中有氢原子)。

结论

本研究采用三维荧光光谱、紫外光谱、CD光谱和分子建模方法，研究了ASP与HSA的体外相互作用。为了减少内滤光效应的影响，计算中使用的所有荧光数据都进行了校正。结果表明，氢键在HSA分子的IIA子结构域(Sudlow’s site I)中起主要作用，维持了唯一一个高亲和力的结合位点。热力学参数表明，这种相互作用是一个自发的、放热的、熵驱动的过程。ASP与色氨酸残基(TRP214)的距离为3.71 nm，与分子模型计算基本吻合。通过CD谱计算了HSA的二级结构变化，包括规则α-螺旋结构、扭曲α-螺旋结构、规则β -链结构、扭曲β -链结构、β -弯结构和无序结构。此外，分子建模计算推荐的最佳得分排序结合模型在分子水平上揭示了药物-蛋白质相互作用的全景，包括结合位点、结合亲和力和空间结构的细节。所有细节与实验结果吻合良好。在荧光猝灭的测量中，内滤光片吸收会在评价结合细节时造成很大的误差。因此，本工作对了解ASP的药理作用具有重要意义。

确认

感谢湖北省自然科学基金重点项目(2013CFA015)、湖北省教育局科研基金(Q20154303)、荆初理工大学科研项目(ZR201507)、湖北省药物合成与优化重点实验室开放项目(OPP2014YB01)的资助。

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