研究与评论:Journ雷竞技苹果下载al of Chemistry
菜单e-ISSN: 2319 - 9849
e-ISSN: 2319 - 9849
Suchi Sood*和Baishnab C Tripathy
贾瓦哈拉尔·尼赫鲁大学生命科学学院，印度新德里
收到日期:20/03/2018;接受日期:27/03/2018;发表日期:09/04/2018
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小麦幼苗用红色种植光(1500 μmol m2年代1)，不同的光周期有它们的根拍摄过渡区暴露或覆盖在红光下。幼苗在2h L下生长，在两种条件下积累了相似的叶绿素和类胡萝卜素。而在根冠过渡区暴露和覆盖的幼苗中，叶绿素、类胡萝卜素和原叶绿素含量分别随着光周期的增加而减少和增加。暗期结束前切除叶片的低温77k光谱显示，暴露根冠过渡区生长的幼苗，光转化Pchlide在2h到6h之间发生蓝移，F655向F653转变。这表明在这些幼苗中存在着原层体。而在2hL条件下，根冠过渡区暴露的幼苗中不存在光系统II (PSII)和光系统I (PSI)，而根冠过渡区被覆盖的幼苗中不存在光系统I。在4hL和6hL光周期下，这些幼苗的PSI和II都有明确的定义。结果表明，红光阈值是当前抑制绿化过程的表现，随后的暗期不能恢复绿化过程。Pchlide与Chlide的相对荧光比增加以及可光转换Pchlide形式的蓝移也影响了PORA的合成和随后Pchlide-PORA的组装。
红光，光周期，光形态发生，叶绿素，原叶绿素内酯，光系统I，光系统II，荧光光谱法
光能源植物生长发育的来源和重要信号[1]。光的质量和数量影响叶绿素和类胡萝卜素含量和光合特性，最终影响植物的整体生长发育。植物倾向于调整光合机构的结构、色素组成及其对不同光质和光量的趋光性和光形态发生反应[j]。2]。
在热带地区高光强和水下低光强的不同植物生境中，光的光谱分布有很大的差异。植物的生长和发育也发生在黑暗中，被称为skotomorphogenesis。在细胞形态形成过程中，原叶绿内酯作为主要色素积累。原叶绿内酯到叶绿内酯再到叶绿素的转化需要光，这表明植物中叶绿素生物合成的光谱依赖性[3.-5]。Böddi等。[6]显示了来自不同植物物种的四种普遍形式的原叶绿素(ide)的存在:在633 nm, 645 nm, 657 nm和670 nm，它们的振动亚级分别为693 nm, 710 nm, 726 nm和740 nm。Schoefs和Bertrand [7]的研究表明，光转化Pchlide的峰值在653nm处(与前类囊体膜有关)，而不是656nm处(与原层体有关)。这些光可变形的Pchlide在饱和光的闪光下转变为叶绿素(Chlide)。这种转化涉及到各种中间体的合成。在F653 nm和656 nm处，光能转换的protoophyllide的峰值在闪光灯照射下降低，并由于Chlide: POR:NADP的作用而出现峰值+出现在690 nm处，由于Chlide:POR:NADPH，在几分之一秒内移位到694 nm。在黑暗中孵育5 s后，在676 nm处观察到一个由于游离氯化物而产生的峰值。8]。Pchlide的许多非荧光和荧光中间体在此转化过程中形成[4，9]。Franck等人。[8研究表明，在黑种小麦的黄质膜中，Pchlide与NADP相关+NADPH分别在681 nm和690 nm处达到峰值。光活性Pchlide通过不同的途径再生:1)光还原后形成非光活性Pchlide形式，在约651nm处发出荧光(Pchlide- pir - nadp)+)， 2) Chlide-light-dependent POR-NADPH三元配合物的大聚集体位错后[10]。Le lay等。[11研究表明，在黄化的大麦叶片中，200毫秒(0.2秒)的饱和闪光会诱导原叶绿素F655光转化为叶绿素，而不是叶绿素，而叶绿素不需要光。
连续红光(500 μmol m)对小麦幼苗生长的早期研究2年代1)的研究表明，当幼苗的根冠过渡区暴露在红光下时，幼苗既不变绿，也不积累任何叶绿素。这些幼苗的叶绿素合成和光系统发育受到抑制[12-14]。另一方面，根冠过渡区不受红光照射的幼苗呈现绿色，叶绿素积累较多[12-17]。在50 μmol m的蓝光照射下，上述抑制作用完全恢复2年代1远红光(200 μmol m)部分还原2年代1) ［18]。光感受器在植物绿化过程中起着至关重要的作用。这些光感受器单独或联合影响植物的整体生长发育。光敏色素和隐色素分别介导红光和蓝光介导的反应[15]。在两种情况下，光感受器的信号功能被光激活或抑制，促进信息流动[16]。在高等植物中，三种形式的光敏色素Phy A、Phy B和Phy C存在于单子叶植物中，如水稻;五种形式(Phy A至E)存在于双子叶植物中，如拟南芥[17]。与其他家族成员相比，Phy A在黄化植物中大量积累[18]。Roy等人的研究[19在红光(400 μmol m)下生长的水稻幼苗中，PhyA在茎底表现出持久性2年代1)，其根冠过渡区暴露，表明其可能在抑制绿化过程中起作用。
在早期的研究中[13，14]在500 μmol m的红光连续照射下生长2年代1）.在红光照射下，这些幼苗的根冠过渡区出现了变绿过程的抑制。因此，为了了解持续的光照是这种反应表现的先决条件，还是较短时间的某些阈值水平的红光可能导致绿化过程的抑制，本研究进行了。此外，还研究了原叶绿素内酯的积累及其转化为叶绿素内酯的过程，以了解1500 μmol m的光周期照射对叶绿素内酯的影响2年代1在暴露和覆盖根冠过渡区生长的小麦幼苗上，饱和红光(0.2秒)对叶绿素积累和Pchlide-POR复合物形成及其光转化的影响在活的有机体内．
植物材料
小麦(小麦以cv HD 2329种子为实验材料。这些种子来自新德里的印度农业研究所。
化学物质
卟啉是从洛根大学购买的。所有化学药品和溶剂均为分析级。Hepes缓冲液、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸(BCIP)、硝基蓝四唑(NBT)、碱性磷酸酶(AP)、丙烯酰胺、双丙烯酰胺购自美国Sigma Aldrich公司。
光源
植物生长的红光光源为镓铝砷化发光二极管(led)，其在光合吸收红光区输出高，最大光谱输出峰值波长为670 nm，带宽窄为26 nm。该峰值波长与植物光合作用光谱的峰值相对应。
植物生长条件
小麦(小麦在暗室中，在红光(1500 μmol m)照射下，将cv HD 2329种子在皮氏培养皿或丙烯酸培养皿中的水中萌发和生长2年代1)在不同的光周期(2h L+22h D、4h L+20h D、6h L+18h D、12h L+12h D、18h L+6h D、24h L)中，根和根冠过渡区暴露在发芽纸上(V-)或根和根冠过渡区被遮挡在蛭石(V+)上的led，持续5天。这里“L”是光照周期，“D”是暗周期，“h”是光照处理的小时数。
两种生长条件下，植物生长区内温度均未升高，水分含量保持不变。所有的测量都是在黑暗期结束前完成的。
叶绿素和类胡萝卜素含量的估算
从5 d龄的幼苗中提取3个100 mg的叶片。将叶子切成片，在绿色安全光下，用预冷的研钵和研杵在10毫升的80%丙酮冰中，在4°C下手工均质。匀浆通过8层粗棉布，在SS-34转子的sorvall离心机中10000 rpm离心10 min，取上清。用分光光度法测定叶绿素和类胡萝卜素的含量。20.]和Welburn和Lichenthaler [21]分别在UV-160A(岛津公司，日本京都)双光束分光光度计上。在663 nm、645 nm和470 nm处取吸光度。参考比色皿含有80%的丙酮。
叶片净色素含量(如原叶绿内酯)
取不同光照条件下生长5 d的幼苗叶片，在暗孵育前监测总四吡咯合成。取100 mg叶片3个重复，用10 ml 90%氨丙酮匀浆。为制备90%的氨丙酮，取1 N (7.48 ml / 100 ml蒸馏水)的氨溶液，稀释10倍。取0.1 N的氨溶液，加入丙酮，在0.1 N的氨中得到90%的丙酮。匀浆在4°C下，在SS-34转子的sorvall离心机中以10,000 rpm离心10 min。取上清液，制备正己烷提取丙酮渣(HEAR)。制备HEAR时，将样品丙酮提取液置于分离漏斗中，加入等体积的冰正己烷。这是混合适当，并允许两层分离。取下下层。在这一层中加入了1/3体积的己烷。 Again the two layers were mixed and allowed to separate. Lower layer was taken. This layer was hexane-extracted acetone-residue mixture (HEAR). Emission spectra E440 nm was recorded from 580 nm to 700 nm. Pchlide content was calculated as described in Hukmani and Tripathy [22]。
闪光照明和低温光谱
在不同的光周期制度下生长的5天老植物的叶子在黑暗期结束前被切除，立即冷冻液体氮。记录了叶片的低温发射光谱(600 nm-770 nm, 440 nm激发(E440)，狭缝宽度设置为2 nm:- (i)暗期结束前，(ii)在饱和红光闪光照射(0.2秒)后，(iii)在液体N中冷冻后闪光照射，在黑暗中孵育10分钟后2将叶子放入含有液态氮的杜瓦瓶中2．然后将杜瓦比色管放入比色管支架中。
Spectrofluoremetry
荧光光谱用SLM-8000 (SLM Instruments, Inc.)的比值模式记录。Urbana IL, USA)具有光子计数装置的荧光光谱仪。这台仪器与一台IBM微型计算机连接。罗丹明B在参考通道中用作量子计数器。在激发和发射波长分别为348 nm和422 nm时，使用四苯基丁二烯(TPD)块来调节样品和参考通道中的电压至每秒20,000次。将激发和发射带宽调整为2 nm。光子计数积分1秒。
叶片叶绿素含量
连续红光(1500 μmol m)下生长的幼苗2年代1)处理24小时，其根冠过渡区被蛭石覆盖，完全变绿，叶绿素(Chl)含量正常。然而，在相同条件下，将幼苗的根冠过渡区暴露在1500 μmol m的红光下2年代1)不是绿色的(图1)，不会累积Chl (图2一个）.覆盖根冠过渡区的小麦幼苗呈黄绿色，而暴露根冠过渡区的小麦幼苗呈黄绿色(图1，E2和D2)。然而，这些幼苗在光照2h (L)+黑暗22h (D)条件下积累的Chl (图2一个）.在4h L+20h D光周期条件下生长的幼苗开始表现出与Chl积累量相关的不同行为。覆盖根尖过渡区的幼苗在红光照射下积累的Chl几乎是覆盖根尖过渡区的幼苗2h L+22h D的幼苗的两倍。然而，在4h L+20h D下生长的幼苗(图2一个)处理下，根冠过渡区暴露在红光下，Chl积累量非常少，即2h L+22h D的幼苗积累量接近1/8。随着光照周期(即6h L+18h D、12h L+12h D、18h L+ 6h D)的进一步增加，根冠过渡区被遮挡红光的幼苗(即生长在蛭石中的幼苗)变绿，Chl含量呈线性增加(图2一个）.然而，在相同条件下生长的幼苗，其根冠过渡区暴露在红光下，没有变绿，也没有积累Chl (图2一个）.结果表明，在1500 μmol m的红光照射下，即使照射4h，也能恢复正常2年代1)足以诱导当前的光形态形成反应。这种反应在随后的20h暗期中不能逆转，因此得出临界剂量为2,160万μmol m的结论2暴露在根冠过渡区的幼苗，光照足以诱导非绿化光形态形成反应。许多研究表明光对植物叶绿素的生物合成和降解有影响[12-14]。
图1:小麦幼苗在1500 μmol / m的红光下生长2年代1)，根冠过渡区暴露(1)或覆盖(2)。(A) 2h L+22h D;(B) 4h L+20h D;(C) 6h L+18h (D) D, 12h L+12h D;(E) 18h L+6h D，其中L为亮时，D为暗时。
图2:不同光周期下在1500 μmol m-2 s-1红光下生长的植物叶绿素、类胡萝卜素和原叶绿素含量。
叶片中类胡萝卜素含量
在光照2h L+22h D条件下生长的幼苗，其根冠过渡区暴露或覆盖，积累了类似但少量的类胡萝卜素(图2 b）.根冠过渡区屏蔽红光的幼苗类胡萝卜素含量随红光光周期的增加呈线性增加，从4h L+20h D、6h L+18h D、12h L+12h D和18h L+6h D (图2 b）.暴露根冠过渡区生长的幼苗类胡萝卜素含量随红光光周期的增加而下降(图2 b）.而在1800 μmol m强光下生长的拟南芥幼苗2年代18h L+16h D光周期，类胡萝卜素含量随光强的增加而增加[23]。类胡萝卜素通常作为单线态氧的清道夫色素床对光处理的反应[24]。由于在4h L+20h D光周期下生长的幼苗中存在大量的类胡萝卜素，这些植物中Chl的不积累可能不是由于已经合成的叶绿素的氧化破坏。
叶片中净卟啉(原叶绿内酯)含量
在暗期结束前测量，在不同光周期下生长的幼苗，其根冠过渡区被红光覆盖，积累了少量的原叶绿内酯。然而，在类似条件下生长的植物，在根冠过渡区暴露于红光下，积累的Pchlide (图2 c）.原始叶黄素在黑暗中作为主要色素积累。在随后的光照下，它会转化为叶绿内酯[3.，4]。赤霉素在根冠过渡区暴露于红光下的幼苗中积累较少。这些植物的叶绿素积累很少。这表明在这些幼苗中，Pchlide合成或原叶绿磷脂还原酶的表达或Pchlide- por复合物的形成受到抑制。
原叶绿内酯氧化还原酶A
进一步了解Pchlide和POR的功能状态以及PSII、PSI、低温的组织和组装荧光记录了叶片的光谱(E440, 440 nm激发)。
原叶绿内酯的光转化在活的有机体内
连续红光(500 μmol m)下生长的幼苗2年代1)，它们的根冠过渡区暴露在外，合成了少量的Pchlide，其中大部分以不可光转化的形式积累[13，14]。因此，我们对生长在光周期条件下的植物进行了研究，使其根冠过渡区暴露或屏蔽红光，以确定Pchlide池的功能状态。在暗期结束前，从覆盖根冠过渡区并暴露在红光下的幼苗上切除叶片，记录其在77K下的荧光光谱(E440)，如材料和方法中所述。如图所示图3 b和4在2 hL+22 h D条件下，在红光下生长的根冠过渡区暴露的植物在黑暗期结束前切除的叶片，积累了大量的非光转化形式的Pchlide (E440, F632在440 nm激发，荧光在632 nm)。然而，它们也以光转化形式积累了大量的Pchlide，如在655nm处的荧光峰所示。由于Chl(ide)的作用，在676 nm处也观察到荧光峰。655 nm处峰小可能是由于Pchlide用量较少，形成少量Pchlide- por - nadph络合物[25]。Pchlide-POR-NADPH复合物的655 nm峰与原板层体有关[8]。在此光周期中，由于存在较长的黑暗期，原板层体可能在655nm处形成峰值。这些幼苗虽呈微绿，但PSII和PSI均未见峰值。在闪光灯照射下，由于光转化Pchlide，在655 nm处的峰值大幅降低，而由于Pchlide转化为Chlide，在677-680 nm处出现了一个接近最大值的宽峰，表明存在功能性原叶绿内酯还原酶(POR a) (图4）.暗孵育10 min后，观察到676 nm处的荧光峰(图4）.这可能是由于抑制PSII蛋白的合成和组装在这些幼苗中，类胡萝卜素含量高于在较大光周期下生长的幼苗。Griffiths等。[26研究表明，用60w灯照射小麦黄质膜30秒后，635 nm和652 nm的峰转变为632 nm的小峰和680 nm的强峰。632 nm峰为非光活性色素，680 nm峰为叶绿内酯。Yahuban等。[27]的研究表明，小麦幼苗中Pchlide向Chlide的转化与类胡萝卜素含量成反比。他们利用深色生长的小麦幼苗发现，在类胡萝卜素含量降低的叶片中，与正常叶片相比，每闪一次光，就有更多的原叶绿内酯分子转化为氯化物。Chlide /Pchlide比值(657)在几乎缺乏类胡萝卜素的叶片中最高，在缺乏类胡萝卜素的叶片中中等，在正常叶片中最低。27]。然而，在本研究中，Pchlide与Chlide的相对强度之比随着幼苗类胡萝卜素含量的降低而增加(图2，4，5和6）.这种减少可归因于这些幼苗中POR A的含量较低(结果未显示)。
图3:2h L+22h D光周期(A)覆盖区(B)暴露的根冠过渡区叶片低温荧光光谱(E440)。
图4:光照2h L+22h D，暴露根冠过渡区的幼苗叶片的低温荧光光谱(E440)显示出闪光引起的变化。
图5:光照6h L+18h D，暴露根尖过渡区的幼苗叶片的低温荧光光谱(E440)显示出闪光引起的变化。
图6:覆盖根冠过渡区的2h L+22h D光周期幼苗叶片的低温荧光光谱(E440)。
在1500 μmol m红光下生长的幼苗2年代1)在光周期模式下(在2h L+22h D模式下)，它们的根冠过渡区被蛭石覆盖，在632 nm处有一个小峰，在655 nm处有一个小峰，分别是由于不可光转化和不可光转化的Pchlide (图3一）.655峰可能是由低聚光可转换Pchlide引起的。利用77K荧光发射光谱对黄化豌豆匀浆进行的体外研究表明，636 nm发射的单体原叶绿内酯聚集体可转化为644 nm和655 nm发射形式的闪光光活性低聚物[28]。这些叶片在685 nm处也有一个巨大的峰，这可能归因于PSII核心复合物(D1/D2/ cytb559复合物)。696 nm处(由于CP43/CP47)和735 nm处(由于PSI)的荧光峰缺失(图3 b）.这可能是由于PSI蛋白的合成/组装受到抑制。
在4h L+20h D和6h L+18h D的光周期条件下，在631 nm、654 nm和675 nm的红光峰下，幼苗的根冠过渡区分别为不可光转化Pchlide、可光转化Pchlide和Chlide。在4h L+20h D的光周期条件下，可光变Pchlide向Chlide的光转化，导致在654 nm处的峰大幅下降，而在680 nm处的宽峰增加，而不是P695。而在光照6h L+18h D时，暴露在根冠过渡区的幼苗在677 nm处出现了Chlide峰。Amirjani等。[29]的研究表明，如果许多Pchlide分子附着在Pchlide- por复合物中，则不会发生从短波长的Pchlide向长波长的Pchlide的能量转移。然而，由于Pchlide本身较少，在本研究中形成了小的POR-Chlide-NADPH复合物，导致闪光照射后在680 nm处出现峰值，而不是695 nm。闪后暗孵育10 min后，680 nm和677 nm两个不同的峰移至675 nm (图5和7)，这是由于免费的Chlide从Chlide- por - nadp发布+复杂。655 nm处的峰重新出现，632 nm处的峰减少。这是由于Pchlide- por - nadph复合物的形成以牺牲不可光转化的Pchlide为代价。
图7:低温荧光光谱(E440)显示，幼苗生长在6h L+18h D光周期的根冠过渡区，呈现出闪光诱导的变化。
随着光周期从2h到4h到6h的增加，光转化Pchlide蓝的荧光发射峰从2h的655nm位移到4h的654nm和6h的653nm。因此，光转化Pchlide的蓝移从暗生长幼苗中的657nm到光周期生长6h幼苗中的653nm，证明了光诱导Pchlide- por复合物结构组织的变化。事实上，在16h L+8h D光周期条件下生长的绿豆叶片，由于光可转化的Pchlide，在653nm处有一个峰值。因此Pchlide-POR-NADPH的短波长形式(655、654和653 nm)可能优先与前类囊体和类囊体膜相关[12]。
PSII在687 nm和693 nm处有荧光峰，PSI在742 nm处有荧光峰(图6)，在光照周期为4h L+20h D和6h L和18h D的情况下，幼苗的根冠过渡区被覆盖，表明幼苗的两个光系统发育正常。由于叶绿素含量充足，导致PSII和PSI发育良好。
上文所述的非绿化光形态形成反应出现所需的时间[12-14]。根系过渡区暴露在红光下的幼苗，叶绿素积累和类胡萝卜素水平随光周期的增加而降低。类胡萝卜素是活性氧的清除剂。这些活性氧是在植物暴露于强光、除草剂等不同胁迫条件下形成的，导致叶绿素降解。如果暴露在根冠过渡区的幼苗发生了叶绿素降解，则活性氧会增加，导致这些幼苗的类胡萝卜素含量增加。因此，在目前的研究中，暴露在根冠过渡区(非绿叶)或被红光覆盖(绿叶)的幼苗中类似水平的类胡萝卜素表明，这些幼苗中没有发生叶绿素降解。相反，叶绿素的生物合成在某一时刻受到抑制[18]。暴露于根冠过渡区生长的植物，Pchlide的合成随光周期的增加而减少，同时POR A的有效性降低。这种POR A和Pchlide的下降在随后的长期黑暗时期无法恢复。Pchlide-POR配合物的结构组织也随光周期的增加而改变。在光照4h L+20h D和6h L+18h D的幼苗中存在P654和653形式的Pchlide，其根过渡带暴露表明存在前类囊体膜，而不是通常在黑暗生长的植物中形成的前片层体。由Roy等人提出。[19在光周期生长的这些幼苗中，Phy A可能在这种抑制绿化过程的表现中起作用。早期[13，14]，目前的研究表明，它不是连续的红光照明，而是一个红光阈值(2,160万μmol m)2)，这是显示目前对绿化过程的抑制所必需的。随后的黑暗期并不能恢复绿化过程。Pchlide与Chlide的相对荧光比增加以及光转换Pchlide形式的蓝移也影响了PORA的合成和随后Phlide-PORA的组装。
POR A抗体由WT Griffiths博士提供。这项工作得到了印度政府科学和技术部竞争性赠款的支持(DST/SP/SO/ a -49/95)。
