研究与评论:生物学研究雷竞技苹果下载杂志
菜单ISSN: 2322 - 0066
ISSN: 2322 - 0066
1Instituto de Investigação e Inovação em Saúde (i3S)，波尔图大学，葡萄牙
2INEB -国立恩根哈里亚研究所Biomédica，波尔图大学，葡萄牙
收到日期:16/11/2016接受日期:02/03/2016发表日期:09/03/2016
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健康的内皮在控制血液流动性、血小板聚集和血管张力方面起着重要作用。一些疾病中存在的一些危险因素可促进内皮功能障碍，其特征是生物利用度降低和血管扩张剂作用受损，其结果不仅是内皮功能障碍，而且内皮细胞也会失去完整性，进展到衰老，并脱离到循环中。修复机制是由循环内皮祖细胞(EPCs)从骨髓招募促进。循环内皮细胞(CEC)可能是血管损伤的指标，而循环内皮细胞(EPCs)可能是血管修复的生物标志物。实际上，人们可以使用多种程序来帮助分离和量化内皮祖细胞。本文综述了内皮祖细胞在修复过程的各个阶段所起的作用，重点介绍了目前鉴定或量化内皮谱系的方法
内皮，内皮祖细胞，再生能力，流式细胞术技术。
的内皮内皮细胞单层在机械上和代谢上处于战略性位置，排列在血管床的管腔内，并将血管壁与循环和血液成分分开[1］．健康的内皮在控制血液流动性、血小板聚集和血管张力方面起主要作用，在调节免疫、炎症和疾病方面起主要作用血管生成是重要的代谢和内分泌器官。该器官重约1公斤，由1 -6x 1013个细胞组成。内皮细胞通过合成和释放放松和收缩因子，如一氧化氮(NO)，花生四烯酸代谢物，通过环氧合酶、脂氧合酶和细胞色素P450途径，各种肽(内皮素、尿紧张素、钠尿肽C型、肾上腺髓质素等)，血管紧张素、前列腺素、活性氧(ROS)等，控制血管张力，从而控制血液流动。通常情况下，这些因素以协调的方式起作用，使血管扩张剂和血管收缩剂的影响在局部得到平衡，并调节血管张力的阻力以维持稳定的组织灌注[2］．此外，这些介质对其他内皮功能也有影响，如调节细胞与细胞的粘附，血栓形成和纤维蛋白溶解。
内皮功能障碍与循环内皮细胞(CECs)
内皮功能障碍也被一些作者称为内皮激活，它代表了从静态表型向涉及宿主防御反应的表型的转换[3.］．一般而言，心血管危险因素可促进内皮功能障碍，其特征是内皮源性放松因子(如NO、前列环素或内皮源性超极化因子)的生物利用度降低和血管扩张剂作用受损[2］．此外，还能增加强效血管收缩剂和促炎肽内皮素(ET-1)的生成和生物活性。NO的减少是这一过程中的一个重要因素，其原因是eNOS活性的降低(由于内源性或外源性抑制剂)和NO生物利用度的降低[4］．这导致ROS生成增加(在超氧化物歧化酶存在的情况下)，导致生成过氧化氢它们可以在细胞内迅速扩散，并与蛋白质中的半胱氨酸基团发生反应，从而改变蛋白质的功能。此外，过氧化氢导致eNOS辅因子BH4的降解，导致eNOS的“解耦”，并导致超氧化物的形成。低浓度时产生的ROS可以作为信号分子参与调节基本的细胞活动，如细胞生长和细胞适应反应，而在较高浓度时产生的结果则截然不同，如转录因子的磷酸化、核染色质重塑和诱导转录基因与蛋白酶活化[5］．在某些情况下，当长期反复暴露于心血管危险因素时，ROS的慢性产生可能超过细胞酶抗氧化剂和非酶抗氧化剂的能力，其结果不仅是内皮功能失调，而且内皮细胞也会失去完整性，进展到衰老，并脱离循环[3.］．因此，循环内皮细胞(CECs)的数量可以反映内皮功能障碍的状态。循环内皮细胞被认为是多种血管疾病中内皮损伤的潜在标志物。许多抗原已被用于识别内皮细胞来源的细胞，如mucc -18 (CD146)、血栓调节蛋白(CD141)、ve -钙粘蛋白(CD 144)、血管细胞粘附分子1 (CD106)、内皮素(CD105)、e-选择素(CD62e)、细胞间粘附分子1 (CD54)和血小板内皮细胞粘附分子-1 (CD31) [6］．根据一些作者的研究，CECs具有CD34标记物的高表达[7］．此外，成熟的内皮细胞可能表达内皮特异性标记物，包括血管内皮生长因子2型受体(VEGFR-2)，也被命名为CD309，但它们在开始衰老过程时失去了这一标记物[8］．另一方面，这些细胞有负表达白细胞共同抗原(CD45)及突起蛋白1 (CD133) [9］．然而，内皮细胞的完整性不仅取决于损伤的程度，还取决于内源性的修复能力。随着时间的推移，已经确定了两种修复机制。一种是通过邻近的成熟内皮细胞进行局部复制，并替代丢失和受损的细胞，另一种是从骨髓中招募循环内皮祖细胞(CEPCs)进行修复。这些细胞一旦进入循环，就会分化成具有内皮特性的成熟细胞[10］．
定义、表征和鉴别
内皮祖细胞(EPCs)是小的、未成熟的前体细胞和骨髓来源的细胞，可在外周血和脐带血中找到[11］．它们在正常外周血中极为罕见，只占外周血单个核细胞的0.01%至0.0001% [12］．这些细胞是Asahara等人在1997年首次从成人外周血(PB)中分离出来的，基于细胞表面的蛋白质(也称为表面标记);在这种情况下，他们基于造血祖细胞抗原标记物(CD34)的表达[13］．有了这一发现，中胚层细胞向血管母细胞分化以及随后的内皮细胞分化只发生在胚胎发育过程的教条被推翻了，因为来自成人的EPCs可以在体外分化为内皮表型[14］．除了上述标志物外，EPCs表面还表达多种内皮标志物，如VE-cadherin (CD144)、血小板内皮细胞粘附分子-1 (CD31)、内皮NO合成酶、e-选择素(CD62E)、血管性血友病因子(CD41)等，表达突出蛋白1 (CD133)等干细胞标志物，也表达造血系统c-kit (CD117)、白细胞共同抗原(CD45)等表面标志物[11，15］．然而，没有发现特异性的EPCs标记物。此外，上述表面标记依赖于EPCs的状态和定位，因为早期EPCs中呈现的表面标记与成熟EPCs中表达的表面标记不同。早期EPCs中存在的表面标志物主要是CD133, CD34和VEGFR-2，也称为激酶插入结构域受体(KDR)或CD309。在成人的外周循环中，发现更成熟的EPCs明显失去CD133，但CD34和VEGFR-2呈阳性[16］．因此，CD133的缺失似乎反映了循环内皮祖细胞向更成熟的内皮样细胞的转变。然而，目前尚不清楚EPCs在哪个时间点开始失去CD133，无论是在它们从骨髓进入体循环的过程中，还是在它们动员的过程中。这表明在外周血中发现了两种类型的EPCs，并且这些细胞在循环中改变了它们的祖细胞特性[14］．在本综述中将详细讨论这两种类型的内皮祖细胞(早期和晚期)。
作为对内源性或外源性信号的响应，EPCs从骨髓和家被动员到外周组织部位，参与内皮细胞的修复。这些细胞通过其形成EC菌落的功能能力和剪切应力暴露后eNOS表达的增强来识别[17］．因此，EPCs在维持血管完整性方面具有关键作用，并参与伤口愈合、缺血时组织再生、组织重塑、肿瘤生长和生理等过程新血管形成［18］．
新生血管是决定心血管系统形成和维持的重要机制。它被认为主要依赖于两个过程，血管生成和血管生成[19，20.］．血管新生是指血管内皮细胞通过活化、增殖和迁移，在原有血管的基础上形成新血管的过程。血管发生被定义为在没有原有血管的情况下，通过血管内皮生长因子受体2阳性(VEGFR-2+)中胚层前体迁移分化为粘附形成初级血管丛的内皮细胞而产生新血管的过程胚胎发育［21］．
长期以来，人们一直认为血管生成仅限于早期胚胎发生，并且不发生在成人中，而血管生成发生在发育中的胚胎和出生后的生活中。然而，越来越多的证据表明，EPCs已在成人外周血中被发现，并在血管网络的稳态中发挥重要作用。[15］．负责形成原始血管结构的ECs从发病机制在胚胎中，以及在成人骨髓中的EPCs、中血管母细胞和多能成人祖细胞中[22］．
因此，EPCs可能不仅参与缺血组织中新血管的形成，而且可能有助于原有血管的修复。这些细胞可通过释放旁分泌因子影响血管生成，或分化成成熟的内皮细胞并整合到血管腔内[21］．因此，EPCs可能是新的治疗方法的有趣候选者，如损伤血管壁的修复，缺血组织的新生血管或再生，以及血管移植物的涂层[23］．
各种研究表明，EPCs在几种疾病的动物和人类模型严重缺血后改善新生血管。根据Kawamoto的研究，体外扩增的人EPCs合并到心肌新生血管的病灶中，对大鼠左心室功能的保存有良好的影响[24]， Fan等证实兔自体扩张EPC移植可促进缺血后肢新生血管[25］．除了这些研究外，一些作者在小鼠模型中证明了EPCs对缺血性脑损伤的作用，并得出结论，系统给药EPCs可保护大脑免受缺血性损伤，促进神经血管修复，并改善长期的神经行为结局[26］．相对于糖尿病疾病，既往报道显示EPCs对实验性糖尿病动物模型创面修复的有效性[27］．此外，根据Kirana等人的研究，EPCs移植可以改善微循环移植组的伤口完全愈合[28］．
综上所述，EPCs是一种非常有前途的缺血组织修复的新治疗选择。因此，需要进一步研究优化缺血组织移植后EPC分离、扩张、动员、招募和生存策略的技术，以继续推进这种新型治疗方式[29］．
过去，损伤内皮细胞的再生被认为是由于邻近内皮细胞的迁移和增殖。最近的研究表明，可能存在额外的修复机制来替代剥皮或损伤的动脉，而内皮祖细胞参与了这一过程[14］．EPCs从骨髓动员并在外周循环中循环到缺血组织和肿瘤的过程包括招募、动员、分化、归巢和再生潜能几个步骤[16］．
招聘
内皮祖细胞的招募和合并需要一个被称为化学吸引的多步黏附和旁分泌信号的协调序列，这对于将合理数量的祖细胞招募到缺血或损伤组织至关重要[30.］．由缺血组织和肿瘤细胞产生的旁分泌信号(生长因子或细胞因子)包括血管内皮生长因子(VEGF)和基质细胞衍生因子(SDF-1)的产生。然而，诱导祖细胞从骨髓中动员的其他因素，如粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)、促红细胞生成素(EPO)和趋化因子如SDF-1也增加了EPCs的水平[31］．
动员与差异化
生理上，缺氧引起的缺血被认为是诱导骨髓内皮祖细胞动员的主要信号，因为在肿瘤和缺血组织中，缺氧介导缺氧诱导因子基因(HIF-1)的激活[32］．该基因是一种异二聚体转录因子，由一个β亚基和一个氧调节的α亚基组成。HIF-1α和HIF- 1β蛋白都含有基本的螺旋-环-螺旋基序，结合DNA并引起亚单位二聚。该基因在缺氧条件下被激活，可与酶和其他转录因子相互作用，以控制血管化和组织生长。因此，HIF-1的激活促进了一种强效血管生成因子(称为VEGF)的合成增加，VEGF是血管生成的主要调节因子，促进内皮细胞向缺氧区域迁移。这种情况的发生，是因为在缺氧期间，HIF-1结合VEGF基因的调控区域，诱导其转录并启动其表达[33］．而VEGF的表达又会促进骨髓基质金属蛋白酶-9 (MMP-9)的活化，从而裂解膜结合kit配体(mKitL)，并诱导可溶性kit配体(KitL，也称为干细胞因子，SCF)的释放。随后，ckit阳性的干细胞和祖细胞，包括常见的造血和成血管细胞前体细胞(Hemangioblast, HABL)，移动到骨髓微环境的血管区。这种易位使细胞从静止状态变为增殖状态。启动成血管细胞转向造血前体细胞或内皮祖细胞的信号在很大程度上是未知的，但可能包括来自外周的血管生成生长因子，如VEGF和SDF-1 [16］．然而，一项研究表明凝血酶也促进EPC分化，凝血酶对EPCs的影响是通过凝血酶受体PAR-1介导的[34］．然而，需要进一步的研究来阐明转录因子和其他信号分子在EPC分化过程中的协调相互作用[14］．
分化后，未成熟的EPCs呈纺锤形，增殖潜力有限[35］．这些细胞可通过CD133、CD34、CD31、CD45、vWF、VE-cadherin标记物的表达来表征[16］．
内皮祖细胞的归巢和再生潜能
已知内皮祖细胞分化后离开骨髓，通过体循环进入缺血组织，与受损内皮细胞接触，这一过程被称为归巢。雷竞技网页版人们认为，骨髓中EPCs的动员是由整合素介导的。这类蛋白质负责细胞组织结构，并作为调节生存、增殖、分化和迁移信号通路的信号转导器[21］．调控来自骨髓微环境的EPCs动员的主要整合素是α4整合素，即α4β1和α4β7。α4β1整合素介导细胞粘附到血管细胞粘附分子-1 (VCAM-1)， α4β7整合素在淋巴细胞归巢中很重要，它也结合到VCAM-1 [36］．这些数据表明，EPC动员是一个活跃的过程，涉及到在归巢组织上表达的分子靶点与粘附分子(即EPCs表达的整合素)之间的直接相互作用。循环的EPCs在归巢过程中，从未成熟的EPCs分化为成熟的EPCs, CD133表达丢失。成熟的EPCs除了表达CD34、CD31、CD45、VE-cadherin、vWF标记外，还开始表达CD309，外观呈鹅卵石状[35］．
祖细胞归巢到缺血组织的下一步包括这些细胞与细胞因子激活的内皮细胞的粘附，以及祖细胞通过内皮细胞单层的转运。已知包括造血干细胞和白细胞在内的各种细胞与内皮细胞的粘附也是由整合素介导的[10］．能够介导细胞-细胞相互作用的整合素是β2-整合素和α4β1-整合素。后者在包括内皮细胞和造血细胞在内的多种细胞类型中表达，而β2-整合素则优先在造血细胞中发现。β2-整合素不仅介导EPCs与成熟内皮细胞和细胞外基质蛋白的粘附相互作用，而且在趋化因子诱导的EPCs跨内皮细胞迁移中起关键作用。在牢固粘接过程中白细胞β2整合素家族成员与内皮对抗配体相互作用，如ICAM-1, VCAM-1和表面关联纤维蛋白原[36］．后附着力并插入到周围成熟血管内皮细胞的单层中，这一过程可能完成，损伤的单层得到修复[16］．
1997年，Asahara等人用CD34抗体包被磁珠从人外周血中分离出CD34+单核血细胞[13］．自从EPCs的发现以来，人们已经迈出了重要的一步，以达到更好的定义和这些细胞的详细功能描述。然而，由于缺乏明确和一致的EPCs定义，一些研究的结果和成功受到了限制[37］．实际上，人们可以使用多种方法来帮助EPCs的分离和量化，但这些方法可以简化为两种方法:体外粘附和生长以及使用荧光标记抗体或细胞表面表型选择流式细胞术［38］．值得注意的是，目前所有分离、鉴定或量化循环细胞内皮谱系潜能的方法都存在局限性，因为没有一种方法被证明能够可靠地预测相关体内循环细胞的行为[37］．
EPC的体外培养
大多数培养试验用于从外周血中获得循环内皮祖细胞血用于鉴定EPCs作为心血管疾病的生物标志物，用于分析细胞内信号通路，或用于富集用于治疗性血管生成的细胞[37］．分离出外周血单个核细胞后，将细胞置于含有特定生长因子(如VEGF、牛脑提取物和表皮生长因子)的培养基中培养，促进内皮样细胞的生长。在体外培养与生长因子的混合物，粘附特定底物(如。纤维连接蛋白)，在体内与细胞外基质或周围成熟雷竞技网页版ECs的接触可能会影响骨髓源性EPCs的增殖或分化[39］．绝大多数研究使用以下三种培养基之一:Medium 199 (Gibco, Carlsbad, California, USA)已用于克隆形成单位(CFU)的培养，仅使用胎牛血清，内皮生长培养基(EGM;Clonetics，圣地亚哥，加利福尼亚州，美国)补充牛脑提取物和人表皮生长因子，以及EGM-2 (Clonetics，圣地亚哥，加利福尼亚州，美国)，其中含有确定浓度的VEGF-2，人成纤维细胞生长因子2，人表皮生长因子，胰岛素样生长因子1，抗坏血酸，肝素和氢化可的松。除了不同的培养基外，细胞培养皿也使用了不同的细胞外基质蛋白，这些细胞培养皿被胶原蛋白、纤维连接蛋白或明胶包裹，这也可能影响结果[23］．鉴于此，随着时间的推移，体外培养EPCs的方法主要有三种。
由于增殖能力可能是定义祖细胞的一个标准，几个小组建立了集落测定[37］．最突出的试验，称为集落形成单位希尔细胞(CFU-Hill)的培养，细胞被镀，4-9天后，非粘附的外周血单个核细胞产生集落。在这种方法中，PBMC部分的所有细胞群一起培养，这意味着与成熟的循环内皮细胞和单核细胞污染的风险。为了尽量减少污染，一些作者采用了预镀步骤，根据成熟内皮细胞应粘附在培养表面的原则，将非粘附细胞去除[38］．
另一种方法是循环血管生成细胞(CAC)，由贴壁单个核细胞培养4-7天组成。在这种情况下，不会发生菌落形成。最后，另一种常用的方法被称为内皮集落形成细胞(ECFC)，其中单个核细胞被镀，非粘附细胞被丢弃。其余的细胞，即贴壁细胞，在内皮条件下培养7-21天，之后出现鹅卵石形态的菌落。该方法具有较高的增殖能力。CFU-Hill和CAC方法表现出较早的生长，而ECFC方法表现出较晚的生长[38］．体外培养EPCs的技术不断改进，但污染的风险一直很高，而且有研究表明，培养方法定量的EPCs频率与流式细胞术定量的EPCs数量并不相关[39］．
流式细胞仪鉴定EPCs
流式细胞术是一种同时测量单个细胞的多种物理特性的技术，当细胞悬浮在测量装置中流动时[40］．该技术允许测量单细胞液体悬浮液中的细胞(原核和真核)或颗粒(细胞因子、染色体和珠)。
流式细胞仪是一个由五个部分组成的系统:光源(汞灯或激光)、流室、用于选择特定波长范围的光学滤光器单元、光谱范围更广的光敏二极管或光电倍增管，用于敏感检测和感兴趣的信号处理，以及处理收集到的数据的单元。在最常见的情况下，一个或多个激光穿过每个粒子或细胞，并记录光散射特性，即侧散射(颗粒复杂性的指标)和前散射(颗粒大小的指标)[31］．当激光照射细胞时，光线在细胞边缘周围发生衍射，沿着激光束的路径产生衍射图案。这种散射光(前向散射和侧向散射)大约相当于细胞的周长，与激发激光的波长相同。悬浮液中的样品细胞可以用与荧光色素相连的特异性抗体进行标记，这使得基于荧光的细胞具有特定特征的识别和量化成为可能[41］．荧光色素被较短波长的光激发时会发光，并可直接与一抗或二抗或链霉亲和素偶联。
这种技术有几个优点，因为它允许在大量细胞和短时间内进行多参数分析，允许在异质群体中识别同质群体。此外，还允许检测极其罕见的事件群体(频率小于10-6)，如干细胞，树突细胞、内皮细胞，以及其他[40］．流式细胞术是目前获得假定EPCs纯定量数据的最佳方法。当外周血EPC计数被认为是一种疾病生物标志物时，其敏感性、特异性和可重复性应被视为金标准[37］．此外，它是一种快速方便的测量罕见事件的方法，因此，该方法显然非常适合于EPCs的检测和定量。
然而，由于缺乏用于此任务的合理特异性单克隆抗体，细胞分析的发展受到了限制[12］．然而，已经提出了几种方法来鉴定EPCs，但通过细胞表面抗原表达并没有一个一致的定义。此外，根据蒙德的说法，一些发表的声称量化EPCs的临床试验实际上是量化的造血干细胞，因为他们没有使用足够的表面标记[41］．Delorme等人在脐带血和外周血样本中，主要基于表面标记CD146(存在于内皮细胞中的粘附分子)来区分CECs和EPCs。根据这些作者的研究，他们使用四色流式细胞仪分析，在心肌梗死患者采集的外周血样本中区分出EPCs (CD146+ CD34+ CD45+CD133+或CD117+)和CECs (CD146+ CD34+ CD45- CD133-或CD117-)。通过四次彩色细胞仪分析，作者根据CD45的表达，得到了CD34+细胞的两个不同亚群，分别是CD34+CD45+细胞，占循环CD34+细胞的90%以上，CD34+CD45-细胞，占CD34+细胞的不到3%。对这两个亚群分别进行CD146、CD117和CD133的共表达分析，在CD34+CD45+中，低比例的细胞共表达相关表面标志物，作者将该亚群定义为EPCs。反过来，CD34+CD45-亚群中，CD146共表达比例较高，但CD117和CD133不共表达。这个亚群体定义了成熟的CECs。根据这些作者的观点，对脐带血和外周血中选择的CD34+细胞进行4色细胞术分析，可以清楚地区分两个循环CD146+细胞亚群[42］．另一方面，Khan等人在他们的综述中假设CD31和CD146存在于CECs上，但不存在于EPCs或造血干细胞上，此外还假设CD133将有助于识别EPCs，因为它不存在于CECs或任何成熟内皮细胞上。然而，CD133提供了一种在不使用CD34的情况下检测循环中的原始干细胞的方法。此外，根据这些作者的说法，CD34+CD309+组合是一种潜在的EPCs表面标记组合。关于这些细胞的CD45表达，由于其在这些细胞中的Dim表达(与阴性对照相比略有增加)，在不同组中均有报道为阳性或阴性[12］．一些研究表明，特别是CD45-细胞的部分可能藏有“真正的”循环EPCs。为了证明这一点，Schmidt-Lucke等作者通过冠状动脉疾病(CAD)患者样本，在流式细胞术分析中考虑CD45-和CD45dim的表达，并在使用CD45、CD34和CD309表面标记物和门控策略进行定量时，将CD34+细胞细分为CD45-、CD45dim和CD45bright。通过该方案获得的数据显示，与CAD患者相比，健康对照组的cd45dimd34 +CD309+细胞数量显著增加，根据作者的说法，该研究证实，确实只有CD45dim细胞的一部分含有“真正的”循环EPCs [43］．另一种CD45表达的平行分析也被提出用于区分EPCs，大多数(90%)CD34+祖细胞低强度表达CD45 (CD45dim)，而不到10%的CD45- [44］．尽管存在争议，Hristov等人用三色流式细胞仪检测稳定型冠状动脉疾病患者外周静脉血中的EPCs，采用CD34+CD309+CD45-/low组合。因此，在流式细胞仪分析中，循环EPCs的百分比非常低，为了改善这一点，作者推荐了额外的策略，以提高方法的灵敏度和准确性。其中包括使用特定的高质量单克隆抗体、选择高强度荧光染料以显示低密度标记、自动补偿、排除死亡细胞和多参数门控[16］．
在另一项研究中，Torres等人对静脉血栓栓塞和骨髓增生性肿瘤患者的EPCs和CECs进行了定量。采用CD45- cd146 +CD133-和CD45+低cd146 +CD133+免疫分型法分别定量外周血标本中的CECs和EPCs。我们选择的策略是使用CD146来识别CEC，同时也通过识别EPC和CD133来区分CEC和EPC，因为CEC中没有CD133。本研究结果表明，与对照组相比，两组患者的CEC数量显著增加，而EPC数量(两组患者)相对于对照组下降，尽管差异不具有静态显著性[45］．反过来，Rustemeyer等人通过脐带血、骨髓和全血样本，选择了CD309+CD34+细胞，因为EPCs应该包含在这个部分。此外，为了从血管壁上排除大部分粉碎细胞，他们测量了CD133+CD34+细胞的数量。该部分显示CD309+CD34+细胞多于CD133+CD34+ [46］．另一方面，CD133比CD34在更多的未成熟细胞上表达，因此，在循环稳态条件下，CD133+CD309+细胞比CD34+CD309+细胞更罕见[37］．一些作者，如Distler等人认为EPCs的鉴定需要多色方法，即使用荧光染料标记的几种表面标记。他们还建议使用CD34、CD133和CD309来增加分析的特异性[22］．此外，Mund等人假设在几项EPCs鉴定的研究中，可能会发生假阳性事件和非特异性荧光事件读数的污染。特别是单核细胞、红细胞和死亡细胞自身荧光和非特异性结合抗体。在他的研究中，在外周血样本和脐带血样本中，通过CD34、CD31和CD146的不同表达来确定含有内皮集落形成细胞(ecfc)和成熟循环内皮细胞的细胞群，而不是CD133和CD45。结果表明，如果不排除红细胞、单核细胞和死亡/凋亡(LIVE/ dead)细胞，可能会导致假阳性事件的发生[41］．在综述中，Fadini等人基于EPCs的定义，建议最低抗原谱应包括至少1个干性/不成熟标记物(通常是CD34和/或CD133)，加上至少1个内皮粘附标记物(通常是CD309) [44］．
尽管存在争议，但一些作者在流式细胞仪的质量问题上达成了一致，例如，使用阻断血清抑制非特异性结合，使用实时活力染色，建立转储通道排除不感兴趣的分析细胞，收集大量事件以确定足够数量的罕见事件群体，并在数据采集前清洗流式细胞仪，去除大量有可能污染样本的细胞碎片。在CEC和EPC分析中，至少应收集50万至100万的列表模式事件[12］．此外，建议设置和监测荧光探测器的灵敏度和使用多色方法，因为没有标记物是完全特定于这些细胞的[23］．
综上所述，与体外培养检测相比，流式细胞术是一项最新的技术，可以定量、更灵敏、快速和准确地分析，方便对罕见事件进行分析。此外，该技术避免了在体外检测中发生污染的高风险[16］．
EPCs强烈参与创面愈合、缺血组织再生、组织重塑和生理性新生血管形成，而新生血管形成主要依赖于血管生成和血管生成两个过程。在这些情况下，EPCs从骨髓募集到外周循环。一旦进入循环，这些细胞可以分化成具有内皮特征的成熟细胞，并返回缺血组织，启动修复过程。从一个治疗这些功能活动对于损伤血管壁的修复、缺血组织的新生血管或再生等新的治疗方法具有重要意义。EPC募集、动员、分化和归巢的机制是多种趋化因子和细胞因子以及一些生理和病理条件的调节。考虑到这些细胞的潜力及其在血液循环中的稀有性质，对其快速、敏感和准确的鉴定和定量的更合适的方法的知识是重要的。流式细胞术是目前获得假定EPCs纯定量数据的最佳方法。
本文综述了近年来内皮祖细胞的研究进展，如内皮祖细胞在修复过程的各个阶段所起的作用，重点介绍了目前内皮祖细胞谱系鉴定或定量的方法。
