早期检测肝细胞癌的临床和基因组策略:一项系统综述

Esraa M. Hashem¹，麦·s·马布鲁克^1＊艾曼·m·埃尔戴布²

生物医学工程埃及米苏尔科技大学(MUST大学)系，10月6日
系统和生物医学工程，埃及吉萨开罗大学工程学院

通讯作者:Mai S. Mabrouk，电子邮件:(电子邮件保护)

摘要

肝细胞癌是最常见的致命肿瘤之一，通常在晚期诊断，此时有效治疗非常困难。在疾病发展到晚期之前发现它是具有挑战性的。肝细胞癌是发展中国家发病率最高的癌症类型之一。肝细胞癌有许多临床和病理分期系统，但没有一种将生物学参数作为预后的预测指标。各种临床表现通常与诊断时的肝储备程度有关，到目前为止，还没有研究最终证明筛查肝细胞癌可以降低死亡率。全基因组分析方法的发展开辟了同时识别遗传或表观遗传改变以及影响癌细胞基因组的基因表达的多种变化的可能性。这项工作提出的主要问题是确定哪些替代方法可以被解释为可靠的生物标志物，以提供关于癌变过程的信息，而不是使用筛查方法来检测肝细胞癌。这个系统的回顾打开了一扇门生物信息学发现新的癌症生物标志物，有助于肝细胞癌的早期诊断。确定非侵入性和成本效益高的生物标志物，以早期发现和个性化治疗HCC将是最有前途的生物标志物研究领域之一。找到一种有效、可靠的HCC早期诊断工具，增加适合治疗的患者数量，将对改善HCC患者的预后起关键作用。传统的识别基因组变异的方法存在一些固有的缺点，下一代DNA测序有望彻底改变癌症研究、诊断和治疗。

关键字

肝细胞癌生物标志物，筛选方法，生物信息学，下一代DNA序列。

介绍

肝癌是一种始于肝脏细胞的癌症。肝癌是指肝内或肝上的恶性肿瘤。肝细胞癌(HCC)是最常见的肝癌形式，始于主要类型的肝细胞(肝细胞)。肝细胞癌是世界上第四大常见癌症，每年约有25万人死于肝细胞癌[1］．当患者出现肿瘤相关症状时，其生存率极低[2］．肝癌自然史的理解受到肿瘤的变异性的阻碍，肿瘤的变异性受同一患者中多种因素同时出现的影响，以及肝脏中可能发展为肝细胞癌的多个不同细胞系的存在[3.］．

在过去的几十年里，HCC的表现有了显著的发展。而在过去，HCC通常表现为侵袭期，伴有右上象限疼痛、体重减轻和肝脏失代偿体征。现在，由于对已知肝硬化患者进行常规筛查，使用血清甲胎蛋白和横断面成像研究测量，HCC可以在更早的阶段被识别出来，这将在后面讨论。癌症是由细胞中积累的遗传变异引起的。为了了解肿瘤转移的分子机制，有必要鉴定在肿瘤进展过程中发生突变的基因。大多数癌症都是通过导致死亡的基因突变的积累进行的，这也适用于HCC。

肝细胞癌的病因学

在埃及，HCC是最致命的癌症类型之一。它是男性第二大常见恶性肿瘤，女性第五大恶性肿瘤。ncbi。edu.eg)。图1显示了阿拉伯世界肝癌的估计百分比。结果表明:在埃及，肝癌发病率较高，男性居多。

肝细胞癌发展的主要原因是乙型和丙型肝炎病毒感染、黄曲霉毒素B1和酒精，这是慢性肝病最常见的潜在原因，可导致肝硬化和慢性肝炎[4］．肝硬化是HCC最重要的诱发因素，如图2所示。人类HBV基因组不含致癌基因，可能是通过HBV相关基因产物对细胞因子基因的转激活或反式抑制来影响肝癌的发生。HCV是一种单链正链RNA病毒。这些危险因素可引起DNA序列的损伤和突变，如黄曲霉毒素引起的p53突变和HBV基因组侵入引起的DNA损伤[5］．丙肝病毒感染每年影响340万人，约1.7亿人慢性感染丙肝病毒[6］．初次发现肝癌时的肿瘤大小并不能预测所有病例的病程。事实上，小型HCC体积翻倍的中位时间为1 ~ 20个月[7］．肿瘤血管的检测和表征在HCC的诊断、治疗方法的选择和治疗反应的评估等方面非常重要。

关于HCC的一个主要问题是筛查HCC是否能提高患者的生存率。对于HCC高危患者，早期发现非常重要。对于HCC，许多研究受到前置期偏倚的限制。迄今为止，尚未积累实质性证据表明监测高危患者可提高生存效益。有一些常用的诊断工具来提高患者的生存率:血清肿瘤标志物甲胎蛋白(AFP)、放射成像、肝活检和生物标志物。

本系统综述的主要目的是解释临床上用于检测HCC的常用方法(侵入性和非侵入性)及其局限性。它为读者提供了分子细胞遗传学的贡献，即评估染色体重排影响肿瘤的分子生物学和临床反应的生物标记物。它为下一代序列(NGS)技术打开了大门。它通过促进以单碱基分辨率对癌症的表观遗传和遗传改变进行整合和有效的检测，从而有助于早期发现HCC，从而保证了对肿瘤基因组学的全球视野。

癌症生物标记物

人类完整基因组的可获取性为了解许多疾病打开了大门。最近在蛋白质组学和功能基因组学方面的技术进步促进了人们对识别复杂疾病(如通常导致死亡的肝癌)的生物标志物的兴趣。生物信息学在科学界引起了极大的兴趣，因为它比传统的实验室实验花费更少，而且能够更快地推动科学研究的发展[8］．一个生物标志物可能是肿瘤分泌的分子，也可能是身体对癌症的特定反应。这些标志物不仅有助于预测癌症的预后，还可能有助于确定适当的治疗方法，并可能代表新的潜在治疗干预靶点。近年来，关于癌症生物标志物的知识大大增加，通过提高检测效率和治疗效果，为改善癌症患者的管理提供了巨大的机会[9］．

目前在临床上确诊的大多数HCC患者通常处于疾病的晚期，预后结果非常差。为此，使用肿瘤标志物进行早期检测对于降低这种疾病的死亡率至关重要。目前已知的最广泛用于肝癌或HCC的癌症生物标志物是:AFP, AFLP (Lens culinaris - AFLP的衍生物)，羧凝血酶原(DCP)，高尔基蛋白73 (GP73)和Glypican-3 (GPC3) [10] [11］．基因表达微阵列、蛋白质组学和基因组学的最新发展允许同时筛选数千个基因和蛋白质。此外，新的生物标志物预计将在未来几年出现，用于筛查包括HCC在内的许多癌症。

人类癌症主要是由基因组改变引起的遗传疾病:DNA序列改变、染色体重排、拷贝数畸变和表观遗传修饰(DNA甲基化)。它们共同推动恶性转化的发展和进展[12］．

如图3所示，生物信息学在预测新的癌症生物标志物方面的作用也将增加，并在疾病早期诊断中变得越来越重要。许多生物信息学方法正在分析两个主要目标的数据:发现用于设计治疗干预的分子靶点和识别用于癌症早期诊断的可靠的癌症生物标志物。生物信息学的分析主要集中在分子生物学中可用的三种类型的大型数据集:基因组序列、分子结构和基因表达数据。

HCC的临床检测方法有侵入性和非侵入性两种，这些方法被认为是筛查肝癌的旧技术。HCC患者的长期生存率较差。部分原因是HCC的复发。通常HCC诊断在晚期，因此;其挑战在于早期发现肝癌。根据目前的研究，大多数HCC患者的发病是由于遗传异常的积累，有方法学家发现HCC生物标志物[8]，这将在后面的章节中讨论。

HCC的临床检测方法

侵入性方法

肝活检:被认为是一种用于组织学评分的有创方法，仍被用作纤维化分期的参考试验。肝活检程序是拿一小块肝组织在显微镜下检查损伤或疾病的迹象。有三种类型的肝活检是:经静脉，腹腔镜和经皮活检。经皮活检被认为是最常见的肝活检类型，如图4所示。活检是评估和管理肝病患者的基石，并被认为是临床医生诊断设备的关键要素[13］．不幸的是，肝活检是侵入性的，昂贵的，严重的副作用导致死亡可能(内出血)，并不是所有的患者都适合。

非侵入性方法和诊断性能

由于患有慢性肝炎或肝硬化的患者可能在多年后才会发展为HCC，因此重视通过筛查高危患者，在HCC较小、无症状且有可能治愈的情况下，及早发现HCC [14］．肿瘤进展的生物学知识使我们能够确定某些对早期发现或筛查HCC有用的检测方法。HCC高危患者的监测主要采用三种方法:血清AFP浓度、诊断影像(筛查法)和肿瘤标志物测定。

Alfa-Fetoprotein

自1968年以来，AFP一直被用作检测人类HCC的血清标志物[15］．血清AFP是一种主要通过胎儿肝脏产生的蛋白质。血清AFP是检测和临床随访HCC患者的第一个血清学检测方法，多年来一直是HCC的标准肿瘤生物标志物。报道的敏感性和特异性值根据选择的HCC诊断临界值而有所不同。AFP作为肿瘤标志物的一个根本缺点是，血清AFP水平可在活动性肝炎患者中升高，而在HCC中则不会。血清AFP用于肝癌的诊断和筛查，因为在60.0% ~ 70.0%的原发性肝癌病例中AFP高于正常范围。AFP的一个问题是定义HCC诊断的临界值，将>500 ng/ml定义为HCC的诊断水平是不令人满意的，因为许多早期HCC患者的AFP水平远低于500 ng/ml [16］．

此外，慢性乙型或丙型肝炎患者的甲胎蛋白水平有时达到500ng /ml。由于这个原因和其他原因，AFP测定经常被拒绝作为HCC的筛查试验。总AFP有三种不同类型的糖型，AFP- l1, AFP- l2和AFP- l3 -基于它们与凝集素-菜状透镜-凝集素(LCA)的结合能力。高比例的AFP-L3被发现与分化差、生物学恶性特征、更差的肝功能和更大的肿瘤体积相关[17］．

超声检查和甲胎蛋白

超声检查是基于诊断成像技术的超声(US)。超声在已知肝硬化、局灶性脂肪浸润、HCC、再生结节(腺瘤性增生性结节)或肝硬化中可能发生的其他局灶性病变的评估和随访中发挥重要作用[18］．最常用的筛查方法是肝脏超声检查和血清甲胎蛋白(AFP)。然而，超声检查可以发现肝脏内小至1厘米的病变;通常很难将HCC与其他疾病区分开来。超声在需要肝移植的肝硬化患者中发现HCC和发育不良结节的敏感性低，但特异性高[19］．

超声检查和AFP检测早期HCC的敏感性均不理想。尽管它们有局限性，但使用其中一种或两种的研究筛选方法显示筛查可在早期发现HCC，增加接受治愈性治疗的机会，并提高生存率[20.］．超声在诊断中已被计算机断层扫描(CT)和磁共振成像(MRI)所取代，作为一种选择的诊断仪器，因为其低灵敏度和阳性预测价值与并存的肝硬化[21］．

计算机断层扫描

计算机断层扫描是一种像传统x光一样的诊断性医学测试。CT可以生成人体内部的多个图像。CT扫描结合了x射线和计算机技术来生成这些图像。CT被认为是一种有吸引力的HCC筛查成像方式，因为它可以发现肝硬化的病变[22］．图5为HCC患者肝脏CT扫描[23］．一项关于丙型肝炎肝硬化的研究表明，单独使用CT扫描成像检测HCC的敏感性高于超声或AFP(分别为88% vs. 59%和62%)[24］．Brancatelli等人描述了可以在CT成像上模拟HCC的肝脏病变，包括再生结节、局灶性脂肪、血管瘤和发育不良结节[21]。CT的局限性包括需要高辐射剂量，对小型HCC的检测不太敏感，对于出现的发育不良结节，由于其主要的血液供应来自门静脉，因此致密于肝实质[25］．

磁共振成像

磁共振成像扫描使用无线电波和强磁铁，而不是x射线。来自无线电波的能量以一种由身体组织类型和某些疾病形成的模式被吸收和释放。计算机将这种模式转换为身体各部分的高度详细图像[26］．图6为HCC患者动脉期肿瘤增强[27］．MRI在提供未增强图像的结构信息方面优于CT。随着技术和技术的改进，MRI已显著改善了对肝脏病变的检测[28］．MRI已成为世界上许多机构首选的HCC诊断成像模式[21］．许多研究表明，与CT相比，MRI在肝脏局灶性病变的病变检测和表征方面都有优势[29] [30.］．

其灵敏度和特异性与多相CT扫描成像相似;当评价直径小于2厘米的肿瘤时，MRI灵敏度最低[21］．核磁共振成像的主要缺陷包括手术时间长，费用昂贵，患者需要长时间屏住呼吸。26］．

超声弹性成像(纤维扫描)

纤维扫描是一种新的成像技术，允许在生物组织中使用传统的实时超声设备和改进的软件对组织弹性分布进行无创估计和成像[31］．这是一种测量横波速度的超声波装置。如图7所示，一个50兆赫的波从超声探头末端的一个小换能器进入肝脏，该技术测量声波通过肝脏的速度，然后将测量结果转化为肝脏硬度测量。整个过程常被称为肝脏超声弹性成像[32］．

Liana G等人估计实时弹性成像是一种诊断肝硬化患者小(1-3厘米)HCC结节的无创工具[33］．此外，他们的目标是在肝硬化超声检查中发现的直径小于3cm的结节中确定HCC诊断的预测因素。综上所述，肝硬化小肝结节的弹性成像可作为一种无创的准确诊断和选择治疗患者的工具，但不能用于筛查。它在非血管化结节患者中的应用有助于消除肝脏增强造影的假阴性诊断，并改善其预后。

纤维扫描没有任何副作用，而且比肝活检便宜得多。测试结果立即得到。因此，临床医生可以根据这些结果在患者就诊期间做出决定。然而，使用超声弹性成像存在一些局限性，包括:它可能高估急性HCV的损害，不推荐用于腹水和/或病态肥胖患者。表1总结了所有用于检测HCC的筛查技术及其局限性。与其他实体恶性肿瘤不同，肝硬化和炎症的共存使HCC的早期诊断和预后评估更加困难。没有明确证据表明HCC筛查可提高生存率[34］．这一并发症凸显了迫切需要识别有价值的生物标志物，用于HCC的诊断和治疗，以提高生存率。

HCC生物标志物检测的病理学方法学家

DNA测序数据是具有大量突变的复杂基因组。总体畸变的生物学相互作用和临床意义在很大程度上是未知的。许多医生的一般做法是使用超声和血清甲胎蛋白(AFP)筛查HCC，其敏感性和特异性较差[35］．然而，许多患者仍然存在较大的HCC (> 5cm)或多灶性HCC(超过3个病灶)或侵袭门静脉或其他关键结构的HCC。遗传异常、表观遗传、蛋白质组学和成像生物标志物可用于癌症诊断、流行病学和预后。理想情况下，这些生物标记物可以在非侵入性收集的生物液体中进行分析，如血液或血清[36］．

HCC的基因组不稳定性

基因组学不稳定性已经成为理解癌症生物学和根据生物学差异提供癌症分类的普遍方法。癌症的复杂性质，由激活许多不同的癌基因或灭活不同的肿瘤抑制基因开始，并通过额外的表观遗传或遗传改变进展。传统的基因对基因的方法可能只能提供对癌细胞的生物学和病理特征的有限理解。

然而，基因表达谱、基因组拷贝数分析和全基因组测序技术的最新发展，使整个癌症基因组的全面表征成为可能。这些信息将有助于提高我们对推动HCC发展的表观遗传和遗传改变的理解，并最终提供有助于患者治疗的信息[37］．基因组不稳定性使用表观遗传交替(DNA甲基化)，基因表达和染色体畸变来估计遗传和表观遗传交替。

表观遗传交替

表观遗传修饰描述了DNA/染色质的变化，不涉及DNA序列的变化。表观遗传交替影响基因转录和染色质结构而不改变基因组序列[38］．DNA甲基化是表观遗传交替的主要方面。甲基化通常发生在核苷酸基胞嘧啶(5-甲基胞嘧啶)的第5个碳原子[38］．DNA甲基化用于基因沉默和染色质重塑。Gao等人应用甲基化CpG岛扩增微阵列研究肝癌癌变和癌前组织中的DNA甲基化[39］．他们发现了几个重要基因的异常DNA甲基化，如DUSP2和BMP6，这些已知与肿瘤发生有关。

hbv和hcv阳性hcc患者在癌变组织和非癌变组织中的DNA甲基化状态显著不同，提示hbv相关的致癌途径可能导致不同的DNA甲基化谱[40］．越来越多的证据表明，表观遗传改变正在发展成为癌症发生和发展的重要机制[41］．

许多研究表明，高甲基化可能是HCC中某些抑癌基因失活的重要机制。图8列出了在HCC中被频繁报道的涉及DNA甲基化的基因[42］．

微阵列和基因表达分析

微阵列技术是一种用于分子生物学的技术，可以同时查询数千个基因的表达。一种基于细胞基因组中编码的基因只有一部分通过克隆成信使RNA (mRNA)来表达这一事实的基因组技术。细胞中mrna的补体在很大程度上决定了蛋白质的补体。因此，基因表达是正常和恶性细胞生物学的主要决定因素。

基因表达谱的使用在癌症中特别重要。这是因为癌症的发生和恶性进展是多种癌症起始基因序列或表达水平变化的组合和积累作用的结果[43］．Hsp70被认为是早期HCC癌前病变或非癌性肝鉴别诊断的敏感标记物[44］．

有一些技术可用来监测基因组尺度上的基因表达，如抑制消减杂交(SSH) [45]，差异显示(DD)分析肝癌发生[46] [47］．Caillot等人利用微阵列技术发现了SERPINF2、ITIH1和TTR基因表达及其相关蛋白与肝脏各纤维化阶段的显著相关性[48］．图9为HCC微阵列研究中出现的基因列表[42］．

染色体畸变

染色体畸变是最常见的遗传变异类型。拷贝数交替(CNA)对应于在某些染色体上被删除或复制的相对较大的基因组区域。此外，它表现为在细胞分裂过程中染色体片段的丢失或获得，并导致非整倍体的增加，这反过来导致更多的突变和增强肿瘤进展，导致侵袭性肿瘤。HCC表现出较高的染色体畸变发生率。识别这种畸变可以帮助定位基因组中具有诊断意义的重要区域，这些区域包含差异表达基因。这些畸变包括较大的染色体增益、丢失、扩增和缺失。基因组的不稳定性也会导致癌基因的过度表达或激活以及肿瘤抑制基因的沉默。

在细胞复制过程中，会发生许多类型的错误，导致基因组中插入额外的拷贝或删除部分DNA序列。如果这些错误不受控制，这些错误会使重要基因沉默或放大它们的表达，在这两种情况下都会导致细胞功能不正常。如果它们涉及调节细胞分裂的原癌基因的扩增或阻止不期望的细胞分裂或导致程序性细胞死亡的肿瘤抑制基因的缺失，这些错误是致癌起始阶段的因素。

这些特定的遗传错误的积累会导致一组细胞越过癌症的阈值，此时细胞的遗传不稳定性和高复制率将导致更多的错误，从而导致进展或转移[49］．这种基因改变早在肝硬化的癌前病变中就能观察到，被认为是肝癌发生的起始事件。基因组DNA拷贝数的增加、扩增或丢失在HCC的发展过程中起着重要作用。

细胞遗传学异常是可以通过荧光原位杂交(FISH)、比较基因组杂交(CGH)和阵列比较基因组杂交(a-CGH)检测到的生物标志物。图10列出了HCC拷贝数变异中常见的像差区域，显示了主要类型的像差损失和增益。

DNA拷贝数改变(CNA)

拷贝数改变是与许多人类疾病密切相关的遗传疾病[50］．CNAs可以通过细胞遗传学技术发现。目前有许多方法可用于检测CNA:荧光原位杂交、比较基因组杂交、阵列-CGH和单核苷酸多态性(SNP)阵列虚拟核型分析。最近，DNA测序技术已使新一代测序技术能够识别cnv [51] [52］．

DNA拷贝数的改变可以肯定是大于1 kb的DNA片段，在正常人群中显示拷贝数的差异[53］．癌症特异性cna的鉴定不仅将为理解肿瘤发生的分子基础提供新的见解，而且还有助于发现新的癌症基因。cna改变基因表达水平，从而改变正常的生长控制和生存途径。CNA可以通过计算染色体的强度log2比[54］．

Subharup G等人利用隐马尔可夫模型(HMM)计算相邻克隆之间的依赖关系，建立了一个统计框架，用于检测拷贝数的增益和损失，识别局部缺失和扩增，并将肿瘤DNA划分为拷贝数相对稳定的区域。他们发现，该算法对单个探针的敏感性通常使他们能够找到其他算法遗漏的候选基因[55］．

荧光原位杂交(FISH)

20世纪70年代末和80年代初克隆技术和抗体偶联的改进导致早在1977年就引入FISH [56］．到20世纪80年代末，FISH被用于检测特定的染色体区域和位点[57]利用重组文库，可以对许多基因进行染色体定位[58] [59]在人类基因组内。FISH使用荧光DNA探针定位细胞核内的特定染色体位置，从而产生可以使用荧光显微镜检测到的彩色信号。

荧光原位杂交能够在显微镜下观察中期染色体上单个序列的位置。该技术还可用于检测染色体异常或确定特定序列的染色体位置和识别染色体。荧光原位杂交可以扩大到分析数百个细胞，从而提高了分析和检测克隆染色体异常的敏感性，检测的细胞数量远远超过传统的染色体带技术和中期分析。图11显示了FISH方法检测拷贝数变化的全部制备过程。

路德维希。W.等人对细胞学标本的间期核进行了FISH检测，能够正确检测18例中度(G2)、良好(G1)或低分化(G3)肝细胞癌肿瘤细胞的染色体拷贝。他们发现1号和8号染色体的形态去分化与拷贝数的增加以及FISH信号的差异有密切的相关性[60］．FISH可能没有足够高的分辨率来识别与异常有关的确切染色体区域[61］．

比较基因组杂交(CGH)

CGH是一种荧光分子细胞遗传学技术，通过竞争性地将两个DNA样本中的差异标记DNA与正常中期染色体杂交，来确定两个DNA样本之间拷贝数的增益、损失和放大[54］．

肿瘤DNA用绿色荧光色素标记，随后将其与红色标记的正常DNA(1:1)混合，并杂交到正常的人类中期排列。绿色和红色标记的DNA片段竞争杂交到它们在染色体上的起始位置。沿染色体轴测得的绿色与红色荧光比值表示检测中DNA拷贝数与肿瘤中特定位点遗传物质参考DNA的相对数目[62如图12所示。

Kusano N等人对41例HCC进行了CGH分析，以检验细胞遗传学畸变的分析是否允许我们评估HCC的生物学行为。他们检测到13q处缺失，11q13处扩增，8p染色体缺失。这项研究表明，通过比较基因组杂交提供的细胞遗传学信息对于估计HCC患者的预后是有用的[63］．

使用CGH有局限性:它不能检测不改变拷贝数的结构染色体畸变，如平衡染色体易位、环状染色体或倒位。它不提供组织结构方面的信息，传统CGH的分辨率受到中期染色体长度的限制，大约有10亿个碱基，可能有数百个基因。阵列比较基因组杂交基于与CGH相同的原理，除了目标是映射的基因组克隆而不是整个染色体。

阵列比较基因组杂交

阵列比较基因组杂交是一种普遍的技术，用于识别人类疾病的染色体畸变，包括癌症。竞争性杂交策略识别了基因组增益和损失区域，揭示了潜在的肿瘤抑制基因(基因组缺失的CGH区域)和癌基因(基因组增益/扩增的CGH区域)[64］．

A-CGH是研究DNA序列副本数量的最常用方法。Kallioniemi等人首次描述了它。[65]，然后在Albertson和Pinkel [66]和Snijders等。[67］．最近对套细胞淋巴瘤的阵列CGH研究检测到的染色体畸变数量比传统CGH高50% [68］．a-CGH通过用阵列格式发现的基因组片段替换杂交靶点(中期染色体扩散)，显著提高了该技术的分辨率(约1 Mb) [69］．

它提供了许多特性，包括:更容易标准化，更高分辨率，阵列- cgh强度比通过计算染色体的强度对数比，提供了关于DNA拷贝数全基因组变化的非常有用的信息[68］．微阵列技术在癌症研究中的一个典型应用是对不同疾病状态的患者进行分类。对于HCC，这些研究包括肿瘤与非肿瘤样本的分类、早期与晚期、预后好与预后差、组织学分级高与低、HBV与HCV感染的HCC患者等。Kim等人利用cDNA微阵列数据分析和有监督的机器学习方法，鉴定出44个可以区分hbv阳性HCC与非肿瘤肝组织的基因[70］．

图13显示了a-CGH的步骤:用不同颜色标记测试DNA和参考基因组DNA，混合，与未标记的Cot-1 DNA共沉淀，实现重复序列的阻断。有足够数量的Cot-1 DNA，这对于获得对重复序列的充分抑制很重要[71］．

a- cgh在癌症分子分析中的广泛应用，预示着作为一种识别临床相关诊断生物标志物的技术的巨大前景。随着阵列cgh数据数量的增加，有许多自动化算法用于描述基因组轮廓，例如，Cheng等人讨论了一种基于回归的改变拷贝数的测试[72］．Jong等人提出了一个断点模型来分割克隆[73］．Pollack等人提出了一种阈值方法来识别具有发射极值的克隆[74］．Lingjaerde等人利用相邻数据值的符号进行平滑，并检查片段的宽度和大小，以揭示拷贝数变化的区域[75］．

Esraa MH等人使用CBS算法检测HCC的拷贝数变化，以改善HCC预后，并找到有用的生物标志物用于监测复发和早期诊断[76］．结果表明，CBS在检测全球趋势方面是有效的，这是识别与癌症相关的生物标记基因的重要特征。

Mai SM等人将离散平稳小波变换(DSWT)技术应用于许多人类染色体，分析阵列cgh数据，以评估HCC患者的预后，以识别基因组数据拷贝数的全基因组改变[54］．结果表明，DSWT是一项功能强大的技术，可以提供更多关于HCC发展的信息，从而为HCC的诊断和预后提供更好的依据。使用离散平稳小波分析建模肝癌的a-CGH数据可以为鉴定HCC生物标志物基因开辟新的领域[54］．精神分裂症(77]、癌症[78]，采用阵列- cgh - next generation sequence (NGS)方法检测CNVs，发现NGS对存在CNVs的基因组区域具有更高的分辨率。

下一代序列技术在肝癌诊断中的应用

NGS很大程度上依赖于复杂生物信息学并面临着重大的数据管理和解释挑战，以确认单个癌症相关基因中的特定位置是野生型、SNP还是体细胞突变[79］．这项强大的技术用于通过全基因组测序(WGS)和全外显子组测序(WES)来确定肝癌发展过程中潜在的驱动突变。

在过去的几年里，下一代测序通过在一次运行中生成数百万个短读，已经包括了对拷贝数变化的全面描述，并已发展成为一种流行的基因分型策略[80］．下一代序列方法的一大优点是，它们不仅可以检测碱基替换，还可以同时发现CNAs、插入、删除和易位。

迄今为止，应用NGS技术研究HCC的研究数量有限[81］．2011年;首例原发性肝癌基因组测序并诊断为HCV阳性HCC [82］．大量平行的50个碱基对配对的末端reads和来自同一患者的淋巴细胞，揭示了11731个肿瘤富集的体细胞突变。结果证明，NGS在肝脏活检中检测病毒感染方面具有强大的功能。

不同的公司已经开发了许多不同的技术，例如:Illumina(基因组分析仪II;San Diego, CA, USA)， Life Technologies(通过寡核苷酸连接和检测或SOLiD进行测序)，Roche应用科学(454基因组测序FLX系统;印第安纳波利斯，IN, USA)，卡尔斯巴德，CA, USA)， Ion Torrent Systems(现在由Life Technologies, Ion Proton System拥有)，和Helicos BioSciences (HeliScope单分子测序仪;美国马萨诸塞州剑桥市)[83］．

阚正燕等报道了对88对匹配的肝癌肿瘤/正常配对(其中81对HBV阳性)的全基因组测序研究结果，旨在鉴定HBV相关肝癌的基因改变和通路[84]。该研究还确定了一些流行的和潜在的可操作的突变，包括(Janus激酶1)的激活突变，并为HCC疾病的治疗干预提供了一条途径。

下一代测序为研究整个癌症基因组的所有序列提供了绝佳的机会，以揭示癌症发展过程中发生的遗传变化，这有助于发现新的生物标志物，并了解疾病过程以更好地诊断。下一代测序技术有望通过促进以单碱基分辨率对癌症的表观遗传和遗传改变进行整合和有效检测，从而帮助早期发现HCC，从而实现对肿瘤基因组学的全球视野。

讨论

HCC是世界上最常见的致命癌症。它在全球癌症死亡中占很大比例。HCC是一种侵袭性癌症，常发生在慢性肝病和肝硬化的背景下。肝脏有几个必要的功能，包括排毒体内有害物质，清洁血液和制造重要的营养物质。肝硬化是由慢性肝病引起的慢性肝损害的终末期。慢性肝病的常见病因有丙型肝炎、乙型肝炎感染。早期HCC的识别是筛查HCC背后的原因，这可能是积极的干预和提高生存率。

肝活检被认为是一种有创性检测HCC的方法。遗憾的是，肝活检会引起内出血，并不适合所有患者。肝细胞癌无需病理确诊，可通过评估血清AFP水平，并结合超声、计算机断层扫描和磁共振成像等影像学技术进行诊断，[19] [23] [26］．然而，早期诊断仍需要改进，因为只有44%的患者在疾病早期被诊断出来，只有30%的HCC患者在诊断时可以进行潜在的治疗治疗[85］．正因为如此，应用新技术来提高我们对HCC分子发病机制的认识，识别导致早期诊断的生物标志物，并确定新的治疗靶点，受到了相当大的关注。

癌症基因组中存在的大量结构异常明显归因于基因组的不稳定性。基因组DNA拷贝数改变与包括肝癌在内的许多复杂疾病有关，因为遗传改变(扩增和缺失)经常有助于肿瘤的发生，因此非常需要能够检测基因组不稳定性的敏感、高分辨率技术，因为这将为揭示基因组不稳定性的机制以及不稳定性在肿瘤发生中的作用提供关键的见解。传统的识别CNAs的方法包括核型和FISH、CGH和阵列CGH，这些方法存在一些固有的缺陷，包括突变罕见、分辨率低、难以检测新的和有限的基因组覆盖。

新开发的下一代序列可以同时测量基因组中数千个位点的拷贝数，更准确地估计拷贝数，更高的覆盖率和分辨率，准确检测断点，以及更高的识别新拷贝数变化的能力。NGS的应用，主要是通过全基因组和全外显子组技术，在癌症基因组改变的背景和复杂性方面产生了爆炸。

肝脏肿瘤分为良性和恶性两部分。HCC是最常见的恶性肿瘤之一。HCC的早期诊断对于患者的生存是不可或缺的，但这是一项非常艰巨的任务。到目前为止，还没有积累的证据表明监测高危患者可以提高生存效益。目前HCC的筛查方法主要有血清AFP检查、CT、MRI和超声检查。由于筛查方法的复杂性，没有明确的证据可以提高HCC患者的生存率。这一担忧表明迫切需要一种敏感、特异性和简便的策略来预诊断、早期发现和监测HCC，这将提供显著的临床益处。事实上，发现用于早期检测HCC的新型生物标志物是一项尚未满足的关键医学需求。早期发现和鉴别诊断是肿瘤切除成功和预后良好的关键。

对肝癌发生过程中重要的新的遗传和表观遗传改变的描述和理解，可能有助于认识肝癌的分子发病机制，并为肝癌的治疗提供新的治疗靶点。

下一代DNA测序将基因组测序引入临床实验室和基因组策略。与传统方法相比，NGS的应用几乎是无穷无尽的，这使得与生物科学相关的许多领域都取得了快速进展。人类基因组的重测序已经完成，以确定参与病理过程的基因和调节元件。

NGS有很多好处，包括能够在一次测试中对大量基因进行完全测序，同时检测缺失、插入、识别所有已知癌症相关基因的新拷贝数改变、易位和外显子组范围内的碱基替换。下一代方法有望更好地整合多个分子层，并最终对临床应用产生更有意义的影响。这些强大的技术将为肝癌的发展提供更多的信息，有助于肝癌的更好诊断和预后。NGS有望彻底改变癌症研究、药物设计、诊断和治疗。