Vv-lac3的克隆和表达分析小说功能漆酶基因参与柄伸长,基因组序列的基础上Volvariella volvacea

文摘

真菌漆酶总是扮演了一个重要的角色在不同的生理和发育过程。在这里,我们一个漆酶基因克隆,名叫Vv-lac3互补脱氧核糖核酸的Volvariella volvacea,并表示在毕赤酵母pastoris互补。Vv-lac3 cDNA由1599个基点的包含一个开放阅读框(ORF)编码532个氨基酸。推导出氨基酸的分析显示,Vv-lac3拥有19-amino酸信号肽的氨基端和513氨基酸成熟的蛋白质。Vv-lac3包含四个守恒的铜包网站,这是典型的真菌漆酶的结构。系统发育分析表明,Vv-lac3有高度的身份与其他担子菌漆酶。Native-PAGE和sds - page分析表明Vvlac3 cDNA的产物从p . pastoris功能漆酶的分子质量65 kDa。诉volvacea Vv-lac3基因的表达增加按钮阶段拔节期;在拔节期达到峰值,然后减少在成熟阶段,这表明这个基因扮演监管角色在诉volvacea柄伸长。

关键字

Volvariella volvacea,子实体形成漆酶酶

介绍

漆酶(benzenediol:氧气氧化还原酶,EC 1.10.3.2)属于一个家庭的蓝色multicopper氧化酶类催化氧化的各种芳香基质以及分子氧还原成水(1]。漆酶已经吸引了广泛关注,由于其功能的多样性;例如,他们参与了木质素生物降解,植物发病机理和应力国防(2]。漆酶是一种常见的多基因家族的功能在真菌1]。第一个例子中描述的漆酶是多基因家族的双孢菇[3]。以来,十七漆酶的特点Coprinopsis灰质,十一漆酶Laccaria二色的(4),菇中孢子特点是(5]。

Volvariella volvacea(牛。:Fr. Sing.) is an economically important edible mushroom; it is a straw-degrading basidiomycete that has been cultivated extensively in the southern provinces of China for several centuries. The previous reports have led to the suggestion that V. volvacea is unable to degrade lignin because none of the lignin-degrading enzymes (lignin peroxidase, Mn-dependent peroxidase and laccase activity) were detected in this species [6]。然而,最近,诉volvacea的基因组测序已经完成(7,8,总共十一个漆酶基因已经被发现。漆酶是多功能酶,他们可以扮演其他的角色除了子实体形成(9]。澄清的作用诉volvacea漆酶和揭示为什么诉volvacea无法降解木质素在早期的殖民稻草基质,我们试图了解更多关于漆酶基因的诉volvacea。

在这项研究中,我们克隆Vv-lac3基因从诉volvacea并成功地表达了Vv-lac3互补脱氧核糖核酸的毕赤酵母属pastoris。我们还确定了pH值对漆酶的活性的影响的活动。此外,这种基因的表达在子实体的发展研究诉volvacea,这表明的表达Vv-lac3柄伸长是非常重要的。

材料和方法

菌株和向量:异核体的H1521应变诉volvacea得到真菌学的研究中心的福建农林大学,福州,中国,存入中国农业文化集合(加入。ACCC52633)。

大肠杆菌DH5α(TIANGEN,中国)用作克隆主机程序。PZeroBack /钝向量(豆类、日本)是用于subclone cDNA片段进行测序。的pPIC9K alpha-factor信号肽和质粒毕赤酵母属pastorisGS115(狗⁺他的^{- - - - - -})从英杰公司购买(美国)。

总RNA的隔离:诉volvacea应变H1521培养在水稻看到堆肥10]。样品在不同发展阶段收获根据道等人的方法11),在液态氮冷冻。

使用一个E.Z.N.A.总RNA分离出样品美国™植物RNA工具包(ω)根据制造商的指示。反应合成第一链cDNA TransScript®一步gDNA移除和互补脱氧核糖核酸合成SuperMix (Transgen,中国)。所有cDNA是储存在-20°C的后续实验。

漆酶基因的转录模式分析与DGE诉volvacea数据:叶柄的信使rna提取的子实体的四个发展阶段是提交给华大基因研究院(中国深圳)建设和测序的数字基因表达(DGE)库。DGE标记库的建设和测序所描述道et al (11]。DGE数据存入NCBI的GEO数据库加入号码:GSE43297。

然后,DGE数据被用于漆酶基因的转录模式分析诉volvacea。简单地说,这些基因的表达水平是衡量基于标签的数量完全映射到漆酶基因,然后归一化到TPM(每百万清洁标签的标签数量)12]。

此外,存在执行验证的表达Vv-lac3分析了使用DGE数据。SYBR预混料交货TaqTM II (Tli RNaseH +)(豆类、日本)是用于这项研究。总反应体积25μL准备根据制造商的协议。中存在的程序员是如下:初始变性95°C 30年代,40 95°C的周期5 s和60°C 30年代。的引物Vv-lac3和glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(gapdh)基因11,13),作为内部标准,设计与底漆总理5.0。然后,我们使用了2−ΔΔCt方法中存在数据分析(14]。所有实验进行了一式三份。

Vv-lac3 cDNA克隆,表达载体的建设和转换:克隆的Vv-lac3cDNA、PCR引物lac3OF和lac3OR,执行和互补脱氧核糖核酸的按钮阶段作为一个模板。PCR温度程序开始在95°C 3分钟,其次是35周期95°C的30年代,58°C 30年代和72°C 4分钟和最后一个扩展在72°C 10分钟。PCR的反应混合物是如下:2μl cDNA、核苷酸混合物,2.5的2.5μlμl Pfu缓冲区(MgSO₄),0.5μl Pfu DNA聚合酶,1μl正向和反向引物,和15.5μl ddH₂o . PCR产品被克隆到pZeroBack /钝向量(Tiangen,中国)测序(Sangon生物技术,中国)。

的子Vv-lac3没有本地信号肽序列在AvrII和NotI限制性位点的5 '和3 '端分别使用lac3-F-AvrII和lac3-R-NotI与PCR引物。碎片被subcloned pZeroBack /钝向量紧随其后与限制性内切酶消化AvrII NotI限制性内切酶,然后连接到相应的网站的毕赤酵母属pastoris表达载体pPIC9K和验证重组质粒被任命为pPIC9K -Vv-lac3。

的重组质粒pPIC9K-Vv-lac3和pPIC9k没有Vv-lac3,哪些被用来准备负控制压力,使用限制性内切酶尚驰和转换为线性化p . pastorisGS115通过电穿孔(表达载体)。MD平皿上选择转化株(1.34%酵母氮基[YNB], 4×10⁵生物素、2%葡萄糖)28°C,之后他+转化株筛选使用与lac3-F-AvrII和lac3-R-NotI直接PCR引物。

外源Vv-lac3表达、纯化和分析:他+转化株被转移到BMGY琼脂板(2%胰蛋白胨、酵母提取物1%,1.34% YNB, 4×10⁵生物素,1% glycerinum) 28°C 2天。YNB BMM琼脂板(1.34%,4×纯生物素,0.5% (v / v)甲醇,0.1毫米CuSO₄和0.2毫米abt [2, 2’-Azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic酸),100 mM的磷酸钾,pH值6.0][15)被应用于屏幕的转化株分泌Vv-lac3根据“绿区”的存在在他+转化株殖民地。

的Vv-lac3转化株接种在100毫升BMG (100 mM的磷酸钾,pH值6.0,1.34% YNB, 4×纯生物素和1%甘油)28°C和150 rpm,直到OD600值达到10。然后,p . pastoris离心收集细胞的5分钟1500克、再保险暂停和50毫升BMM(包含0.3毫米CuSO₄和0.8%丙氨酸)28°C和150 rpm (15]。甲醇添加每日的终浓度0.5% (v / v)和1毫升的文化是每天从烧瓶。上层清液被离心收集之前漆酶活动的测量根据先前所描述的方法(16]。我们定义一个单位的漆酶活动的漆酶催化氧化1μmol abt最低为1 (17]。此外,Native-PAGE进行8毫升的12% (w / v)分离胶和2毫升的5% (w / v)叠加识别漆酶的凝胶。蛋白质电泳后,乐队与漆酶活性染色在0.1 1毫米abt醋酸缓冲(pH值5)(16]。

执行上述实验后,浮在表面的漆酶活性最高的收获了10000 g离心10分钟和集中使用PEG4000卷5毫升。集中的解决方案应用于交联葡聚糖G-15列(10×300毫米)预平衡0.05磷酸盐缓冲剂(pH值6.8)。筛选了使用相同的缓冲和筛选了蛋白质检测到1毫米的abt 0.1醋酸缓冲(pH值5),之后,筛选了蛋白质已经被应用到某个deae纤维素柱(10×300毫米,DE52)预平衡0.05磷酸盐缓冲剂(pH值6.8)。与500毫升相同的缓冲区,洗后释放的蛋白质从列中删除。随后,绑定与漆酶筛选了梯度浓度的氯化钠溶液(从0.05米到0.45米)。筛选了蛋白质集中,集中使用PEG4000 2毫升,并存储在-20°C进一步调查。

纯化蛋白研究使用10% w / v钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳(sds - page)。之后,乐队的蛋白质染色与考马斯亮蓝r - 250在室温下2 h。蛋白质分子量标记(豆类、日本)被用来估计的分子量不等的Vv-lac3。此外,纯化的最佳pH值Vv-lac3被监测化验的氧化abt 420 nm(ε_420年= 3.6×104 / mol /厘米)。反应混合物含有适量的纯化Vv-lac3和1毫米的abt恩缓冲区在不同pH值范围(酸碱2.5 - 7)。净化的活动Vv-lac3在最佳pH值被定义为100%。

蛋白质序列分析和系统发育树的构建:Vv-lac3的基本物理和化学特性进行了分析使用ExPASy Protpara (http://www.expasy.ch/tools/protparam.html)[18),而信号肽预测了signalP 4.1服务器(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)[19]。氨基酸的分析都使用InterProScan保护域(http://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan/)[20.]。NetNGlyc 1.0服务器(http://genome.cbs.dtu.dk/cgi-bin/webface2.fcgi)[21)是应用于分析N-glycosylation网站。

生成系统发育树,18个典型的漆酶的氨基酸序列与其他真菌得到从NCBI根据Valderrama所使用的方法22]。然后,这些序列和漆酶的漆酶氨基酸序列预测编码Vv-lac3基因与ClustalX 1.83 [23]。neighbor-joining树构建使用引导方法(引导关系的数量是1000)使用MEGΑ5.1软件(11,24,25]。

结果

诉volvacea漆酶基因的基因组和转录模式:基于同源性搜索结果中使用本地爆炸分析通过比较六漆酶基因的序列诉volvacea第十四节下载从NCBI菌株的基因组PYd21(基因库:ANCH00000000.1), 11 PYd21基因组中假定的漆酶基因被发现。其中,六漆酶氨基酸序列最接近与以前克隆漆酶基因V.volvacea,即lac1(AY249052.1) [10),lac2(AY338483.1) [26),lac3(AY338484.1),lac4(AY338486.1),lac5(AY338485.1),lac6(AY338487.1)。因此,我们命名这些基因在公约建立了陈。此外,包等(7V]发表的漆酶基因家族。volvacea第23节。他们给这个漆酶基因在第23节使用另一个规则(脚手架上顺序)。我们一致的漆酶基因位点之间PYd21第23节;11漆酶基因表现出相似的位点在基因组(图1),这表明这种漆酶位点结构在诉volvacea可能是保守的。此外,所有这些来自PYd21基因组的基因表现出高与序列同源性检索从诉volvacea第23节(表S2。身份≥98%,价值= 0)。

标签被映射到每一个漆酶基因对于每个发展阶段和规范化TPM。发现了这些基因的表达水平的差异相比,不同的发展阶段(表1)。所有的漆酶基因,除了lac7、lac8和lac10,表示至少在一个阶段。在这些基因中,Vv-lac3在每个样本表现出最高的表达水平,这也显示出一个有趣的表达模式,因此Vv-lac3被选作进一步的研究。

转录水平低的Vv-lac3分析基于DGE数据按钮检测阶段。的表达Vv-lac3然后在鸡蛋阶段急剧增加,拔节期达到峰值。的表达水平Vv-lac3减少在成熟阶段。这些结果进一步证实了存在(图2)。的转录模式Vv-lac3强烈建议这个基因可能在拔节期发挥重要的监管作用。

Vv-lac3基因的结构:基于诉volvacea从应变PYd21全基因组测序数据,引物(lac3-OF和lac3-OR)是为了Vv-lac3 cDNA克隆。的全长cDNAVv-lac3由1599个基点。比较的Vv-lac3基因组DNA序列和cDNA序列使用DNAMAN(版本5.2.2)透露,编码区被13内含子(图3)。13个内含子的大小介于50到80个基点,和所有的接头连接的内含子符合GT-AG规则(27]。

Vv-lac3蛋白质和种系发生树的描述:的互补Vv-lac3编码532个氨基酸的公认的信号肽19个氨基酸和成熟的496个氨基酸的蛋白。分析Vv-lac3使用ExPASy Protparam透露,理论推导出氨基酸的等电点(pI)为4.62。InterProScan搜索表明,推导出的蛋白质包含三个multicopper氧化酶域(1型,IPR001117;2型,IPR011706;类型3,IPR011707)。三个N-glycosylation网站(Asn-Xaa-Thr /爵士,Xaa不专业),在89年职位,114年和451年的推导出氨基酸,被发现使用NetNGlyc 1.0服务器,这表明laccase3诉volvacea是一种糖蛋白。推导氨基酸序列的一致性表示四个铜包网站(L1-L4),包括10守恒的组氨酸残基和1个半胱氨酸残基,被发现在这个蛋白(图4)。守恒的组氨酸残基的存在和半胱氨酸残基位于四个铜包网站建议Vv-lac3属于典型的漆酶的家庭。

系统发育分析表明,所有我们收集的担子菌类的漆酶或子囊菌类分歧形成独立的演化支,分类学的一致。此外,Vv-lac3集群与Lac2和Lac3从c .灰质(图5),已被证实为真实的漆酶。此外,BLASTP结果表明推断蛋白质Vv)的产物lac3显示高身份与其他真菌漆酶,如c .灰质(AAD30965.1 65%),l二色的(XP_001874989 61%),鬼伞属comatus(AFD097049.1 63%),Stropharia绿脓杆菌(AFE48786.2 62%),垂体漏斗bulleri(ABW75771.2 63%),c .灰质(AAD30966.1 65%)f中孢子(AIW01083.1 61%)。

Vv-lac3的异种的表达式p . pastoris:的Vv-lac3插入cDNA、没有本机信号序列,下游的α-factor分泌信号p . pastoris表达载体pPIC9K。pPIC9K-Vv-lac3和pPIC9K序列消化囊。然后,pPIC9K -Vv-lac3和pPIC9K变成了p . pastorisGS115和筛选BMM盘子。包含pPIC9K——积极的转化株Vv-lac3生产绿色区域在他们的殖民地,而包含pPIC9K没有显示任何颜色的变化(图6)。殖民地显示BMM板块最深的绿色区域,这可能是最有效的Vv-lac3生产的殖民地,被选为随后的实验。

漆酶活动达到顶峰后21天培养(296.83 U / L)和外源Vv-lac3纯化和检测到Native-PAGE和sds - page,两者都显示一个乐队(图7)。纯化的分子量Vv-lac3大约是65 kd,符合以前描述的真菌漆酶的特性(60到80 kDa) [2]。类似于许多真菌漆酶的最佳pH值范围是3.0 - -4.5 abt [28),的最佳pH值Vv-lac3是4.5 (图8)。pH值超过4.5时,活性下降,几乎完全耗尽在pH值为7.0。

讨论

漆酶是生漆树中首次发现采用vernicifera(由瑟斯顿)2]。随后,漆酶也被确认在其他植物29日,30.),在不同的真菌(31日- - - - - -34在细菌中,35- - - - - -38,在昆虫39]。漆酶进行多样的生物作用。在植物漆酶参与木质素生物合成(40]。在细菌中,漆酶参与的保护孢子对压力因素如过氧化氢或紫外线辐射(37]。在真菌漆酶还参与生物合成色素(41],木质素降解[42),分生孢子生产和孢子形成43]。

除了角色在木质素降解和植物病理、真菌漆酶参与孢和木质素生物转化l .香菇(44,45),果期身体的发展诉volvacea(26),吉尔布朗宁在子实体收获l .香菇(46),和柄伸长f中孢子(5]。在这项研究中,首次分析了11个漆酶基因的转录柄伸长的进步中诉volvacea。在这些基因中,Vv-lac3表现出最高的表达水平在每一个样本,因此Vv-lac3互补脱氧核糖核酸是克隆和表达p . pastoris。推导出蛋白质的分析表明,预测蛋白质序列Vv-lac3进行四个保守序列区域L1-L4,用于识别漆酶(47]。高身份与漆酶序列c .灰质l .二色的,f中孢子建议的蛋白质编码Vv-lac3基因是一个漆酶。系统发育树提供了进一步的证据Vv-lac3是一个理智这篇漆酶基因。此外,绿色区域的存在在他们的殖民地,结果使用Native-PAGE和sds - page分析证明了Vv-lac3基因编码的一种功能性漆酶。

Vv-lac3的最佳pH值为4.5,与漆酶的活性几乎耗尽的pH值7.0,这是类似的活动CcLCC6I的最佳pH值是3和CcLCC6I的活动是完全耗尽的pH值6.0到7.6之间(48]。然而,亚文化的营养菌丝进行水稻秸秆堆肥(pH值8.0)(49]。漆酶活性和之间的pH值的差异诉volvacea增长可能占无法降解木质素,因此,从木质化的增长无法画出营养基质,反过来,导致相对贫困蘑菇产量甚至在浪费与稻草等少量的木质素堆肥。

柄的诉volvacea非常小的按钮,在蛋中延伸阶段,然后延伸到几乎完整拔节期(50]。的表达水平Vv-lac3基因是在符合叶柄组织的变化发展的诉volvacea水果的身体。转录模式暗示Vv-lac3基因可能发挥重要的监管作用的菌柄伸长。实验,这是一个用于研究基因的功能,应该进行进一步确认的监管作用Vv-lac3在菌柄伸长。然而,这仍然是一个挑战对我们在敲基因诉volvacea(51]。基因的转录模式分析子实体的开发过程中可以提供的基础,阐明柄伸长的不同参数的子实体诉volvacea鉴于柄伸长的破裂的原因被认为是普遍的面纱,反过来,减少商品的价值(52- - - - - -54]。总之,我们的初步结果可能推广的好处诉volvacea种植。

确认

这项工作是支持由中国国家重点基础研究计划(2014 cb138302),和中国农业研究系统(CARS24)。作者感谢福建食用菌工程技术研究中心和国家真菌育种中心(福建分公司)提供实验设施。

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