6-苄基氨基嘌呤(BA)与毛状根外植体组合对辣椒离体植株再生的替代改良

Nursuria Md Setamam^1＊以及诺丽扎·贾法尔·西迪克²

¹马拉科技大学应用科学学院，彭亨市(Jengka)

²马来西亚雪兰莪州沙阿拉姆市马拉科技大学应用科学学院

*通讯作者:: Nursuria Md Setamam
应用科学学院
大学技术
叠卡，彭亨，马来西亚
电话:+ 60122585937
电子邮件: (电子邮件保护)

收到日期:13/07/2016;接受日期:20/01/2017;发表日期:25/01/2017

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摘要

辣椒建立而且辣椒frutescens属茄科植物，以其巨大的经济重要性而闻名作物和药品。然而,体外再生的辣椒仕达屋优先计划．这很有挑战性。因此，在本研究中研究了毛状根的用途外植体6-苄基氨基嘌呤(BA)被发现非常有效地增加患病几率体外两者的再生辣椒建立而且辣椒frutescens．结果表明，选用atc 15834型选择性发根农杆菌共培养子叶外植体，可有效地提高子叶外植体质量c . frutescens和attc43056c .建立5种不同浓度的BA激素(0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L)连续2个月对形态发生有很好的效果。由研究可知，BA的最佳浓度为c . frutescens(1.0 mg/L)和c .建立(1.5 mg/L)降低了芽的诱导天数，缺乏愈伤组织的形成和坏死。尽管如此，不同浓度的BA能够促进两者的直接形态发生辣椒仕达屋优先计划．然而，两者在形态上只有轻微的差异辣椒物种。综上所述，在最佳浓度BA的诱导下，两种毛状根诱导子叶外植体均有较强的再生潜力，可使毛状根产生叶、茎和根，并可降低毛状根的抗性。

关键字

直接形态发生，辣椒，辣椒，毛状根，6-苄基氨基嘌呤(BA)，植物再生，发根农杆菌。

简介

大部分的茄科家人经济的重要性包括农作物和药用植物辣椒．又可分为厚朴科、厚朴纲、茄属目[1］．在亚洲,c .建立而且c . frutescens不仅作为香料和蔬菜作物广受欢迎，而且作为药物治疗疾病，如镇痛，抗癌，抗氧化，抗肥胖，改善心血管和胃肠道活动，减少骨质疏松症[2，3.，4］．在田间种植中，辣椒仕达屋优先计划．曾面临许多挑战，如病毒感染，包括环斑，托斯波，胡椒斑驳和也植物病原真菌，如疫霉capsici,镰刀菌素而且丝核菌是什么导致质量和数量的减少辣椒仕达屋优先计划．产量(5，6］．然而，介绍答:rhizogenes通过创造更好的遗传稳定性和辣椒素、辣椒素、槲皮素和木犀草素等次生代谢产物的高产，在改善这些植物物种方面表现出积极的响应[7-9］．毛状根的其他优点也为植物免疫系统的发展提供了可能，也可作为植物修复[10-12］．毛状根的好处已经在许多其他植物研究中得到证实，比如烟草，野蔷薇，黄花蔷薇,人参quinquefolius［13-16］．因此，利用发根黄芪介导的毛状根作为外植体，可以有效地提高植株在生长过程中发生顽抗的可能性体外的文化辣椒仕达屋优先计划．希望可以减少。此外，利用这种替代方法成功的植物再生可能已经创造了辣椒仕达屋优先计划．以前对许多其他类型植物的研究表明具有类似有益特性的植物[17-25］．在本实验中，毛状根诱导外植体的应用已成为选择植物激素类型的关键因素。细胞分裂素激素由于毛状根外植体存在早期生根的原因，被选作促进拔节的外植体。选择6-苄基氨基嘌呤(BA)是由于在以往的研究中注意到的高成功率辣椒仕达屋优先计划．［26-33］．然而，该激素对毛状根诱导外植体的相容性还有待研究。因此，本研究采用不同浓度的BA来研究激素对两者直接形态发生的影响c .建立而且c . frutescens．再生植株成功，形态发生率高辣椒仕达屋优先计划．在本研究中，通过优化BA浓度作为主要参数来提高再生潜力，同时降低抗逆性的可能性，这主要由三个主要因素决定，即外植体的类型，体外技术，物质，如植物激素和媒体营养［34］．

材料与方法

毛状根诱导子叶外植体的制备

的种子c .建立瓦尔辣椒，胡椒和c . frutescens瓦尔鸟眼辣椒是从当地供应商获得的。种子表面用15%次氯酸钠、两滴Tween 80和70%乙醇消毒5分钟，最后用无菌蒸馏水冲洗。两周后体外将种子萌发、子叶段切下，与选择性发根黄芪株系ATTC 15834共培养c . frutescens和attc43056c .建立由于前人研究中相似的高毛状根转化率[35］．共培养1天后，用含Murashige and Skoog, 1962 (MS)含卡本西林二钠(1000 mg/L)液体培养基清洗外植体2小时，再用含500 mg/L卡本西林二钠的MS全强度固体培养基培养。外植体在含降低浓度卡苯西林二钠(200、100和50 mg/L)的MS固体培养基上传代培养1个月。

芽诱导培养基制备

在1升无菌蒸馏水中加入4.4 g MS粉、1.0 g肌醇和30 g蔗糖，制备全强度MS固体培养基。然后，在培养基中分别加入5种不同浓度(0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L)的BA激素。使用盐酸(HCl)或过氧化钠(NaOH)将介质溶液pH值调整为5.7 ~ 6.0左右。然后，最后在介质中加入4.0 g凝胶，然后在121°C下15 psi高压灭菌20分钟。

培养维护阶段

1个月后，对子叶诱导的毛状根外植体进行修剪，去除正常的根，直至外植体只剩下毛状根。外植体在含BA处理介质的罐子中仔细培养。每个处理包括20个重复，在25ºC下孵育并在16/8小时(光/暗)光周期下维持两个月。再生细胞的形态和生长速率辣椒仕达屋优先计划．被观察到。

数据与统计分析

过程中的形态变化形态发生两种c .建立而且c . frutescens被观察和测量。生长速率效率采用双向方差分析(ANOVA)，多重比较检验采用Tukey检验。2个月后，所有有标准差的平均值均以均数±标准差表示经济增长周期．

结果与讨论

两个月后，毛状根诱导的子叶外植体均表现出阳性的再生效果c .建立而且c . frutescens（图1一个而且1 b)。．不同浓度的BA均能促进两者的形态发生辣椒仕达屋优先计划．形态略有变化。不同的形态表现在c .建立相比之下，身高会降低c . frutescens在整个植物结构中。在无BA或低浓度BA条件下，叶片尺寸减小，呈绿色。窄尖叶状(图2一个)在各BA处理中表现相似c .建立四舍五入c . frutescens（图2 b)．这两个辣椒仕达屋优先计划．茎部有平滑层，茎部周围无短毛(图3一),c . frutescens茎较粗c .建立（图3 b)．有大量的分支出现在c .建立相比缺少分支c . frutescens．在两个再生物种中都有两种类型的根，似乎是毛状根和正常根的组合，其中毛状根更丰富(数字4而且4 b)．即使正常的根在培养前被移除，但一些根细胞却无法进行培养遗传转化之前通过Gus染色和其他分子证据支持的研究报告的A.rhizogenes [36-42］．的整个根系统c .建立似乎保留了它们以前较粗较短的根相比c . frutescens报告了之前的研究[35］．BA浓度均较高(1.5 mg/L和2.0 mg/L)辣椒仕达屋优先计划．表现出诱导愈伤组织的能力，愈伤组织主要分布在根区(图5)，但叶片和茎区也有少量愈伤组织存在，特别是2.0 mg/L BA处理时(图5a - 5d而且5 f） .根区诱导的愈伤组织多为坚硬、易碎、颜色为深褐色，茎区和叶区诱导的愈伤组织形态较好，为柔软、易碎、颜色为白色，更适于进一步组织培养研究。低浓度BA处理(0.25和0.5mg/L)均诱导不出愈伤组织(图5一个而且5 d)。．大部分愈伤组织在培养1个月后开始诱导辣椒仕达屋优先计划．这在表1．

图1:整个植物之间的形态一)c .建立而且b)c . frutescens在BA学习2个月后。

图2:叶片形态一)C.年度及b)C. frutescens在BA培养2个月后。

图3:茎的形态一)C.年度及b)C. frutescens在BA培养2个月后。

图4:根系形态一)c .建立而且b)c . frutescens在BA学习2个月后。

图5:愈伤组织形成2个月后直接形态发生c .建立一)缺席b)温和的c)丰富,c . frutescensD)缺席e)适度f)丰富。

物种名单。	BA(毫克/升)	日愈伤组织诱导	愈伤组织诱导率
*c .建立*	控制０．２５ 0．5 1 1．5 2	- - - 38 30. 28	- - - + + ++
*c . frutescens*	控制０．２５ 0．5 1 1．5 2	- - - - 30. 25	- - - - + +

*骨痂征象:(-)=无，(+)=中度，(++)=丰富

表1:辣椒直接形态发生过程中愈伤组织的形成。

实验结果表明，MS培养基中BA的存在对诱导芽的天数有一定的影响c .建立；但在诱导芽生过程中BA的存在c . frutescens没有显示出任何差异。使用1.5 mg/L (c .建立)和1.0 mg/L (c . frutescens) BA，有引起芽诱导的最早时间(图6)．但BA浓度增加到2.0 mg/L时，会导致芽诱导延迟。因此，进一步增加BA可能会逆转两者的芽诱导效率辣椒仕达屋优先计划．因此，BA在较低浓度时达到最佳浓度。BA的存在表现出显著的刺激作用细胞分裂毛状根诱导外植体与非转化外植体具有相似的性状[30.-33］．然而，与非转化子叶外植体相比，毛状根诱导的子叶外植体具有更快的芽诱导过程，这是因为毛状根的存在增强了矿物和激素吸收过程中的运输系统，促进了细胞的快速分裂。在本研究中，以形态发生率来测量再生植株的高度。结果表明，连续补充BA可使植株向株高正向再生(图7而且8)，与最近的情况相似辣椒植物研究[43-45］．在c .建立当BA浓度为1.5 mg/L时，2个月后以身高最高(6.01±0.24 cm)的形态发生率持续升高(图7)．BA浓度高时，植株高度增加c .建立而在2.0 mg/L BA浓度下进一步增加则会导致形态发生延迟(4.46±0.27 cm)。在c . frutescens当BA浓度较低(1.0 mg/L)时，其形态发生率最高，为9.2±0.28 cm (图8)．而BA浓度的进一步升高和降低则导致高度的降低。在前两周，形态发生c . frutescens在BA浓度为1.0、1.5、2.0 mg/L时，均以相似的速率出现，高度相对于5.29±0.26、5.44±0.46、5.01±0.24 cm，说明不同浓度的BA并没有促进早期形态发生过程。不同浓度的BA只在培养1个月后才使两个种的高度有显著差异。整体高度c . frutescens高于c .建立经过两个月的生长期，其中约有2-3厘米的差异。这是由于其他器官的快速形态发生，这是由分支和叶片的数量c .建立（表2） (图9)．在1.5 mg/L BA处理下，分枝和叶片数量较多，最适于形态发生c .建立．

图6:直接形态发生的芽诱导天数c . frutescens不同浓度BA处理2个月。

图7:不同浓度BA诱导毛状根外植体2个月直接形态发生的生长速率。

图8:毛状根诱导外植体直接形态发生的生长速率c . frutescens不同浓度BA处理2个月。

botanical-sciences-indirect-morphogenesis

图9:两者都难以间接形态发生辣椒a)愈伤组织c .建立b)绿色愈伤组织c .建立在8个星期a)的老茧c . frutescensb)绿色愈伤组织c . frutescens8周后。

BA(毫克/升)	不。的叶子	不。的分支	鲜重(克)
控制	1.95±0.89d	0.00±0.00e	0.25±0.05f
０．２５	3.75±0.91^c	0.00±0.00e	0.62±0.09e
0．5	5.45±0.89^b	1.75±0.91d	1.01±0.09d
1	5.15±0.75^b	2.70±0.80^c	1.14±0.08^c
1．5	9.65±0.93^一个	6.35±0.93^一个	1.68±0.12^一个
2	5.90±0.79^b	4.15±0.75^b	1.44±0.13^b

*相同上标字母的均值差异无统计学意义(P≤0.05)

表2:不同浓度BA对直接形态发生的影响c .建立两个月后。

不同浓度BA在再生过程中产生的枝条和叶片数量有极显著差异。与1.5 mg/L BA相比，无BA和低浓度BA (0.25 mg/L)显著影响叶片数量少和分枝少。而0.5 mg/L、1.0 mg/L和2.0 mg/L BA对叶片产量无显著差异，但在分枝数量上有差异。高的枝叶率影响了鲜重c .建立．尽管高度c . frutescens高于c .建立，但叶片和枝条的形态发生率相对较低(表3)．在c . frutescens无BA和低浓度BA(对照，0.25、0.5 mg/L)均未获得枝条再生。而BA的最佳水平(1.0 mg/L)大约只能再生1-2支枝条。的数量c . frutescensBA浓度为1.0 mg/L时，叶片呈增加趋势(10.45±0.76)。然而，随着1.5和2.0 mg/L BA浓度的增加，叶片数量减少。c . frutescens垂直顶端高度的形态发生率高于c .建立．然而,c .建立经过形态发生，集中在器官(水平)由高数量的树枝和叶子。因此，在BA的最佳水平(1.0 mg/L)下，两种植物的形态发生率相似c . frutescens为1.5 mg/Lc .建立)．由于毛状根诱导的子叶外植体，这两个种的形态发生率有相似之处。这些外植体不仅在形态发生过程中提供了支持，而且毛状根的存在能够促进营养物质的运输，这在对照处理中清楚地看到，也诱导了拔节。因此，利用毛状根外植体诱导答:rhizogenes具有较高的形态发生潜力，减少了植株发生顽抗的可能性。而BA作为芽诱导剂，由于形态发生过程中缺乏坏死和较低的愈伤组织形成，在毛状根外植体中表现出较高的适应性。坏死的存在表明细胞死亡可能是由于激素浓度过高或不相容而引起的毒性。每种植物激素都有不同的极性取向，它在细胞内的运动也可以描述它们与植物的相容性[46-48］．电池极性高度依赖于氢离子(H⁺)和钾离子(K⁺)，在膜质中，包括激素在内的营养物质运输得以维持。然而，细胞极性主要由所使用的外植体类型决定，在本例中为毛状根外植体[49］．因此，增加BA浓度成功地显示了毛状根诱导的子叶外植体极性的增加，从而导致毛状根的再生c . frutescens而且c .建立．然而，高浓度的BA高于最佳水平，使c . frutescens(1.0 mg/L)和c .建立(1.5mg/L)可引起细胞与激素之间的极性损失[49，50］．这些可以通过形态发生过程中大量的愈伤组织的形成(图3一而且3 b)，并在高度、叶数、枝条和鲜重方面降低形态发生率。因此，结果表明，最佳浓度BA与毛状根外植体组合对提高毛状根形态发生率具有较高的协同效应c . frutescens而且c .建立．

英航mg / L	不。的叶子	不。的分支	鲜重(克)
控制	2.75±0.97e	0.00±0.00^c	0.30±0.05e
０．２５	5.70±0.98d	0.00±0.00^c	0.53±0.17 d
0．5	7.90±0.72^公元前	0.00±0.00^c	0.92±0.22^c
1	10.45±0.76^一个	1.80±0.89^一个	1.63±0.19^一个
1．5	8.40±0.94^b	1.85±0.81^一个	1.36±0.26^b
2	7.35±0.99^c	0.85±0.98^b	1.23±0.44^b

表3:2个月后不同浓度BA对果形藤直接形态发生的影响。

结论

毛状根子叶外植体诱导答:rhizogenes两者都显示出直接形态发生的适宜性c .建立而且c . frutescens．在直接形态发生过程中，由于毛状根诱导外植体缺乏坏死和愈伤组织形成，BA激素与外植体组合具有较高的协同效应。由结果可知，BA的适宜水平为c .建立为1.5 mg/L，c . frutescens1.0 mg/L时，形态发生率最高。然而，两者的形态c .建立而且c . frutescens不受BA作用的影响。强烈建议进一步研究其他可能影响形态发生的因素，如光照、pH值、温度或其他类型的激素。

作者的贡献和利益冲突

NMS进行整体研究实验，参与研究的设计，进行统计分析，数据的获取和解释，并撰写稿件。NJS在研究研究的总体设计、协调研究实验和建议重要的智力内容方面做出了贡献。两位作者与任何可能的审稿人或同行审稿人都没有任何利益冲突。

确认

作者对马拉科技大学应用科学学院的研究设施表示感谢。

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